Recapituleren van de overgang van de suckling-to-Spening in vitro met foetale intestinale Organoïden

Dit protocol beschrijft een cultuur van muis foetale darmcellen die het meest geschikt is om rijping te bereiken tot volwassen stadium in vitro. Deze in vitro benadering kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen van zogen-naar-spenen overgang evenals de modulatoren van dit proces te bestuderen en om efficiënter gebruik van proefdieren te bereiken. Het is essentieel voor dit in vitro model van darmrijping om primaire darmcellen te gebruiken vanaf het late ontwikkelingsstadium, tussen embryonale dag 18 en 20.

Met twee kleine tangen, strek de darm. Met behulp van de maag en appendix als gidsen, snijd de proximale en distale delen van de dunne darm. Met behulp van de appendix als een gids, snijd de dikke darm uit elkaar.

Om de darm in de lengterichting open te maken, plaatst u een scheermesje in de lengte langs de darm en trekt u de darm door tangen langs het scheermesje te schuiven. Snijd vervolgens de geopende darm in stukken van één centimeter. Bereid drie buizen van 50 milliliter met tien milliliter ijskoude PBS.

Breng de proximale en distale delen van de dunne darm en de dikke darm afzonderlijk naar de buizen. Houd de buizen op ijs tijdens het ontleden van de darmen van extra muizen. Verzamel alle darmdelen van één nest samen in dezelfde buis.

Na het wassen van de darmstukken met ijskoude PBS, incubeer met twee millimolar EDTA gedurende 30 minuten. Om crypten van het weefsel te scheiden, was de stukken gedeeltelijk met ijskoude PBS en tien procent kalfsserum en filter je door een 70 micron celzeef in een nieuwe buis. Herhaal het wasbeurt van het weefsel twee keer en combineer de gefilterde oplossing.

Centrifuge de gefilterde oplossing met de crypten op 150 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius om de crypten te verzamelen als een pellet. Breng de crypten in een 15 milliliter buis en centrifuge weer. Om putten te plaat, voeg de totale hoeveelheid extracellulaire matrix gel die nodig is in de buis en los de pellet.

Voeg 20 microliter van de opgeloste crypten toe aan elke put van een warme 48-putplaat. Na het plating van de eerste put, kijk onder de microscoop om de dichtheid van ongeveer 250 tot 300 crypten per put te bevestigen. Plaats de plaat tien minuten in een couveuse van 37 graden Celsius om de extracellulaire matrixgel te laten stollen.

Bereid vervolgens ENR-medium voor. Voeg 250 microliter van het ENR-medium toe aan elke put op de gel. Verander het medium drie keer per week en passage de organoïden een keer per week.

Gedurende een maand, elke drie dagen na elke passage, analyseren van de cultuur. Drie dagen na elke passage, isoleren RNA van een put door het toevoegen van 200 microliters van RNA lyse buffer aangevuld met twee microliters van beta mercaptoethanol aan de put. Breng het monster vervolgens van de put over in een RNAse-vrije buis van 1,5 milliliter.

In onze in vitro experimenten hebben we dexamethoson gebruikt als een voorbeeld van een externe factor waarvan bekend is dat ze de darmrijping in vivo versnellen. Om eiwit te isoleren, voeg 250 microliter van ijskoude celterugwinningsoplossing per put toe aan vijf putten organoïden en verzamel ze allemaal in een buis van 15 milliliter. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de extracellulaire matrixgel op te lossen.

Was met ijskoude PBS, voeg 250 microliters van cellyse buffer, en op te slaan op min 80 graden Celsius. Om enzymactiviteit te analyseren, bereid u eerst 0,625 molaire maleïsche buffer bij pH zes- en 0,05 molaire oplossingen van lactose, sacharose, maltose en trehalase en bewaar ze op ijs. Bereid testnormen voor door 5,56 molaire glucoseoplossing te verdunnen met ultrazuiver water om oplossingen te verkrijgen met 5 verschillende concentraties.

Voeg vervolgens in een 96-putplaat acht verschillende groepen organoïde lysate toe met hun respectievelijke substraten, waaronder normen en controle volgens het manuscript. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Om de hoeveelheid glucose te bepalen die wordt geproduceerd door de enzymen die aanwezig zijn in het organoïde lysaat, voeg snel 200 microliter vers bereide PGO-kleuroplossing toe en meet absorptie op de spectrofotometer op 450 nanometer elke vijf minuten gedurende dertig minuten bij 37 graden Celsius.

In dit protocol werden proximale en distale darm geïsoleerd van E18 tot E20 muisfoesten. Bij isolatie werden epitheelcellen gezaaid in extracellulaire matrix gelkoepels. Na ongeveer 28 tot 30 dagen cultuur werden foetale organoïden ontwikkeld tot de volwassen volwassen toestand.

Proximale markers Onecut2 en Gata4 werden vooral uitgedrukt in de proximale organoïde cultuur, terwijl distale markers Fabp6 en Guca2a vooral tot uiting kwamen in de distale organoïde cultuur. Foetale markers lactase, Ass1, Blimp-1 en neonatale Fc receptor daalde in hun relatieve expressie en volwassen markers sucrase isomaltase, argenase 2, trehalase en lysozyme toegenomen in de tijd in zowel proximale en distale organoïde culturen. De effecten van extrinsieke factoren hoeven niet per se genomisch te zijn.

Genexpressie van foetale marker Blimp-1 werd op dag 12 verlaagd voor de met dexamethasone behandelde organoïden in vergelijking met de controleorganoïden. Echter, zowel genexpressie en enzym activiteit van volwassen markers sucrase isomaltase werden verhoogd. Bij het gebruik van dit protocol is het belangrijk om te beseffen dat alleen laat-foetale organoïden in staat zijn om in vitro naar volwassen organoïden te reizen.

Het aantal van zes tot tien foetussen als uitgangspunt van deze cultuur kan verder worden verminderd door de hele darm te gebruiken om de algehele rijping te bestuderen. De translationele waarde van dit model ligt in de mogelijkheid van hoge groep extremen effectoren in staat zijn moduleren darmrijping die een proces behouden tussen zogende zoogdieren.