Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

Wat we hier presenteren is een robuuste en eenvoudige methode om microtubuliy dynamics te analyseren met behulp van live-cel spinnen schijf confocale beeldvorming in cellen gesynchroniseerd in prometafase, en beelden worden daarna geanalyseerd op een MATLAB-gebaseerd platform. Het gebruik van rood verschoven fluorescerend eiwit in combinatie met draaiende schijfmicroscopie vermindert de fototoxiciteit. Daarom kan een groter aantal cellen worden afgebeeld binnen hetzelfde preparaat.

Microtubulidydynamiek wordt in een groot aantal pathologische omstandigheden veranderd. Daarom kan het begrijpen van de regulatie en het gedrag van microtubbuledynamiek in die processen ons helpen het mechanisme van de ziekte te begrijpen en uiteindelijk therapieën te ontwikkelen om ze te compenseren. En de methode is ook schaalbaar, dus het kan mogelijk worden toegepast in een drug discovery inspanning.

De methode kan worden gewijzigd door fluorescentiedesynchronisatieprotocol te wijzigen en cellen uit verschillende fasen van de celcyclus te verkrijgen. Dit kan nuttig zijn bij het screenen van geneesmiddelen tegen microtubuli en het identificeren van defecten op delende en niet-delende cellen. Het is noodzakelijk om het transfectieprotocol en de zaaidichtheid voor elk celtype te optimaliseren.

Het expressieniveau van EB3 moet laag zijn om enkele groeiende microtubuli te detecteren. Begin met het spoelen van asynchrone hela-cellen in DPBS en vervolgens vijf minuten lang incubeermen met trypsine-EDTA, bij 37 graden Celsius. Stop de trypsinisatie door rpmi-1640 medium toe te voegen aangevuld met 10% warmte geïnactiveerde FCS bij een drie-tegen-een verhouding, de toegevoegde trypsin-EDTA.

Bereken de concentratie van de cellen volgens manuscriptaanwijzingen, en zaad 50.000 cellen in elk goed van een voorbereide, chambered coverslip. Breng de coverslip terug naar de couveuse en kweek cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Op de volgende dag, verwijder de cellen uit de incubator, en drop-wise voeg 100 microliter van transfectie mengsel in elke put.

Breng de cellen terug naar de couveuse en vul na vier uur incubatie de cellen met vers medium en bovendien 20 uur uitbroeden. Bereid een 2,5 micromolar oplossing van dimethylenastron, of DME, in fenol roodvrije DMEM, aangevuld met 10% FCS en twee millimolar L-glutamine. Vervang het groeimedium in de chambered coverslip door het DME groeimedium en breng de cellen terug naar de couveuse.

Breng de cellen na 3,5 uur incubatie naar de microscoop door de chambered coverslip in een milieukamer te monteren die is ingesteld op 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide, met donkere panelen voor beeldvorming. Ga dan verder met de incubatie voor een totaal van vier uur. Voer de time lapse imaging uit op een omgekeerde microscoop met een 100X, 1.49 numeriek diafragma, olieonderdompeling doelstelling, een dual disk confocal systeem, en een betrouwbare autofocus systeem.

Definieer de beeldvormingsparameters zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zoek een cel in profase, en focus in het Z-vlak dat overeenkomt met het centrum van de monopolaire mitotische as. Dan verwerven beelden om de 5 seconden, meer dan een minuut, zonder binning en geen verlichting tussen de belichtingen.

Begin met het laden van de numerieke analysesoftware en het toevoegen van de u-track V2.2.0-map in het softwarezoekpad, de zogenaamde filmkiezer GUI, vanuit het opdrachtvenster. Importeer vervolgens de raw-bestanden die worden gegenereerd door de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Voer handmatig het numerieke diafragma van de doelstelling en het tijdsinterval in dat wordt gebruikt voor beeldvorming.

Zodra alle afbeeldingen zijn geladen, slaat u de ingevoerde timelapse-serie op als een film door opslaan als filmlijst en de u-trackoptie aan de rechterkant van het dialoogvenster te selecteren. Selecteer microtubuli plus-ends in het pop-upmenu en klik op oke, waarmee een nieuw dialoogvenster wordt geopend om de parameters van de drie stappen van de analyse te bepalen. Klik voor stap één op instellingen en selecteer komeetdetectie in het vervolgkeuzemenu.

Definieer de parameters voor het verschil van gaussian filter en de waterscheiding segmentatie, zoals beschreven in het manuscript. Selecteer vervolgens instellingen toepassen op alle films en klik op toepassen. Selecteer voor stap twee de microtubuli plus-end-dynamiek en gebruik de instellingsopties om de waarden te definiëren voor het koppelen, dichten van hiaten, samenvoegen en splitsen en de filterfuncties van Kalman, afhankelijk van het tekstmanuscript.

Voor problemen met dimensionaliteit kiest u twee in het vervolgkeuzemenu en gebruikt u vijf frames voor maximale tussenruimte om te sluiten en drie frames voor de minimale lengte van tracksegmenten vanaf de eerste stap. Selecteer net als voorheen de instellingen toepassen op alle films en klik op toepassen. Kies voor stap drie de classificatie van microtubbuledynamica als een methode voor trackanalyse en definieer de parameters via de instellingsknop.

Selecteer de vakken voor het verwijderen van tracks aan het begin en einde van de film en maak histogrammen voor statistieken. Selecteer in de vervolgkeuzelijst twee tot drie frames voor voorwaartse gap en 95e percentiel van forward gap-snelheidsverdeling, voor respectievelijk voorwaartse en achterwaartse herindeling. Zodra alle parameters zijn gedefinieerd, selecteert u het selectievakje controleren/uitvinken toepassen op alle films en voert u alle selectievakjes films uit in het u-trackvenster voor het besturingselementvenster en drukt u op Uitvoeren.

Er wordt een bericht weergegeven zodra de verwerking van de film is voltooid. De pEB3-tdTomato plasmid werd van voorbijgaande aard uitgedrukt in HeLa cellen. De cellen werden gesynchroniseerd met DME behandeling.

Time lapse films van microtubuli groei werden geanalyseerd, en de resulterende groei snelheid en dynamiek werden uitgezet. De parameters die worden beschreven om de analyse te beïnvloeden, zoals de maximale tussenruimtelengte en de maximale krimpfactor, zijn gewijzigd voor dezelfde set timelapse-films. De overeenkomstige waarden van groeisnelheid en dynamiek werden berekend.

Hoewel de resulterende groeisnelheid niet significant werd beïnvloed, was de dynamiek anders toen de maximale afstandslengte werd gewijzigd. In alle drie de gevallen was de detectie van microtubbule subsporen vergelijkbaar, maar de reconstructie van de volledige MT-trajecten werd meestal beïnvloed toen de maximale afstandslengte op 15 werd ingesteld. Om te beoordelen of beeldvormingsvoorwaarden het gedrag van microtubuli verstoorden, werden de eerste en tweede helften van de time lapse-serie afzonderlijk geanalyseerd en werden de bijbehorende groeisnelheid en dynamiek vergeleken.

Zoals verwacht werden er geen significante verschillen vastgesteld. Het is belangrijk om in gedachten te houden, dat omdat de cellen worden gesynchroniseerd in prometafase, de dichtheid van microtubuli zeer hoog is. Daarom moet men de parameters van de analyse zeer zorgvuldig instellen, om verschillende microtubuli niet verkeerd te identificeren.

De meting van de microtubulidynamiek met deze methode kan worden vergeleken met studies van andere biologische doelen direct, indirect, het reguleren van microtubuli.