Name: Cultuur van kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosa en Quantitatie van zijn Alginate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer de SCV-kweekmethode voor Pseudomonas aeruginosa en de ELISA-quantificatie van alginaat. Dit protocol biedt een veiliger en gevoeliger alternatief dan de standaard uronzuurcarbazolmethode.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R44GM1113545 en P20GM103434.

1. SCV groeiomstandigheden en fysiologische activering van de bergingsroute
<ol><li>Detectie van SCV.<ol>
<li>Streep de P. aeruginosa stammen PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581, en PAO581ΔpyrD op voorverwarmde Pseudomonas isolatie agar (PIA) platen en groeien bij 37 °C voor 48 uur. Op de groeiplaat wordt één kolonieisolaat je geïdentificeerd met het SCV-fenotype (koloniegrootte van 1−3 mm in tegenstelling tot de normale grootte van 3−5 mm kolonie).</li>
		<li>Herhaal stap 1.1.1 om een zuiver isolaat van de SCV te verkrijgen. OPMERKING: Groei kan tot 72 uur nodig zijn als gevolg van de trage groei van de SCV-kolonies.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fysiologische activering van het bergingstraject.<ol>
<li>Met behulp van een steriele inenting lus, kies de SCV kolonie van de PIA plaat en streep op een voorverwarmde PIA aangevuld met 0,1 mM uracil. Kweek plaat bij 37 °C gedurende 24−48 uur. OPMERKING: Alle PIA-platen die in dit protocol worden gebruikt, bevatten 20 mL/L glycerol toegevoegd aan het mengsel voordat ze autoclaven. Na autoclaven en na mengsel temperatuur is onder 55 °C voeg 11,21 mg/L uracil (0,1 mM) aan de vloeibare media voor het gieten van platen. Deze methode zou helpen bij het identificeren van pyrimidine mutaties die SCV fenotype veroorzaken in P. aeruginosa. Als het SCV fenotype het gevolg is van deze mutatie, dan zouden normale koloniegroei en grootte (3−5 mm) worden waargenomen op de uracil aangevulde PIA-platen. Als stammen de mogelijkheid hadden om alginaat te produceren, dan zal het slijmvlies fenotype ook terugkeren bij uracil suppletie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Uronic Acid Carbazole Assay
<ol><li>Van een zuivere cultuur van gewenste stam te testen, identificeren van een enkele kolonie. Met behulp van een steriele tandenstoker, kies de kolonie, en plaats de tandenstoker in een cultuur reageerbuis met 5 mL pseudomonas isolatie bouillon (PIB). Groei in een shaker incubator bij 37 °C gedurende 24 uur. OPMERKING: De volgende stammen PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, en PAO581pyrD werden geteeld op PIA platen of PIA platen aangevuld met 0,1 mM uracil te oogsten alginaat voor meting.</li>
	<li>Voeg op een voorverwarmde PIA-plaat 150 μL gekweekte PIB-bouillon (voor 15 mm x 100 mm platen) of 450 μL bouillon (voor 15 mm x 150 mm platen) toe. Met behulp van een steriele celverspreider, verspreid de bouillon over de plaat. Laat de plaat 24 uur groeien op 37 °C. LET OP: Aanzuigen overtollige vloeistof, indien aanwezig, van de plaat met behulp van een pipet door het kantelen van de plaat aan de ene kant. Zowel PIB- als PIA-platen die in het protocol worden gebruikt, bevatten 20 mL/L glycerol die door cellen als koolstofbron moet worden gebruikt om te helpen bij de productie van alginaat.</li>
	<li>Met behulp van een pipet controller en een steriele 50 mL pipet, voeg 0,85% NaCl aan het gazon geteeld en monster te verzamelen door het slopen van de plaat met behulp van een cel spreader. Zuig het monster aan met een verse 50 mL pipet in een 50 mL-inzamelbuis. Vortex het monster op hoog te mengen en plaats de monsters op ijs. OPMERKING: Het volume van de toegevoegde 0,85% NaCl varieert afhankelijk van de grootte van de plaat. Gebruik voor platen van 15 mm x 100 mm 10−30 mL en gebruik voor platen van 15 mm x 150 mm 20−50 mL.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid op 600 nm (OD600) van de monsters door 1 mL van het monster toe te voegen aan een wegwerpcuvette en de OD te lezen met behulp van een spectrofotometer. Herhaal deze stap 2x om een drieling van leest voor elk monster te verkrijgen.</li>
	<li>Voeg 3 mL van de zwavelzuur/borate oplossing toe aan kweekbuizen en laat op ijs zitten. Voeg 350 μL van het verzamelde monster Langzaam aan de zure mix in de reageerbuizen en vortex op lage kort.<ol>
<li>Bereid borate voorraad door het toevoegen van 10.099 g kaliumhydroxide (KOH) poeder tot 45 mL water. Voeg 24,74 g boorzuur (H3BO3)toe aan het mengsel en breng het volume op 100 mL.</li>
		<li>Plaats 1 L fles in een gootsteen met ijs en vul fles met 500 mL geconcentreerd zwavelzuur. Voeg langzaam 15 mL van de bereide borate voorraad toe. Laat de fles afkoelen.</li>
		<li>Voeg nog eens 10 mL borate voorraad voor een totaal van 25 mL. Zodra de fles is afgekoeld, breng het volume op 1 L. LET OP: Deze methode is gebaseerd op het gebruik van sterk geconcentreerd zwavelzuur. Er moet een goede persoonlijke beschermingsuitrusting worden gebruikt om de veiligheid en het juiste verwijderingsprotocol van het monster te waarborgen. OPMERKING: Voor een positieve controle een bekende concentratie d-mannuronzuur en/of een bekende bacteriële alginaatmonsters geoogst en gezuiverd door middel van alginaat producerende stammen van P. aeruginosa (bijvoorbeeld: PAO581-PAO1mucA25). Voor een negatieve controle gebruik 0,85% NaCl oplossing en / of PAO1ΔalgD (In-frame schrapping van algD gen dat maakt de bacteriën volledig niet in staat om alginaat te produceren). Van elk monster kunnen meerdere buizen worden gemaakt om het aantal technische herhalingen te verhogen om te helpen bij statistische analyse. Bereid 3−5 buizen van elk monster.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg 100 μL van 0,1% carbazol in ethanoloplossing toe aan de zuur/monstermix. Sluit de buis en vortex af op medium stand voor 5 s. Plaats in een droog bad op 55 °C gedurende 30 min.</li>
	<li>Verwijder na incubatie de buizen en vortex kort op hoog en laat 5 min afkoelen. LET OP: Kleur te zien zou een schaduw van paars. Kleur blijft stabiel voor meting gedurende 1−2 uur.</li>
	<li>Lees de OD530 van elke buis door 1 mL van het mengsel toe te voegen aan een schone cuvette en de OD van de monsters op 530 nm te lezen op een spectrofotometer. Gebruik de buis met 0,85% NaCl als een blanco aan de spectrofotometer.</li>
	<li>Maak een standaardcurve voor door de OD530 van seriële verdunningen van bekende concentraties D-Mannuronzuur (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL en 8 μg/mL) te meten. Herhaal 2x. Haal een lineaire vergelijking uit deze metingen. LET OP: Standaardcurve hoeft maar één keer te worden uitgevoerd. De lineaire vergelijking die daaruit wordt gehaald, kan worden gebruikt voor latere tests.<ol>
<li>Bereken de concentratie van het alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600te verkrijgen .</li>
	</ol></li>
</ol>3. ELISA voor Alginate Quantitation
<ol><li>Herhaal stap 2.1−2.4 om monsters te verkrijgen voor alginaatmeting. OPMERKING: Gebruikte stammen waren PAO1, PAO1ΔalgDen PAO1 met pHERD20T-algU.</li>
	<li>Voeg met behulp van een micropipette 50 μL van het verzamelde monster toe aan een onbehandelde 96-putplaat. Voeg 50 μL coatingbuffer (carbonaat/bicarbonaatbuffer pH 9.6) toe aan de putten. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur. OPMERKING: Voor een positieve controle kan een bekende concentratie D-Mannuronzuur en/of een bekende stabiele alginaatworden gebruiken die stam produceert (bijvoorbeeld: PAO581-PAO1mucA25). Voor een negatieve controle gebruik 0,85% NaCl oplossing en / of PAO1ΔalgD (in-frame schrapping van algD gen maakt de bacteriën volledig niet in staat om een alginaat te produceren). Uit elke steekproef kunnen meerdere putten worden gemaakt om het aantal technische herhalingen te verhogen om te helpen bij statistische analyse. Bereid 3−5 putten van elk monster.</li>
	<li>Met behulp van een spuitfles, was de plaat putten 2x met 1x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween 20 (PBS-T) door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door het omdraaien van de plaat over.</li>
	<li>Met behulp van een micropipette voeg 200 μL van het blokkeren buffer (10% magere melk in PBS-T) aan de putten. Incubeer bij 4 °C 's nachts. LET OP: Wikkel plaat in paraffine film of krimpen wrap om te helpen voorkomen dat verdamping in de koelkast.</li>
	<li>Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 2x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.</li>
	<li>Met behulp van een micropipette voeg 100 μL verdund primair antilichaam (muis anti-alginaat monoklonale antilichaam) toe aan de putten en uitbroed bij 37 °C gedurende 1−2 uur. OPMERKING: Primair antilichaam (muisantialginaat monoklonale antilichaam) werd geleverd bij een concentratie van 0,5 μg/mL (verdunning van 1:2.000 van 1 mg/mL-voorraad) in antilichaamverdunningsoplossing (1% magere melk in 1x PBS).</li>
	<li>Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 3x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.</li>
	<li>Met behulp van een micropipette voeg 100 μL verdund secundair antilichaam toe aan de putten en uitbroed bij 37 °C gedurende 1−2 uur. OPMERKING: Secundair antilichaam gebruikt was pierce geit anti-muis poly-HRP antilichaam tot een concentratie van 0,25 μg/mL (verdunning van 1:2.000 van 0,5 mg/mL voorraad) in antilichaam verdunningoplossing.</li>
	<li>Met behulp van een spuitfles wassen de plaat putten 3x met PBS-T door het vullen van de putten, en vervolgens aftappen ze door flipping plaat over.</li>
	<li>Voeg met behulp van een micropipette 100 μL TMB-ELISA-oplossing(Tabel met materialen)toe en broed op kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker. LET OP: De kleur van een positieve reactie zou een schaduw van blauw.</li>
	<li>Voeg met behulp van een micropipette 100 μL stopoplossing (2 N zwavelzuur) toe. OPMERKING: De kleur wordt van blauw naar geel wanneer de stopoplossing wordt toegevoegd. Kleur is stabiel tot 30 min nadat de reactie is gestopt.</li>
	<li>Lees met behulp van een plaatlezer de OD op 450 nm.</li>
	<li>Produceer een standaardcurve door de OD450 van seriële verdunningen van bekende concentraties D-Mannuronzuur (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL en 8 μg/mL) te meten. Herhaal 2x. Uit deze metingen halen een lineaire vergelijking. LET OP: De standaardcurve hoeft maar één keer te worden uitgevoerd. De lineaire vergelijking die daaruit wordt gehaald, kan worden gebruikt voor latere tests.<ol>
<li>Bereken de concentratie van het alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600te verkrijgen .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Statistische analyse van alginaatmeting
<ol><li>Stel in een grafisch softwareblad een kolom in met de lineaire vergelijking die is afgeleid van de standaardcurve. Stel de y-asresultaten in als de alginaatconcentratie en de x-asresultaten als de OD530 voor uronic acid test en OD450 voor ELISA om de alginaatconcentraties in elk monster te verkrijgen.</li>
	<li>Om de hoeveelheid alginaat in elk monster te normaliseren tot het bedrag per 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600), de concentratie van elk monster dat hierboven is verkregen door de respectieve OD600-waarde, wordt verdeeld. Als voor elk monster meerdere OD600 werden gemeten, verdeel dan door de gemiddelde OD600.</li>
	<li>Statistische analyse uitvoeren met behulp van voorkeursstatistische software (bijvoorbeeld GraphPad Prism 7.02).</li>
	<li>Open de software. Kies Kolom onder Nieuwe tabel en grafiek en kies de eenrichtingsanova-gegevensset.</li>
	<li>Noem elke kolom met de geteste stam en voeg de alginaatconcentraties eronder toe.</li>
	<li>Klik na het invoeren van alle gegevens op Analyseren in het bovenste menu. Hiermee wordt een venster voor analyse-instellingen geopend. Kies de juiste parameters voor het testen en geef aan of er meerdere vergelijkingen moeten worden uitgevoerd. OPMERKING: Na analyse bevat de gegevensset een p-waarde die de statistische significantie van de gegevens kan bepalen. Gegevens zouden statistisch significant worden geacht als de p-waarde lager is dan de ingestelde α-waarde (normaal gesproken wordt α-waarde ingesteld voor p < 0,01).</li>
	<li>Kies onder het grafiektabblad het type Staafgrafiek. Hiermee worden de gegevens automatisch in kaart gebracht met de aangegeven titel uit het invoergegevensblad. Geef de statistische significantie van de gegevens aan als dat nodig is door het * symbool boven de verbindingslijnen tussen de balken van belang weer te geven.</li>
</ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li>
<li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li>
<li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li>
<li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Insights%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance%2C+are+hyper-inflammatory%2C+and+persist+in+multiple+host+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogones%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842(2018).</li>
<li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li>
<li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li>
<li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+AlgU%2C+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors%2C+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li>
<li>Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRehm%2C+BHA+%22Alginates%3A+Biology+and+Applications%22">Alginates: Biology and Applications</a>. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).</li>
<li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+alginates%3A+from+biosynthesis+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li>
<li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li>
<li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li>
<li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+modification+of+the+carbazole+analysis%3A+application+to+heteropolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li>
</ol>

De auteur Hongwei D. Yu is de Chief Science Officer en mede-oprichter van Progenesis Technologies, LLC.

Zowel SCV en alginaat zijn belangrijke ziekte markers betrokken bij verschillende chronische infecties. Daarom is het vermogen om SCV te laten groeien en de regulatie en productie van alginaat door P. aeruginosa te bestuderen een integraal onderdeel van de ontdekking van nieuwe behandelingen voor deze chronische ziekten.
SCV stammen zijn notoir moeilijk om te groeien als gevolg van hun trage groeipercentage 4 in vergelijking met andere P. aeruginosa st...

Chronische longinfecties met Pseudomonas aeruginosa zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met cystische fibrose (CF). Tijdens de vroege kindertijd worden patiënten gekoloniseerd door meerdere bacteriële pathogenen, waaronder niet-mucoïde isolaten van P. aeruginosa1,2. De totstandkoming van de kleine kolonievariant (SCV) isoleert evenals slijmervormige isolaten is een teller voor het begin aan chronische besmettingen. SCV isolaten zijn zeer resistente3 als gevolg van hun trage groeipercentages4, waardoor ze een ernstig afschrikmiddel in de behandeling regimenten en andere chronische infecties5 door P. aeruginosa. Werk van Al Ahmar et al.6 toonde een verband tussen SCV en slijmvlies verbonden door de novo pyrimidine biosynthese. Pyrimidinehonger, als gevolg van mutaties in genen die betrokken zijn bij de productie van pyrimidine, resulteerde in SCV fenotype in de nonmucoid referentiestam PAO1 en het slijmvliesderivaat PAO581 (PAO1mucA25).
Hoewel alginaatoverproductie een belangrijke ziektemarker is voor chronische longinfecties in CF, is het niet duidelijk of er een directe correlatie is tussen de hoeveelheid alginaat en longpathologie, en het is onduidelijk of alginaat kan worden gebruikt als prognosemarker voor behandeling7. De productie van alginaat wordt voornamelijk gereguleerd door twee operonen, een regelgevende operon (algUmucABCD)8,9 en de biosynthetische operon (algD operon)10,11. Alginaat productie wordt strak gereguleerd door de sigma factor AlgU9,12 (ook bekend als AlgT) en de afbraak van de anti-sigma factor MucA13. De mogelijkheid om de productie van alginaat ter plaatse te controleren van de sputummonsters van de patiënten kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties.
Hier beschrijven we een groeitoestand die de aanwezigheid van SCV detecteert die wordt veroorzaakt door mutanten die de pyrimidine de novo niet kunnen synthetiseren. Suppletie van uracil en/of cytosine, de stikstofachtige basis van pyrimidine nucleotide, aan het medium activeert het bergingstraject, waardoor de normale groei in mutanten wordt hersteld. Deze groeimethode voor deze specifieke SCV mutanten kan worden gebruikt als een screeningmethode om pyrimidinemutaties in patiëntenmonsters te identificeren. Daarnaast bespreken we twee methoden voor detectie en meting van alginaat geproduceerd en afgescheiden door P. aeruginosa. De eerste is de traditionele methode14,15,16 van het vernederen van de polysaccharide met behulp van een hoge concentratie zuur en vervolgens het toevoegen van een colorimetrische indicator om de concentratie in het monster te kwantificeren. De tweede methode, ontwikkeld in ons laboratorium, maakt gebruik van de Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) met behulp van een anti-alginaat monoklonale antilichaam (mAb) ontwikkeld door QED Biosciences. De ELISA-methode blijkt specifieker en gevoeliger te zijn dan de uronic zuurtest en maakt veiliger gebruik mogelijk door het vermijden van het sterk geconcentreerde zwavelzuur. Met het vermogen van de ELISA om direct op de sputummonsters van de patiënt te worden gebruikt om alginaat te meten, kan het worden ontwikkeld als een diagnostisch hulpmiddel voor monitoring om de hoeveelheid alginaat in de longen te volgen in verschillende perioden van de infectie.

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molecular Bio-grade</td></tr><tr><td>Accu Block Digital Dry Bath</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Assay Plates 96-well</td><td>CoStar</td><td>2021-12-20</td><td></td></tr><tr><td>Bench Top Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Research Products International Corp.</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Cabinet Incubator</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Carbazole</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Culture Test Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cuvette Polystyrene (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cytosine</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Diposable Inoculation Loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannuronic Acid Sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMB00280</td><td></td></tr><tr><td>FMC Alginate</td><td>FMC</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>For Molecular Biology</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td><td>QED Biosciences</td><td>N/A</td><td>Lot # :15725/15726</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>32230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Round Toothpicks</td><td>Diamond</td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td><td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Difco</td><td>232100</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>or preferred vendor</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>i3x</td><td>or preferred vendor</td></tr><tr><td>Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sulfuric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td>Technical Grade</td></tr><tr><td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Acros Organics</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

cultuur van kleine kolonievariant van pseudomonas aeruginosa en quantitatie van zijn alginate

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische Gram-negatieve bacteriële ziekteverwekker, kan overproduceren een exopolysaccharide alginaat resulteert in een unieke fenotype genaamd slijmvlies. Alginaat is gekoppeld aan chronische longinfecties wat resulteert in een slechte prognose bij patiënten met cystische fibrose (CF). Inzicht in de paden die de productie van alginaat reguleren, kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die gericht zijn op de alginaatvorming. Een ander ziektegerelateerd fenotype is de kleine kolonievariant (SCV). SCV is te wijten aan de trage groei van bacteriën en vaak geassocieerd met verhoogde resistentie tegen antimicrobiële stoffen. In dit artikel tonen we eerst een methode om een genetisch gedefinieerde vorm van P. aeruginosa SCV te kweken als gevolg van pyrimidine biosynthesemutaties. Suppletie van stikstofhoudende bases, uracil of cytosine, geeft de normale groei terug aan deze mutanten, het aantonen van de aanwezigheid van een bergingstraject dat vrije bases uit het milieu scharrelt. Vervolgens bespreken we twee methoden voor het meten van bacteriële alginaat. De eerste methode is gebaseerd op de hydrolyse van de polysaccharide tot zijn uronic acid monomeer, gevolgd door derivatisatie met een chromogene reagens, carbazole, terwijl de tweede methode een ELISA gebruikt op basis van een commercieel verkrijgbare, alginaat-specifieke mAb. Beide methoden vereisen een standaardcurve voor kwantificering. We tonen ook aan dat de immunologische methode specifiek is voor alginaatkifie en kan worden gebruikt voor de meting van alginaat in de klinische monsters.

Figuur 1 toont platen van PAO1 en PAO581 met of zonder in-frame deletie in het pyrd-gen (een gen in de pyrimidine biosyntheseroute) die resulteert in SCV6. De PAO1 SCV mutant werd hersteld tot een normale groei in reactie op uracil suppletie(figuur 1A,B). Bovendien werd de PAO581ΔpyrDSCV mutant teruggegeven aan mucoidy met dezelfde uracil behandeling, omdat de moederstam ...

Hier beschrijven we een groeivoorwaarde om de kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosate kweken. We beschrijven ook twee afzonderlijke methoden voor de detectie en kwantificering van de exopolysaccharide alginaat geproduceerd door P. aeruginosa met behulp van een traditionele uronic zuur carbazole test en een alginaat-specifieke monoklonale antilichaam (mAb) gebaseerde ELISA.

Cultuur van kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosa en Quantitatie van zijn Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

De kleine kolonievariant of SCV techniek maakt selectie en groei van kleine kolonievarianten van Pseudomonas aeruginosa mogelijk. De methode is zeer definitief en maakt gemakkelijker selectie dan normale methoden. Dit protocol beschrijft ook een veiligere, meer gevoelige ELISA-methode voor alginaat kwantificering in vergelijking met de standaard uronic acid carbazole-methode, waardoor directe alginaatkwantificering mogelijk is in monsters zonder cautery of monstermanipulatie.Het aantonen van de procedure zal Brandon Kirby, een lab technicus, en Roy Al Ahmar, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om de kleine kolonievariant of SCV te detecteren, streept u eerst de P.aeruginosa-stam PAO1 delta PYRD op voorverwarmde PIA-platen. Laat de stammen 48 uur lang groeien op 37 graden Celsius.Op de groeiplaat, identificeer een enkele kolonie isolaat dat de SCV fenotype gekenmerkt door een kolonie grootte van een tot drie millimeter in tegenstelling tot de normale drie tot vijf millimeter kolonie grootte heeft. Opnieuw strepen van de geselecteerde kolonies om een zuiver isolaat van de SCV te verkrijgen. Om fysiologische activering van het bergingspad uit te voeren, gebruikt u een steriele inentingslus om de SCV-kolonie van de PIA-plaat te plukken.Streep de geselecteerde kolonie op een voorverwarmde PIA plaat aangevuld met 0,1 millimolar uracil. Laat de plaat 24 tot 48 uur groeien op 37 graden Celsius. Om te beginnen met de uronic acid carbazole test, identificeren van een enkele kolonie uit een zuivere cultuur van de gewenste stam te testen en kies de kolonie met behulp van een steriele tandenstoker.Plaats de tandenstoker in een kweek reageerbuis met vijf milliliter PIB. Groeien in een shaker incubator op 37 graden Celsius voor 24 uur. Voeg na incubatie een aliquot van de gekweekte PIB bouillon toe aan een voorverwarmde PIA-plaat.Met behulp van een steriele celspreader, verspreid de bouillon over de plaat en groeien op 37 graden Celsius voor 24 uur. Voeg met behulp van een pipetcontroller en een steriele pipet van 50 milliliter 0,85% natriumchloride toe aan het volwassen gazon en verzamel het monster door de plaat te schrapen met een celspreider. Aspirate het monster met behulp van een verse 50 milliliter pipet en breng over in een 50 milliliter collectie buis.Vortex het monster op hoog te mengen en plaats de monsters op ijs. Om de OD600 van de monsters te meten, moet u eerst de spectrofotometer leegmaken met één milliliter natriumchloride van 0,85%. Voeg vervolgens een milliliter van het monster toe aan een nieuwe wegwerpvvette en lees de OD. Herhaal deze stap twee keer om een drievoud van reads voor elk monster te verkrijgen.Voeg nu drie milliliter van de zwavelzuur borate oplossing in cultuur buizen en laat zitten op ijs. Voeg 350 microliter van het verzamelde monster langzaam toe aan het zuurmengsel in de reageerbuizen. Na kort vortexen op laag, voeg 100 microliter van 0,1% carbazool en ethanol oplossing aan het zuurmonster mengsel.Dop de buis en vortex vijf seconden op de medium instelling. Plaats vervolgens in een droog bad op 55 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na incubatie, vortex de buizen kort op hoog en laat afkoelen gedurende vijf minuten.Gebruik de buis met 0,85% natriumchloride als blanco op de spectrofotometer. Voeg vervolgens een milliliter van het mengsel toe aan een schone cuvette en lees de OD van de monsters op 530 nanometer op een spectrofotometer. Bereid een standaardcurve voor door de OD530 te meten van seriële verdunningen van bekende concentraties d-mannuronzuur.Herhaal twee maal en extraheer een lineaire vergelijking uit deze metingen. Bereken de concentratie van de alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600 te verkrijgen. Voeg met behulp van een micropipet 50 microliter van het verzamelde monster toe aan een onbehandelde 96-putplaat.Voeg vervolgens 50 microliter ELISA coating buffer toe aan de putten. Broed de plaat twee uur lang op 37 graden Celsius. Met behulp van een spuitfles, was de plaat putten twee keer met PBS-T door het vullen van de putten en vervolgens aftappen ze door het omdraaien van de plaat over.Voeg 200 microliters van het blokkeren buffer aan de putten met een micropipet en incubbaat op vier graden Celsius 's nachts. De volgende dag, was de plaat twee keer met PBS-T als voorheen. Voeg vervolgens 100 microliter verdunde primaire antilichamen toe aan de putten en broed gedurende 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur.Na incubatie, was de plaat putten drie keer met PBS-T als voorheen. Voeg vervolgens 100 microliter verdund secundair antilichaam toe aan de putten en incubbate bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Na het wassen van de plaat opnieuw drie keer, gebruik een micropipet om 100 microliter tmb ELISA oplossing toe te voegen.Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker door het plaatsen van de plaat in een lade of wikkelen in folie. Voeg vervolgens 100 microliter stopoplossing toe. Gebruik een plaatlezer om de OD op 450 nanometer te meten.Produceer een standaardcurve door de OD450 van seriële verdunningen van bekende concentraties d-mannuronzuur te meten. Herhaal de metingen twee keer en extraheer een lineaire vergelijking. Bereken de concentratie van de alginaat in elk monster met behulp van de standaardcurve en verdeel de alginaatconcentratie van de lineaire vergelijking door OD600 om de totale hoeveelheid alginaat per OD600 te verkrijgen.Hier zijn monsters van PAO581 en PAO581 met mutaties in genen die pyrimidine de novo biosynthese reguleren geteeld op PIA en PIA aangevuld met 0,1 millimolar uracil. De gegevens tonen aan dat de aanwezigheid van uracil in de media resulteert in de omzetting van de mutant stam terug naar slijmvisme zoals gezien door de herstelde alginaat productie. Hier worden resultaten getoond voor het anti-alginaat monoklonale antilichaam gebaseerde ELISA.Kolonies worden geteeld op PIA platen met arabinose voor de inductie van de PBAD promotor en de pHERD-20T plasmide. Getoond zijn PAO1, PAO1 die de uitdrukking plasmid pHERD-20T met de belangrijkste alginaat specifieke sigma factor algU, en PAO1 met een in-frame schrapping van het algD-gen bij het coderen van de belangrijkste alginaat biosynthetische enzym GDP-mannose dehydrogenase. Deze gegevens vergelijken de niet-mucoide niveaus van alginaat gemeten voor PAO1 en PAO1 delta algD versus de mucoid niveaus van alginaat gemeten voor PAO1 met pHERD-20T algU.Anti-alginaat ELISA werd ook getest op patiënt sputum monsters zonder voorafgaande groei op platen. Drie CF sputum monsters die de groei van mucoid P.aeruginosa had toonde detecteerbare alginaat in vergelijking met twee patiënt sputum monsters die ofwel niet-mucoid P.aeruginosa of geen P.aeruginosa groei bevatte. De voorbereiding van de standaardcurven voor de alginaatkwantificering is van cruciaal belang, aangezien dit een nauwkeurige en nauwkeurige meting van alginaat in het monster mogelijk maakt.De zuuroplossing die in de carbazole-methode wordt gebruikt, is zeer gevaarlijk, dus goede persoonlijke beschermingsmiddelen en voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt om de veiligheid te garanderen. Na het isoleren van SOV's kan verdere genetische profilering worden gedaan om mutaties die voorkomen en de pathogeniteit die aan dergelijke mutaties wordt geassocieerd, beter te begrijpen. De ELISA-methode kan worden aangepast om chronische longinfectie te monitoren bij patiënten met cystische fibrose.Bovendien kan onze groeimethode helpen bij het diagnosticeren van infecties veroorzaakt door specifieke SPV's.

culture-small-colony-variant-pseudomonas-aeruginosa-quantitation-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Source: Al Ahmar, R., et al. Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a colorimetric assay to quantify alginate produced by Pseudomonas aeruginosa, using carbazole to detect uronic acids after acid hydrolysis. The method enables comparative analysis of alginate production normalized to bacterial biomass in research and clinical studies.

Quantification of Bacterial Alginate Using the Uronic Acid Carbazole Assay

Source: Al Ahmar, R., et al. Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a colorimetric immunoassay to quantify alginate, a protective exopolysaccharide produced by Pseudomonas aeruginosa. The procedure involves coating a microplate with the sample, applying specific antibodies, and using an enzyme-substrate reaction to generate a measurable color change. A standard curve is then used to determine the...

Quantifying Bacterial Alginate Using an Antibody-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.

Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

Antibioticaresistentie bij adherent-invasieve Escherichia coli-stammen vormt uitdagingen bij het beoordelen van bacteriële invasie met de traditionele gentamicine-beschermingsassay. Er wordt een verbeterde methode beschreven om bacteriële invasie kwantitatief te evalueren door kolonievormende eenheden op te sommen en kwalitatief door geïnfecteerde cellen te visualiseren met immunofluorescentie-confocale microscopie.

Amikacine Beschermingsassay voor Kwantificering en Visualisatie van Escherichia coli-celinvasie

Leer de SCV-kweekmethode voor Pseudomonas aeruginosa en de ELISA-quantificatie van alginaat. Dit protocol biedt een veiliger en gevoeliger alternatief dan de standaard uronzuurcarbazolmethode.

Cultuur van kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosa en Quantitatie van zijn Alginate

Meer video's verkennen