Met behulp van Tg (Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryo's om de oestrogene effecten van endocriene verstorende verbindingen te testen

Er is een groot aantal EDC chemicaliën in ons milieu, voornamelijk oestrogene stoffen. De chemische diversiteit van de stoffen die tot de groep behoren, maakt het testen ervan moeilijk, omdat er verschillende methoden nodig zijn voor de detectie ervan. Op basis van de chemische structuur, het is echt moeilijk om te bepalen of een stof daadwerkelijk in staat is om te werken als een oestrogeen.

Bovendien zijn deze stoffen nooit aanwezig in een zuivere vorm in het milieu, dus de effecten ervan kunnen ook worden beïnvloed door andere verbindingen. Dit probleem wordt opgelost door effect dialecting methoden zoals het gebruik van biomonitor, bio-indicator organismen die oestrogeen effect tonen. Het is bekend dat bepaalde genen gevoelig reageren op oestrogeen in levende organismen.

De detectie van genproducten met moleculaire methoden is ook mogelijk op eiwit- of mRNA-niveau, maar gaat meestal gepaard met dierenoffers. De wetgeving inzake dierenbescherming is strenger geworden en er is een groeiende vraag naar alternatieve testsystemen. Cross-genetische technologieën vertegenwoordigen de mogelijkheid met deze ontwikkeling en met de ontdekking van fluorescerende eiwitten, de weg voor de oprichting van biomarker zijn geplaveid.

Door de hulp van een dergelijke activering van oestrogeen gevoelige genen kunnen worden getest in vivo. In deze video wordt een mogelijke methode voor het gebruik van vtg:1mCherry transgene zebravis embryo's getoond voor het testen van oestrogene stoffen met behulp van twee verbindingen. Het protocol kan dienen als achtergrond voor het bestuderen van het oestrogeeneffect van verschillende chemische of milieumonsters op biomarkerembryo's.

De zebravis lijn gebruikt in onze experimenten is een vitellogenin verslaggever transgene zebravis lijn. De lijn is gemaakt met behulp van het Tol2 Transposon systeem. De transgene constructie die voor de ontwikkeling wordt gebruikt droeg de lange natuurlijke vitellogenin-1 promotoropeenvolging, met een hoog aantal ERI kanten.

De uitdrukking van het fluorescerende signaal bij de seksueel volwassen vrouw is continu. Bij mannen in embryo's komt het echter alleen voor door de werking of aanwezigheid van oestrogene stoffen, zodat deze meer geschikt zijn om te worden getest. De gevoeligheid en bruikbaarheid van de embryo's van de lijn zijn getest op verschillende oestrogene verbindingen en op milieumonsters.

Alle experimenten met levende dieren werden uitgevoerd volgens de Hongaarse wet op het dierenwelzijn en alle studies werden voltooid voordat de dieren het vrije voerstadium bereikten. Vul de parentanks met systeemwater en zet de vis voor het paren van de voor het oogsten van eieren. Plaats mannelijke en vrouwelijke vissen in de tank, en scheid ze met behulp van een verdeler.

Verwijder de scheidingswand uit de tanks als het licht de volgende ochtend aan gaat. Controleer de paringstanks op eieren om de 15 tot 20 minuten. Oogst alle embryo's met behulp van een theezeef, of dicht geweven, fijn gaas, en combineer ze in een grote petrischaal met E3 buffer, of helder systeemwater.

Plaats de embryo's in de couveuses ingesteld op 25,5 graden Celsius. Een tot anderhalf uur na, verwijderen en weggooien onbevruchte, of onvoldoende verdeeld eieren met een plastic overdracht pipet onder een ontleden microscoop. Plaats de geselecteerde embryo's in de behandelingsvaten, bijvoorbeeld in petrischaaltjes of weefselkweekplaten, die al zijn gelabeld en gevuld met verschillende concentraties van de teststof.

Broed de embryo's tot het einde van het experiment op 25,5 graden Celsius. Vernieuw de testoplossing indien nodig om de behandelingsconcentratie te behouden. Wees voorzichtig bij het veranderen van de testoplossing, om te voorkomen dat de embryo's beschadigd worden.

Bereid vier procent methoseladose met ms 222 vooraf. Plaats de vijf dagen oude larven in een petrischaaltje van vijf centimeter per behandelingsgroep met een plastic pipet. Verwijder de behandelingsoplossing van de larven met een plastic pipet en vul de petrischaal met twee milliliter van 0,02 procent ms 222 verdovingsoplossing.

Vul elk vierkant van een speciaal ontworpen petrischaaltje van 10 centimeter met vier procent methoseladose ms 222. Breng de verdoofde larven over naar de methoseladose met een beetje water in een van de twee vierkanten. Vanaf het eerste vierkant, breng de larven in het tweede vierkant.

In het tweede vierkant, draaien en oriënteren larven aan hun linkerkant en druk ze zachtjes naar de bodem van de met een microloader pipet tip gesneden tot twee centimeter. Om het signaal van de uitgedrukte verslaggever te evalueren, beeld de embryo's in dezelfde weergave en instellingen. Plaats de petrischaal op het podium van de microscoop.

Focus op de lever van het embryo en leg een helder veldbeeld vast met behulp van de bijbehorende software. Schakel de microscoop naar de mCherry filter, en neem een fluorescerend beeld van de lever onder tl-licht met behulp van de bijbehorende software. Herhaal de vorige twee stappen totdat u alle embryo's in het experiment hebt gevangen.

Open ImageJ en upload vervolgens de fluorescerende afbeelding die moet worden geanalyseerd door de afbeelding te slepen en te laten vallen of op Bestand openen te klikken. Klik op Afbeelding, Kleur, Gesplitste kanalen om de afbeelding gemaakt door het fluorescerende filter te splitsen op basis van de RGB-kleurendiagram. Werk met het rode kanaalbeeldspectrum.

Sluit de andere kanalen. Wijs een elliptisch gebied van vergelijkbare grootte in het beeld aan, zodat volledige signalen de evaluatie niet verstoren. Met behulp van de ovale gereedschappen trekken een ellips over het gemarkeerde levergebied zo nauwkeurig mogelijk.

Als het signaal zwak is, gebruik dan lichte microspic beelden, het heldere veldpaar van het tl-beeld, om de locatie van de lever te bepalen. Klik op Analyseren, Meten, om de signaalsterkte en de grootte van het getroffen gebied te bepalen. De geïntegreerde dichtheidswaarde wordt automatisch berekend door de softwarekolom in de grafiek.

Zet de analyse voort door de vorige stappen te herhalen totdat u alle fluorescentiebeelden van alle embryo's in de behandelingsgroep analyseert. Sla de gegevens op en analyseer vervolgens de geïntegreerde dichtheidswaarden. In het experiment werden oestrogeengevoelige embryo's van de biomarker zebravislijn behandeld met 0,5 en acht micromoleconcentraties van alfa- en bèta-Zearalenol, of ZOL, voor bevruchting tot de leeftijd van vijf dagen.

We onderzochten of er fluorescerende signalen in de lever van de vis verschijnen aan het einde van het experiment als gevolg van stoffen, en of er verschillen zijn in de oestrogeenheid van de twee stoffen. De resultaten werden geëvalueerd op basis van fluorescerende beelden en geïntegreerde dichtheidswaarden. In het geval van alfa-ZOL, bij de hoogste testconcentratie, stierven alle individuen.

Dus in dit geval kon het fluorescerende signaal niet worden onderzocht. Bij lagere concentraties kan een sterk fluorescerend signaal worden waargenomen in de lever van het embryo. Zonder significant verschil in de sterkte van fluorescerend signaal en de grootte van verlichte gebieden.

Er was ook geen significant verschil tussen de geïntegreerde dichtheidswaarden en de behandelingen. Er was geen sterfte tijdens de behandeling met bèta-ZOL. De stof veroorzaakte transgene activiteit in alle behandelingsconcentraties.

De toename van fluorescerende signaalintensiteit, en de grootte van het verlichte gebied kan worden waargenomen in de fluorescentie beelden als de concentratie toeneemt. Door de geïntegreerde waarden van bèta-ZOL te onderzoeken, kan deze verandering ook worden ontdekt. De gemiddelde geïntegreerde dichtheidswaarde verdubbelt bijna tussen de laagste en de hoogste behandelingsconcentraties.

In het geval van bèta-ZOL vonden we echter geen significant verschil tussen de geïntegreerde dichtheidswaarden van individuele concentraties. Door de geïntegreerde dichtheidswaarden te onderzoeken die uit dezelfde behandelingsconcentraties van de twee stoffen zijn verkregen, kan worden gezegd dat alfa-ZOL in elk geval hogere geïntegreerde dichtheidsgemiddelden gaf ten opzichte van bèta-ZOL, wat overeenkomt met de verschillen tussen de signaalsterkte die in fluorescerende beelden wordt waargenomen. Deze verschillen met significante bij alle concentraties.

Het gebruik van bio-indicatoren voor oestrogeen effecten is verspreid in toxicologische studies. Verschillende transgene lijnen met oestrogeen effecten zijn ook geproduceerd uit zebravissen, waarvan vtg:1mCherry werd gebruikt in onze studies. De hier beschreven methode illustreert een mogelijk protocol voor het testen van embryo's van deze lijn, om in vivo detectie van oestrogeenactiviteit in het geval van zuivere middelen mogelijk te maken.

Het is belangrijk te vermelden dat in het geval van embryo's bij het ontwerpen van experimenten rekening moet worden gehouden met de expressie van het transgeen, net als bij de productie van endogene vitellogenine, en dat bij het ontwerpen van experimenten rekening moet worden gehouden met verschillen in individuele gevoeligheid. Een belangrijk aspect bij het bepalen van de behandelingsconcentraties is dat cellen van embryo's, waaronder levercellen, kunnen worden beschadigd door hogere concentraties van zeer giftige stoffen, wat kan leiden tot een afname van de vitellogenine-inductie. Daarom moeten tests worden uitgevoerd bij concentraties onder L-C 10.

Dit protocol kan op veel punten worden gewijzigd op basis van de geplande testeindpunten en in de monsters die getest gaan worden. Het kan worden aangevuld met andere testmethoden, bijvoorbeeld moleculaire methoden. Zo hopen we dat het gebruik van de vtg:1mCherry-lijn zal verschijnen als een model van oestrogeniteitstests en kan ook een model zijn voor gestandaardiseerde testmethoden.