A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)
30 april 2020
We beschrijven een tuberculose moleculaire bacteriële load test uitgevoerd na warmte-inactivatie van sputum. Warmteinactivatie maakt sputummonsters niet-besmettelijk en voorkomt de noodzaak van containmentniveau 3-laboratoria voor moleculaire tests op tuberculose.
Deze tuberculose moleculaire bacteriële test, beantwoordt drie belangrijke vragen. Een: Wat is de omvang van de ziekte van de patiënt last? Twee: Hoe reageert de patiëntenziektelast op de antituberculosemedicatie?
En drie: Wat is de relatie tussen ziektelast en behandelingsrespons? Deze test levert een kwantitatief resultaat op van de tuberculoselast van de patiënt en meet hoe deze last in korte tijd verandert met de behandeling. Met modificatie kan deze methode worden toegepast op andere bacteriële pathogenen.
We hebben al soortgelijke technologie ontwikkeld voor de diagnose van niet-tuberculeuze mycobacteriën, en bacteriën geassocieerd met chronische obstructieve longziekte. Bekijk bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer de video en oefen de stappen. Het is erg belangrijk om te oefenen met monsters die niet nodig zijn voor diagnostische resultaten van de patiënt.
Visuele demonstratie is van cruciaal belang omdat het het leren en beheersen van stappen vereenvoudigt, met name die delen van de methode die moeilijk uit te leggen zijn in tekst. Begin met het voorbereiden van de celculturen. Op een schone lab bank of klasse een cabine, oogst een milliliter aliquots van exponentiële fase Bacille Calmette-Guerin of BCG cultuur in 15 milliliter plastic buizen en sluit ze nauw.
Bij het voorbereiden van de sputummonsters van de patiënt, werk in een goed geventileerde ruimte en volg de richtlijnen in GL One Stop TB handboek. Open voorzichtig het exemplaar beker en pipet een milliliter aliquots in 15 milliliter plastic centrifuge buizen. Sluit vervolgens de buizen goed.
Breng de monsterbuizen over op een houdrek ondergedompeld in een waterbad dat tot 95 graden Celsius wordt voorverwarmd, zodat 3/4 van elke buis wordt ondergedompeld. Kook de monsters gedurende 20 minuten. Breng de buizen vervolgens naar de bank om vijf minuten op kamertemperatuur af te koelen.
Voer RNA extractie in een rookkap uit als u een kit met fenolchloroform of tumorkapitaal ethanol gebruikt. De RNA-procedure die hier wordt geïllustreerd, is de fenolchloroforme extractieprocedure. Er kunnen echter ook alternatieve methoden voor RNA-extractie worden gebruikt.
Breng een milliliter aliquots van de warmte geïnactiveerd monster naar 1,5 milliliter buizen en spike 100 microliter van extractie controle in elk monster. Sluit de buizen en meng ze door drie keer om te keren. Centrifugeren de buizen op 20.000 keer g gedurende 10 minuten.
Dan, aspirate de supernatant, waardoor 50 microliter sediment. We schorten het sediment op in 950 microliters lysebuffer door pipetten en brengen de hele suspensie over in de lyserende matrixbuizen die bij de RNA-extractiekit worden geleverd. Sluit de buizen goed en zorg ervoor dat ze op zowel het deksel als de zijkant zijn gelabeld.
Homogenize de monsters vervolgens gedurende 40 seconden bij 6.000 rpm. Centrifuge het lysaat op 12.000 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen verse een milliliter buizen, en voeg 300 microliter van chloroform.
Gebruik een pipet van één milliliter om de supernatant zorgvuldig aan te halen zonder de lysingmatrix aan te raken en deze met de chloroform naar de buis over te brengen. Vortex de buizen voor vijf seconden en laat ze te regelen voor vijf minuten of tot drie fasen duidelijk zichtbaar zijn. Centrifugeren de buizen op 12.000 keer g gedurende vijf minuten.
Dan, voorzichtig pipette de bovenste fase en breng het naar een 1,5 milliliter buis. Voeg 500 microliter ijs 100% ethanol toe aan het monster, sluit de buis en keer het drie keer om te mengen. Incubeer de buizen op min 80 graden Celsius gedurende 15 minuten of bij min 20 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Laad vervolgens de buizen in een voorgekoelde microcentrifuge en centrifuge gedurende 20 minuten bij 13, 000 keer g en vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg, voeg 500 microliter van 70% ijskoude ethanol toe en centrifuge nog 10 minuten op 13.000 keer g. Gooi alle supernatant weg.
En incubeer de buizen op 50 graden Celsius gedurende 20 minuten om de nucleïnezuur pellet te drogen, ervoor te zorgen dat de buizen gedeeltelijk open te houden om verdamping van ethanol mogelijk te maken. Voeg vervolgens 100 microliters kernvrij water toe aan de pellet en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Vortex het monster voor drie seconden en ga verder met de DNA-verwijdering of bewaar het op min 80 graden Celsius tot klaar voor gebruik.
Bereid DNA's een mix volgens het manuscript richtingen en pipet 11 microliters in elke buis met RNA extract. Vortex gedurende drie seconden en spin kort naar beneden om eventuele druppels te verwijderen uit de wand van de buis. Vervolgens, incubeer de buis op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten in het hete blok of incubator.
Voeg na de incubatie een extra microliter dna-enzym direct aan de buis toe en meng goed door te vortexen. Dan, incubeer de buizen voor nog eens 30 minuten op 37 graden Celsius. Ontdooi en vortex het DNA's inactivatie reagens.
Voeg vervolgens 10 microliter toe aan elk RNA-extract. En de buizen vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Vortex de buizen drie keer tijdens de incubatiestap.
Vercentrifugeer het mengsel vervolgens twee minuten op 13.000 keer g en breng de supernatant voorzichtig over naar de vrije buis van een 1,5 milliliter RNA, zodat u geen van de inactivatiematrix raakt. Verdun alle onbekende RNA monsters een tot 10 in gratis water RNA's dan, meng ze door vortexing voor vijf seconden en kort spinnen ze naar beneden. Dooi MTB- en EC-RNA-monsters en om respectievelijk zeven- en zesvoudige verdunningen te maken voor een standaardcurve.
Bereid RT plus en RT minus PCR master mixen volgens het manuscript richtingen. Vortex de RT plus mix en overdracht 16 microliters in elke RT plus PCR buis. Vervolgens, vortex de RT minus mix en voeg 16 microliters in elke RT minus PCR buis.
Voeg vier microliters RNA-extract of -water toe en dupliceer aan de RT plus-buizen. Het water is de niet-sjabloon controle of NTC. Voeg vier microliters RNA-extract of water toe aan de RT-minbuizen.
Laad de reactiebuizen in de real-time PCR-machine, programmeer de reactie zoals beschreven in het manuscript en voer de reactie uit. Om de behandelingsrespons te interpreteren, gebruikt u de standaardcurve om CQ-waarden om te zetten in bacteriële belasting en de respons te berekenen als de verandering in bacteriële belasting tijdens de follow-upperiode van de behandeling. De daling van de bacteriële belasting na de behandeling betekent een positieve reactie, terwijl geen verandering of stijging van de bacteriële belasting impliceert een negatieve reactie.
Om te controleren of alle M.tuberculosis bacilli hitte geïnactiveerd waren, werd de optische dichtheid van de cellen gemeten en vergeleken met die van levende cellen. Er werd geen verandering in OD in de loop van de tijd waargenomen voor de warmte-geïnactiveerde monsters die geen groei aangeven. Warmte geïnactiveerde monsters werden geïncubeerd bij 37 graden Celsius om te bepalen of RNA degradeert na warmte-inactivatie van cellen.
Er werd geen verschil gevonden tussen het RNA dat onmiddellijk na warmte-inactivatie werd geoogst, en het RNA isoleerde één, twee, drie en vier dagen later in zowel BCG-culturen als tbc-positief sputum. Wanneer het A-enzym van RNA exogeen aan de monsters werd toegevoegd, voor en na warmte-inactivering, trad het RNA-verlies op in alle warmtegeactiveerde monsters gedurende vier dagen incubatie. Het effect van warmte-inactivatie op ribosomale RNA werd gemeten in BCG-culturen en sputum van tbc-positieve patiënten.
De gemeten bacteriële belasting van de controlecultuur was hoger dan de gecombineerde bacteriële belasting van warmte geïnactiveerde cultuur bij 80 graden Celsius, 85 graden Celsius en 95 graden Celsius voor zowel BCG- als sputummonsters. Warmte-inactivering van de monsters veroorzaakt minimaal verlies van RNA, waardoor voldoende RNA overblijft voor downstream TB-MBLA en andere downstream moleculaire tests. Transmission Electron Microscopy werd gebruikt om te onderzoeken of cellen door warmte-inactivatie werden gelysed.
Inspectie van de cellen bij lagere en hogere vergroting bracht de intacte celwanden en de zichtbare intracellulaire lipidelichamen aan het licht. De cellen leken langwerpig, maar niet lysed. Bij het proberen van deze procedure, is het van cruciaal belang om te onthouden om de extractie controle toe te voegen, die controleert voor eventuele valse negatieve resultaten als gevolg van slechte RNA extractie.
Deze aanpak kan worden toegepast op bacteriën geassocieerd met chronische obstructieve longziekte, niet-tuberculeuze mycobacteriën infectie, en andere ademhalingspathogenen. De kwantitatieve resultaten van TB-MBLA hebben wiskundige en farmaco-modellering mogelijk gemaakt van hoe patiënten reageren op een tuberculosetherapie. We kijken uit naar de toepassing van de techniek in de routinezorg waar tuberculosepatiënten worden beheerd.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een moleculaire assay voor de bacteriële last bij tuberculose, die wordt uitgevoerd na hitte-inactivatie van sputummonsters. Deze methode maakt de monsters niet-infectieus, waardoor veiliger testen mogelijk is zonder dat hiervoor laboratoria met een hoog containment-niveau nodig zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Infectieziekten
- Diagnostische methoden
Achtergrond
- Tuberculose is een aanzienlijk mondiaal gezondheidsprobleem.
- Een nauwkeurige meting van de bacteriële load is cruciaal voor de monitoring van de behandeling.
- Traditionele methoden vereisen een hoog inperkingsniveau vanwege de infectieuze monsters.
- Hitte-inactivatie biedt een veiliger alternatief voor de verwerking van monsters.
Doel van de studie
- Om een veilige en effectieve assay te ontwikkelen voor het meten van de bacteriële load van tuberculose.
- Om de ziektelast en de behandelrespons van de patiënt te evalueren.
- Om een methodologie te bieden die toepasbaar is op andere bacteriële pathogenen.
Gebruikte methoden
- Hitte-inactivatie van sputummonsters bij 95 °C.
- RNA-extractie met gebruik van fenol-chloroform of alternatieve methoden.
- Real-time PCR voor het kwantificeren van de bacteriële load.
- Voorbereiding van een standaardcurve voor een nauwkeurige meting.
Belangrijkste resultaten
- De assay biedt kwantitatieve resultaten van de tuberculosebelasting.
- Het meet effectief veranderingen in de bacteriële load tijdens de behandeling.
- De methodologie kan worden aangepast voor andere bacteriële infecties.
- Visuele demonstraties verbeteren het leerproces en de beheersing van de techniek.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een veilig alternatief voor het testen op tuberculose.
- Het maakt een effectieve monitoring van de behandelrespons mogelijk.
- Er is potentieel voor een bredere toepassing bij het diagnosticeren van andere bacteriële pathogenen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De TB-MBLA biedt een kwantitatieve, op RT-qPCR gebaseerde methode om de bacillaire load van Mycobacterium tuberculosis in sputummonsters te meten, wat een objectieve beoordeling van de ziektelast en de respons op de behandeling mogelijk maakt. Door de integratie van hitte-inactivering maakt de assay een veilige hantering van infectieuze monsters buiten faciliteiten met een hoog inperkingsniveau mogelijk, wat een bredere inzet in discovery- en translationeel onderzoek ondersteunt. Deze capaciteit ondersteunt de targetvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontwikkeling van anti-infectieve geneesmiddelen door reproduceerbare, kwantificeerbare biomarkers van de pathogene load te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen in de bacteriële load te kwantificeren als een directe read-out van target-engagement en drugseffectiviteit.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare meting van de pathogenenlast die go/no-go-beslissingen bij lead-optimalisatie ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (eCFU/mL) via Cq-waarden en standaardcurven, wat dosis-responsvariabelen en tijdskursanalyses bij antimicrobiële screening mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Levert schaalbare, high-throughput-compatibele resultaten na RNA-extractie en RT-qPCR, wat bijdraagt aan de standaardisatie van assays over verschillende verbindingenbibliotheken heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelateerde systemen door de bacteriële lading in klinisch relevante matrices (sputum) te meten, waardoor in vitro bevindingen worden gekoppeld aan ex vivo pathogeendynamiek.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door een consistente biomarker van behandelingsrespons over verschillende studiefasen te bieden.
Integratie van pipeline en workflow
De TB-MBLA past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot preklinische evaluatie van de werkzaamheid, waarbij de kwantitatieve pathogene load dient als mechanische brug tussen blootstelling aan de verbinding en het biologische resultaat.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de bacteriële load te meten als een functionele readout van anti-tuberculose-activiteit.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde RNA-extractie en RT-qPCR-workflows die kwantitatieve, reproduceerbare resultaten opleveren voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert Cq-waarden en op standaardcurven gebaseerde eCFU/mL-metingen die vergelijking tussen condities en statistische analyse vanbehandelingseffecten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Versterkt de preklinische continuïteit door gebruik te maken van sputum-afgeleide monsters om een klinisch relevante bacteriële burden te weerspiegelen, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een herbruikbare capaciteit voor het kwantificeren van de bacteriële load over verschillende pathogenen heen, met aangetoonde toepasbaarheid op niet-tuberculose-mycobacteriën en COPD-geassocieerde bacteriën.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie via een kwantitatieve, mechanistisch gekoppelde biomarker voor bacteriële belasting.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via hitte-inactivatie, gestandaardiseerde RNA-extractie en RT-qPCR met interne extractiecontroles.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege, op gegevens gebaseerde go/no-go-beslissingen mogelijk te maken op basis van meetbare veranderingen in de pathogenale belasting.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door een translationele biomarker te leveren die correleert met de behandelingsrespons in zowel de ontdekkingsfase als de preklinische fasen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biosafety, RNA-handling en RT-qPCR-workflows voor het beheren van hitte-inactivatie- en extractiestappen.
- Afhankelijk van toegang tot real-time PCR-instrumentatie, koude opslag voor reagentia en biosafety-conforme laboratoriumruimtes voor de initiële monsterverwerking.
- Vereist cross-team standaardisatie van RNA-extractie en het gebruik van inhibitiecontroles om consistente resultaten tussen verschillende locaties te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de assay op verschillende monstertypen of bacteriële pathogenen buiten Mtb.
- Bevat praktische beperkingen, zoals <60% log10 eCFU/mL RNA-verlies door lysis geïnduceerd door hitte-inactivatie, wat de gevoeligheid bij monsters met een lage burden kan beïnvloeden.
