Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie

Hier presenteren we een robuust protocol voor de detectie van bacteriën in biopt blaasweefsel, dat brede toepassingen heeft voor vele weefseltypen waar bacteriën vermoedelijk aanwezig zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onbevooroordeeld is. Het stelt de onderzoeker in staat om bacteriën in weefsel te detecteren zonder a priori kennis van welke bacteriële soorten aanwezig is.

Deze techniek kan helpen om te bepalen of bacteriën zijn binnengedrongen de blaaswanden van vrouwen met terugkerende urineweginfectie en informeren therapeutische keuzes zoals de selectie van weefsel-doordringende antibiotica. Terwijl ontworpen voor blaasweefsels, deze techniek kan in grote lijnen worden toegepast op andere weefsels met een ingezeten bacteriële populaties met minimale optimalisatie. Personen die nieuw zijn op deze techniek kunnen worstelen met coverslip plaatsing en beeldvorming.

Focus op het optimaliseren van coverslip plaatsing om bellen te verminderen en de praktijk imaging op niet-kostbare monsters. Helpen om deze procedure aan te tonen zal Jashkaran Gadhvi, een afgestudeerde student in mijn lab. Om deze procedure te beginnen, reinig een lege rookkap of op de juiste wijze gemonteerd bioveiligheid kast met 70%ethanol.

Bereid alle benodigde buffers en reagentia voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens vijf Coplin potten schoon met 70% ethanol en laat de potten drogen. Wanneer de potten droog zijn, etiket ze zoals hier getoond en vul ze met 100 milliliter van de juiste oplossing.

In de rookkap, plaats twee dia's per biopsie in een verticale schuifrek. Plaats het verticale schuifrek gedurende 10 minuten in de Xylenes 1 Coplin pot. Verwijder hierna het schuifrek uit de pot en dep de bodem op een papieren handdoek om overtollige xylenen te verwijderen.

Plaats het rek 10 minuten in de Xylenes 2 pot. En dan rehydrateren de gedepareerde weefselsecties in opeenvolgende ethanol wast voor 10 minuten per stuk. Wanneer de wasbeurten zijn voltooid, dep de bodem van de schuifrek op papieren handdoeken om overtollige ethanol te verwijderen en plaats het rek in de Coplin pot met 100 milliliter filter gesteriliseerd, dubbel gedestilleerd water gedurende 10 minuten.

Verdun tijdens deze wasbeurt de sondes tot 10 nanomolar in hybridisatiebuffer om de kleuroplossing te creëren, om ervoor te zorgen dat 150 microliters kleuroplossing per dia wordt voorbereid. Bereid een bevochtigingskamer voor elke sonde door een doorweekte, verfrommelde delicate taakdoek en steriel water toe te voegen aan een reservoir van een P1000-tipbox. Plaats de tip houder cartridge op de top als dit is waar de dia's zal zitten.

Wanneer de laatste wasbeurt is voltooid, verwijder de glijbaan van het schuifrek en leg ze op een verse papieren handdoek, weefsel-kant omhoog. Gebruik een delicate taak af te vegen om de dia te drogen, voorzichtig om alleen voorzichtig deppen in de buurt, maar niet op de biopsie sectie weg te voeren het water. Met behulp van een hydrofobe pen, teken een rand rond de biopsie sectie en plaats de dia weefsel kant in de bevochtiging kamer.

Plaats vervolgens de bevochtigingskamer in een couveuse die is ingesteld op 50 graden Celsius. Pipet tussen 50 en 150 microliter van de kleuroplossing direct bovenop het weefsel, zodat de rechthoek die door de hydrofobe rand rond het weefsel wordt gemaakt, wordt gevuld en sluit de doos voorzichtig. Incubeer 's nachts bij 50 graden Celsius in het donker.

Als de incubator een raam heeft, bedek het wit aluminiumfolie om een donkere omgeving te creëren. De volgende ochtend, verwijder de dia's uit de bevochtigende kamers en snel afvoer weg elke resterende hybridisatie oplossing met een delicate taak veeg. Plaats vervolgens de zijkanten in een verticaal kleurrek.

Plaats de kleuring rek in een aluminiumfolie verpakt Coplin pot met 100 milliliter van de voorverwarmde wasbuffer gedurende 10 minuten. Herhaal deze wasstap nog twee keer met verse wasbuffer in nieuwe Coplin potten. Bereid tijdens deze wasstappen de tegenvlek door een voorraadoplossing van Hoechst 33342 in wasbuffer te verdunnen, met een verhouding van 1 tot 1000.

Voeg aan dezelfde buis Alexa-555 tarwekiemagglutinine toe aan een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per milliliter en Alexa-555 Phalloidin aan een uiteindelijke concentratie van 33 nanomolar. Bewaar in het donker tot het klaar is voor gebruik. Wanneer de laatste wasbeurt is voltooid, verwijder de glijbanen uit de Coplin pot en voorzichtig afvoer elke overtollige wasbuffer met een delicate taak veeg.

Leg de glijbanen weefsel-kant op een papieren handdoek en voeg tussen de 50 en 150 microliter van contra-vlek direct op de top van het weefsel, zodat de hydrofobe rand is gevuld, maar niet overvol. Bedek maximaal vier dia's met een cryobox-top en broed gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats hierna de glijbanen terug in het kleurrek en was ze nog twee keer in Coplin-potten met verse wasbuffer, waarbij elke was gedurende 10 minuten duurt.

Droog vervolgens de glijbanen grondig en leg ze weefsel-kant op een papieren handdoek onder een cryobox-top. Knijp een druppel montagemedia direct op het weefsel en plaats er voorzichtig een passende afdekking op. Druk voorzichtig alle bubbels uit en laat de coverslip dia's te genezen 's nachts in het donker.

De volgende dag, sluit de randen van de coverslips aan de glijbaan met een lichte laag van duidelijke nagellak en laat drogen in het donker voor 10 minuten, voordat ze op te slaan in het donker op vier graden Celsius. Wanneer klaar om de gekleurde biopten beeld, zet de confocale microscoop en de software in verband met de microscoop. Begin met een FISH-positieve dia en schakel over naar de computervisualisatiemodus.

Selecteer de kanalen voor 405, 488 en 555. Stel het gaatje in met behulp van het langste golflengtekanaal, dat in dit geval 555 is. Zoek dan het huidige brandpuntsvlak voor visualisatie van gelabelde bacteriën in het 488-kanaal.

Zonder het brandpuntsvlak te veranderen, stelt u de versterking, laserkracht en offset voor elk kanaal in, zodat het signaal niet verzadigd is en de achtergrond niet overgecorrigeerd is. Verwerf de afbeelding in alle drie de kanalen. In deze studie, weefsel geassocieerde bacteriën worden gedetecteerd in de menselijke blaas biopten door 16S rRNA FISH.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de onbevooroordeelde detectie van bacteriën geassocieerd met het blaasslijmvlies in paraffine-embedded blaas biopsie secties. Hier zijn representatieve confocale micrografen van een experiment met behulp van dit protocol op delen van blaas biopten verkregen van vrouwen met terugkerende urineweginfecties. Twee seriële secties zijn gehybridiseerd met ofwel de universele 16S rRNA of scramble probes.

Beelden ar genomen uit hetzelfde gebied van het weefsel en bacteriën zijn schoon zichtbaar in het weefsel gehybridiseerd met de 16S rRNA sondes, maar zijn niet met de scramble sonde. Fout-positieve resultaten zijn ook mogelijk. In deze representatieve false positive wordt een signaal gedetecteerd dat overeenkomt met autofluorescent collageen of elastine in de 405 en 488 kanalen in zowel de 16S rRNA als scramble probe hybridized biopsie secties, waarbij het belang van altijd gebruik wordt gemaakt van een scramble probe control.

Om te voorkomen dat foto-bleken, minimaliseren blootstelling van weefsel aan licht na sondes worden toegepast. Hoewel deze techniek zorgt voor de onbevooroordeelde detectie van bacteriën in menselijke weefsels, geeft het geen soortspecifieke informatie. Multiplex-FISH met taxonomie specifieke sondes kunnen worden gebruikt om het geslacht of de aanwezige soorten te identificeren.

Voordat deze techniek werd ontwikkeld, was niet eerder aangetoond dat bacteriën de blaaswand van menselijke terugkerende UTI-patiënten konden binnenduiten. We gebruiken nu geslacht en soortspecifieke sondes om te bepalen welke bacteriesoorten aanwezig zijn. Xylenen moet worden gebruikt in een rookkap vanwege hun toxiciteit.

Zorg moet worden genomen om niet direct te kijken in de laser tijdens de beeldvorming. De laser moet worden uitgeschakeld tijdens het positioneren van uw dia onder het doel.