Name: Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer microtubulusdynamiek meten in gesynchroniseerde HeLa-cellen door draaiende schijf microscopie en MATLAB-analyse. Deze methode vermindert fototoxiciteit en ondersteunt onderzoek naar ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de lichte microscopie faciliteit, Max-Planck Instituut voor experimentele geneeskunde, voor hun deskundig advies en ondersteuning.

1. zaaien van HeLa-cellen
<ol><li>Bereid 2 mL van 5 μg/mL fibronectine oplossing in fosfaatgebufferde Saline (PBS) en voeg hieraan 450 μL toe in elke put van een 4 well Chambered dekslip (#1.5). Incuberen de glijbaan gedurende 15 minuten bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Spoel asynchroon groeiende HeLa-cellen af met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en inincuberen met trypsine-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) gedurende 5 minuten bij 37 °C. Stop de enzymatische reactie door de toevoeging van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum (FCS) bij 3:1 (v:v) verhouding van toegevoegde trypsine-EDTA. Opmerking: HeLa-cellen werden gehandhaafd in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FCS bij 37 ° c en 5% CO2 en werden routinematig doorgangen zodra ze 80 – 90% confluentie bereikten zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Bepaal de celconcentratie met behulp van een Neubauer kamer. Meng een aliquot van 50 μL van de celsuspensie met trypan Blue bij een ratio van 1:1 (v:v), recombinatie en breng 10 μL van de suspensie over in de kamer. Tel alleen de trypaanse blauw-negatieve cellen in de vier grote vierkantjes (voor details zie Phelan et al.47). Afleiden van de celconcentratie van het getelde celnummer met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60478/60478eq1.jpg">
</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 2 min. respendeer met verse rpmi 1640 om 1 x 106 cellen/ml te verkrijgen.</li>
	<li>Verwijder de fibronectin uit de Chambered coverslip, was de putjes tweemaal met DPBS en zaai 50.000 cellen per putje.</li>
	<li>Retourneer de Chambered afdek met de cellen naar de incubator en kweek ze voor 24 uur bij 37 °c en 5% Co2.</li>
</ol>2. expressie van pEB3-tdTomato in HeLa-cellen
<ol><li>Maak een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Verdun voor elke buis 2 μg pEB3-tdTomato48 met transfectie buffer (synthetisch product in waterige oplossing) tot een eindvolume van 396 μL.</li>
	<li>Voeg 4 μL transfectie reagens (niet-lipiden, met polyethylenimine) toe aan de eerste buis en Vortex het mengsel onmiddellijk voor precies 10 s.</li>
	<li>Draai de buis kort met een micro centrifuge en inincuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder de HeLa-cellen uit de incubator. Dropwise, voeg 100 μL van het transfectie mengsel toe aan elk goed van een 4 goed Chambered dekslip, en retourneer de cellen naar de incubator.</li>
	<li>Na 4 uur incubatie bij 37 °C en 5% CO2, vullen de cellen aan met een vers groeimedium en incuberen ze gedurende ten minste 24 uur bij 37 °c en 5% Co2. Opmerking: Het is noodzakelijk om te optimaliseren van de transfectie voorwaarden voor elk celtype. De uitdrukkings niveaus moeten laag genoeg zijn om de identificatie van enkele MT-groei uiteinden mogelijk te maken. Als alternatief kan een cellijn met een stabiel uitdrukken van EB3-tdTomato worden gebruikt in de experimenten; Dit zou de variabiliteit in uitdrukkings niveaus van EB3-tdTomato verminderen tussen preparaten en tussen cellen uit hetzelfde preparaat49.</li>
</ol>3. synchronisatie en live-celbeeldvorming van pEB3-tdTomato – HeLa-cellen uitdrukken
<ol><li>Bereid een 2,5 μM oplossing van dimethyleenastron (DME) in fenol-rood gratis Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% FCS en 2 mM L-glutamine of een alternatieve glutamine toevoer.</li>
	<li>Vervang het groeimedium in de Afdeklijst van de Chambered met 500 μL van het groeimedium met 2,5 μM DME en inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Na 3,5 h van incubatie met DME, de cellen overbrengen naar de Microscoop, Monteer de Chambered afdek in een milieu kamer met donkere panelen voorbeeld vorming bij 37 ° c en 5% Co2, en verder inbroed tot de totale incubatietijd 4 h. Opmerking: Het onderhoud van de temperatuur bij 37 °C zonder schommeling is cruciaal voor het experiment.</li>
	<li>Voer de time-lapse Imaging uit op een omgekeerde Microscoop uitgerust met een 100x 1,49 N.A. olie immersie doelstelling, een Dual Spinning Disk confocale systeem en een betrouwbaar autofocus systeem voor continu onderhoud van het brandvlak. Definieer de imaging-parameters als volgt. Opmerking: We gebruiken een elektron vermenigvuldigings camera (EM-CCD) met oplaadapparaat.<ol>
<li>Gebruik voor EB3-tdTomato excitatie een 561 nm Laser lijn met 200 MS belichtingstijd. Vang het uitgezonden licht op via een viervoudige band pass (405, 488, 561, 640 nm) dichroïde spiegel en een 600/52 nm emissie filter. Opmerking: Laser vermogen kan worden aangepast voor elke afbeelding gemaakt cel om de beeld verzadiging te voorkomen. In alle time-lapse films die hier worden gegeven, was de laser kracht ingesteld op 5,3 mW.</li>
		<li>Zoek een cel in profase en focus in het Z-vlak dat overeenkomt met het midden van de monopolaire mitotische spil. Verwerven van beelden elke 0,5 s over een totaal van 1 min zonder binning en geen belichting tussen de belichtingen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse van de MT-dynamiek met U-track v 2.2.0
<ol><li>Voor het analyseren van de MT-dynamiek is een numerieke computeromgeving software vereist (bijvoorbeeld MATLAB). Opmerking: Basiskennis van de software is voldoende voor de analyse. Uitgebreid Help materiaal en tutorials zijn beschikbaar op de website van de ontwikkelaar (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).</li>
	<li>Download (https://github.com/DanuserLab/u-track) en installeer de open-source u-track v 2.2.0-software volgens de gedetailleerde instructies in het bestand ' Readme_u-track. PDF '50,51,52.</li>
	<li>Start de numerieke analyse software en voeg U-track v 2.2.0 map met submappen in de software zoekpad.</li>
	<li>Vanuit het commando venster oproep "Movieselectorgui". Hiermee opent u een dialoogvenster van waaruit de RAW-bestanden die worden gegenereerd door de beeldverwervings software op de Microscoop kunnen worden geïmporteerd (aanvullend figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4). Opmerking: De U-track software is compatibel met andere beeldgegevens formaten. Het maakt gebruik van bio-formaten, die verschillende Life Science data formaten herkent53.</li>
	<li>De grootte van elke afbeelding wordt automatisch uit de metagegevens gelezen. Voer handmatig het numerieke diafragma in van de doelstelling (in dit geval 1,49) en het tijdsinterval (0,5 s) dat wordt gebruikt voorbeeld vorming (aanvullende figuur 1b). Daarnaast kan ook informatie over de excitatie golflengte, de fluorophore en de blootstellingstijd worden verstrekt, maar ze zijn niet kritisch voor verdere analyse.</li>
	<li>Zodra alle afbeeldingen zijn geladen, slaat u de ingevoerde timelapse-reeks op als een film lijst door de "Opslaan als film lijst" te selecteren. Aan de rechterkant van het dialoogvenster selecteert u de optie "U-track" en drukt u op "Doorgaan" (aanvullende figuur 1c). Opmerking: De waarden zijn geoptimaliseerd voor HeLa-cellen. Als u overschakelt naar een andere cellijn, moeten de waarden opnieuw worden gedefinieerd. U ook de instellingen gebruiken die door de softwareontwikkelaars worden aanbevolen. De gedetailleerde uitleg van elk van de parameters en hoe deze moeten worden gedefinieerd, vindt u in het technische rapport dat is meegeleverd met de vorige versie van de software, Plustip tracker50.</li>
	<li>Selecteer in het pop-upvenster "Microtubule plus-ends" en druk op "OK" (aanvullende afbeelding 1c). Het nieuwe dialoogvenster maakt het mogelijk om de parameters te bepalen voor de drie stappen van de analyse (aanvullende figuur 1d), die detectie, tracering en spoor analyse zijn.</li>
	<li>Kies in stap 1 "instellingen" en selecteer in een vervolgkeuzemenu "Comet Detection" als detectiemethode (aanvullende figuur 2b).<ol>
<li>Definieer in het nieuwe dialoogvenster de parameters voor het verschil van het Gaussianen filter en de segmentatie van de waterscheiding als volgt (aanvullende figuur 2c): masker proces dat moet worden gebruikt voor de detectie = geen; Low-Pass Gaussiaanse standaarddeviatie = 1 pixel; High-Pass Gaussiaanse standaarddeviatie = 3 pixels; Minimum drempel = 3 standaarddeviaties; Drempel grootte van stap = 0,25 standaarddeviaties. Selecteer "instellingen toepassen op alle films" en "toepassen".</li>
	</ol></li>
	<li>In stap 2 worden de parameters voor koppelen, kloof dichten, samenvoegen en splitsen en Kalman-filterfuncties in drie stappen gedefinieerd, zoals aangegeven in roze, groen en blauw, dienovereenkomstig (aanvullende Figuur 3b). Voor deze stappen selecteert u de "Microtubule plus-end Dynamics" en uit de optie "setting" definieert u de waarden zoals aangegeven in aanvullende figuur 3c – E, respectievelijk.<ol>
<li>Voor problemen met dimensionaliteit kiest u "2" in het vervolgkeuzemenu. Gebruik de maximale kloof te sluiten = 5 frames; Minimale lengte van spoor segmenten vanaf de eerste stap = 3 frames. Zoals eerder, selecteer "instellingen toepassen op alle films" en klik op "toepassen".</li>
	</ol></li>
	<li>In stap 3 van de analyse worden de gedetecteerde MT-tracks geclassificeerd (aanvullend figuur 4). Als een track analysemethode, kies "Microtubule Dynamics Classification" en definieer de parameters via de "setting" knop zoals aangegeven in aanvullende figuur 4b, C. Kies daarna het vak "instellingen toepassen op alle films" en klik op "toepassen".</li>
	<li>Zodra alle parameters zijn gedefinieerd, selecteert U in het venster "Configuratiescherm – U-spoor" (aanvullende figuur 1d) de vakken "Controleer/Verwijder het vinkje bij alle films" en "alle films uitvoeren" en druk op "uitvoeren". Dit zal de MT-analyse van de time-lapse-serie initiëren.</li>
	<li>Zodra de verwerking van de film is voltooid, wordt een bericht "uw film (s) zijn verwerkt" weergegeven. Druk op "OK" en vervolgens op "Save".</li>
	<li>Nu is het veilig om te stoppen met de numerieke analyse software. De resultaten van de film verwerking worden opgeslagen in submapstructuren als m-bestanden in de map waar de RAW-bestanden worden opgeslagen.</li>
</ol>5. statistische analyse van de MT Dynamics
<ol><li>Importeer de m-bestanden in een voorkeurs statistiek-analyseprogramma. Opmerking: In ons geval importeren we eerst de bestanden in een standaard spreadsheet om ze leesbaar te maken. De m-bestanden bevatten statistische informatie (mediaan, gemiddelde en standaarddeviatie) op verschillende parameters (bijv. groeisnelheid, MT dynamiciteit). De gedetailleerde lijst van de parameters wordt gegeven in het technisch rapport dat is meegeleverd met de vorige versie van de software, plustip tracker50,52. De gegenereerde m-bestanden kunnen ook worden geïmporteerd in andere software voor gegevensverwerking.</li>
	<li>Kies de parameter ' groeisnelheid mean ' en importeer deze in een tabel voor statistieken en weergave. Voer de informatie in over andere parameters (bijvoorbeeld ' dynamiciteit ') in een nieuwe tabel of in een nieuwe kolom van dezelfde gegroepeerde tabel en plot.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een wijziging van een methode die voor het eerst werd vastgesteld door Ertych et al.44. Samen met een aantal andere modificaties, combineren we deze techniek van MT Dynamics analyse met Dual Spinning Disk confocale Imaging. Het gebruik van de Dual Spinning Disk verbetert de resolutie van de groeiende MTs en vermindert fototoxiciteit36. We verminderen verder de fotobleaching en laserlicht veroorzaakte schade van de cellen door over te schakelen naar een l...

Microtubuli (MTs) zijn zeer dynamische structuren gevonden in vrijwel alle eukaryote cellen en in sommige bacteriën1. Samen met actine en tussenliggende filamenten, ze beeldhouwen het cytoskelet2,3. Cell Division4, molecuul transport5, flagellar verslaan6, de sensatie van de omgeving door primaire tril haar cilium7, hoorzitting (kinocilium)8,9, embryo Genesis10,11,12, invasie en metastase13,14, en zelfs Geheugenvorming15,16,17,18, en veel andere processen vertrouwen voornamelijk op MTs. deelname van MTs in al deze gebeurtenissen zou onmogelijk zijn zonder hun opmerkelijke vermogen om snel te schakelen tussen groei (polymerisatie) en krimp (depolymerisatie). Deze eigenschap wordt beschreven als dynamische instabiliteit19. MT dynamiciteit is veranderd in vele pathologische condities20,21,22. Vandaar, het bepalen van de aard van deze eigenschap kan helpen om te begrijpen van de ziekte mechanismen en vervolgens hun behandeling.
Er is een lange lijst met methoden ontwikkeld voor de analyse van MT Dynamics, waarvan de meeste gebaseerd zijn op beeldvormingstechnieken23. Aanvankelijk werden brede veld licht microscopen gebruikt om de vorming van tubuline-polymeren in vitro24te observeren. De ontdekking van end-binding (EB)-eiwitten die verzamelen bij mt plus-ends en de ontwikkeling van methoden tot fluorescently label eiwitten maakten het mogelijk om het gedrag van MTs direct in levende cellen met breed veld en confocale fluorescentie microscopen25,26,27te observeren. Eén EB-eiwit is eind bindende proteïne 3 (EB3)28; door het overdrukken en volgen van EB3 gesmolten tot een fluorescerende proteïne, kunnen MT plus-end assemblage percentages worden bepaald op29,30.
Confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie (CLSM) wordt vaak gebruikt om de MT-dynamiek te volgen. Deze beeldvormings techniek vormt echter een hoog risico op fototoxiciteit en fotobleaching, twee ongewenste processen voor de beeldvorming van levende cellen en Dim-voorbeelden31. Om een betere signaal-ruis verhouding te verkrijgen, moeten de laser kracht en de blootstellingsduur hoog genoeg zijn, terwijl ze de monsters niet beschadigen, en dit vereist een opoffering van de resolutie in ruil voor snelheid. Een geschikt alternatief voor CLSM is het spinnen schijf microscopie32. Deze Imaging modaliteit is gebaseerd op het gebruik van een Nipkowschijf33, die bestaat uit een bewegende schijf met een array van pinholes, en werkt op equivalente wijze aan veel CLS microscopen die hetzelfde monster gelijktijdig34. Daarom zal het licht van de laser verschillende gebieden in het monster tegelijkertijd verlichten, maar het confocale karakter behouden. De Nipkowschijf maakt het daarom mogelijk om beelden te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met CLSM, maar sneller en minder Laser vermogen gebruiken. De Nipkow-schijf werd verder verbeterd door Yokogawa Electric, die een tweede schijf introduceerde met een reeks micro lenzen erop die individueel direct licht in een respectieve pinhole, verdere vermindering van fototoxiciteit en photobleaching35. Dus, Spinning Disk laser scanning microscopie werd een methode van keuze voor Live Cell Imaging, en het maakt het mogelijk om beelden met een hoge signaal-ruis verhouding te verkrijgen op een hoge snelheid31,36, wat cruciaal is voor het oplossen van signalen zoals die van de snelgroeiende MT-ends.
MT Dynamics verschillen tijdelijk. Bijvoorbeeld, de mitotische MTs zijn dynamischer dan de interfase Ones37,38. Evenzo, verschillen in de groeisnelheid en krimp zijn waargenomen zelfs binnen dezelfde cel cyclus fase, zoals mitose39,40. Daarom, om valse gegevensverzameling te voorkomen, moet de meting van MT Dynamics worden beperkt tot een smal tijdvenster tijdens de celcyclus. Meting van de MT-dynamiek in tijdens kan bijvoorbeeld worden bereikt door de cellen te behandelen met dimethylenastron (DME), een monastrol-analoog dat de motor kinesin Eg541 remt en de vorming van de bipolaire mitotische spindel42verhindert. Remming van cellen bij tijdens met Eg5 remmer DME en andere monastrol derivaten heeft geen invloed op de MT Dynamics43,44,45, waardoor DME een nuttig instrument voor het bestuderen van MT Dynamics zowel in vaste en levende cellen44.
Hier combineren we de methode van MT Dynamics analyse in tijdens cellen, beschreven door ertych et al.44 met Dual Spinning Disk Imaging. Deze methode maakt meting van de MT-dynamiek in prometafase cellen verzameld uit een enkel focal vlak met een hogere Imaging rate, maar zonder photobleaching en minimale fototoxiciteit. Bovendien gebruiken we als fluorescerende reporter tandem dimeer tomaten fluorescerende eiwitten (tdTomato) die de helderheid en foto stabiliteit in vergelijking met het groene fluorescerende eiwit (EGFP) heeft verbeterd en is opgewonden met lager energie licht46. Daarom vereist tdTomato minder Laser vermogen voor excitatie en is het minder fototoxisch. In totaal verbeteren we de methode verder door de fototoxiciteit te verminderen en de resolutie en nabewerking te verbeteren die nodig zijn voor de MT Dynamics-analyse. Bovendien maken we een basis voor toekomstige wijzigingen van de methode door deze te combineren met andere synchronisatie technieken.

<table><tbody><tr><td>Dimethylenastron</td><td>Merck</td><td>324622</td><td></td></tr><tr><td>DMEM zonder fenolrood</td><td>Gibco</td><td>31053-28</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Biochrom</td><td>S0415</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin bovien plasma</td><td>Merck</td><td>F4759</td><td>Steriele poeder</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Stabiele glutamine substitutie</td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>EB3-TdTomato</td><td>Addgene</td><td>plasmide #50708</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA oplossing</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>0,05%/0,02 % zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>&micro;-schuif</td><td>Ibidi</td><td>80426</td><td>4-wels schuif met #1.5 dekglas</td></tr><tr><td>Eclipse Ti Inverteer microscoop</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>CFI Apo TIRF 100xC Olie</td></tr><tr><td>ACAL Laser Excahnger</td><td>Nikon</td><td></td><td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 en 647 nm</td></tr><tr><td>Spinning disk module</td><td>Andor</td><td>CSU-W</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Milieukamer</td><td>Okolab</td><td></td><td>Donkere kamer uitgerust met CO2 toevoer, temperatuurregeling en bevochtiger</td></tr><tr><td>HeLa Cellen</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements v4</td><td>Nikon</td><td></td><td>Spinning disk microscoop. Acquisitiesoftware</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Computing omgeving</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistische analyse- en weergavesoftware</td></tr></tbody></table>

meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We beschrijven een modificatie van een gevestigde methode om de dynamiek van microtubulus in levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de uitdrukking van een genetisch gecodeerde marker voor de positieve uiteinden van microtubuli (EB3 gelabeld met Tdtomaat fluorescerende eiwitten) en hoge-snelheid, hoge-resolutie, Live-celbeeldvorming met behulp van draaiende schijf confocale microscopie. Celcyclus synchronisatie en verhoogde dichtheid van microtubuli worden bereikt door remming van de centrosomale scheiding in mitotische cellen, en analyse van de groei wordt uitgevoerd met behulp van open-source U-track software. Het gebruik van een helder en rood verschoven fluorescerende eiwit, in combinatie met het lagere Laser vermogen en de gereduceerde blootstellingstijd die nodig is voor het spinnen van schijf microscopie verminderen fototoxiciteit en de waarschijnlijkheid van lichtgeïnduceerde artefacten. Dit maakt een groter aantal cellen in dezelfde bereiding mogelijk, terwijl de cellen in een groeimedium onder standaardcultuur omstandigheden worden gehandhaafd. Omdat de analyse wordt uitgevoerd in een automatische gecontroleerde mode, zijn de resultaten statistisch robuust en reproduceerbaar.

Na het gegeven protocol in Figuur 1awerd de PEB3-tdTomato plasmide transitief uitgedrukt in asynchroon groeiende HeLa-cellen. De cellen werden gesynchroniseerd 48 h na de transfectie bij tijdens door DME behandeling (Figuur 1b). Deze stap zorgde ervoor dat de meting van de MT-dynamiek altijd in dezelfde fase van de celcyclus werd uitgevoerd. De timelapse-films werden verder verwerkt en geanalyseerd met U-track v 2.2.0, zoals beschreven in de aanvullende document...

Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Wat we hier presenteren is een robuuste en eenvoudige methode om microtubuliy dynamics te analyseren met behulp van live-cel spinnen schijf confocale beeldvorming in cellen gesynchroniseerd in prometafase, en beelden worden daarna geanalyseerd op een MATLAB-gebaseerd platform. Het gebruik van rood verschoven fluorescerend eiwit in combinatie met draaiende schijfmicroscopie vermindert de fototoxiciteit. Daarom kan een groter aantal cellen worden afgebeeld binnen hetzelfde preparaat.Microtubulidydynamiek wordt in een groot aantal pathologische omstandigheden veranderd. Daarom kan het begrijpen van de regulatie en het gedrag van microtubbuledynamiek in die processen ons helpen het mechanisme van de ziekte te begrijpen en uiteindelijk therapieën te ontwikkelen om ze te compenseren. En de methode is ook schaalbaar, dus het kan mogelijk worden toegepast in een drug discovery inspanning.De methode kan worden gewijzigd door fluorescentiedesynchronisatieprotocol te wijzigen en cellen uit verschillende fasen van de celcyclus te verkrijgen. Dit kan nuttig zijn bij het screenen van geneesmiddelen tegen microtubuli en het identificeren van defecten op delende en niet-delende cellen. Het is noodzakelijk om het transfectieprotocol en de zaaidichtheid voor elk celtype te optimaliseren.Het expressieniveau van EB3 moet laag zijn om enkele groeiende microtubuli te detecteren. Begin met het spoelen van asynchrone hela-cellen in DPBS en vervolgens vijf minuten lang incubeermen met trypsine-EDTA, bij 37 graden Celsius. Stop de trypsinisatie door rpmi-1640 medium toe te voegen aangevuld met 10% warmte geïnactiveerde FCS bij een drie-tegen-een verhouding, de toegevoegde trypsin-EDTA.Bereken de concentratie van de cellen volgens manuscriptaanwijzingen, en zaad 50.000 cellen in elk goed van een voorbereide, chambered coverslip. Breng de coverslip terug naar de couveuse en kweek cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Op de volgende dag, verwijder de cellen uit de incubator, en drop-wise voeg 100 microliter van transfectie mengsel in elke put.Breng de cellen terug naar de couveuse en vul na vier uur incubatie de cellen met vers medium en bovendien 20 uur uitbroeden. Bereid een 2,5 micromolar oplossing van dimethylenastron, of DME, in fenol roodvrije DMEM, aangevuld met 10% FCS en twee millimolar L-glutamine. Vervang het groeimedium in de chambered coverslip door het DME groeimedium en breng de cellen terug naar de couveuse.Breng de cellen na 3,5 uur incubatie naar de microscoop door de chambered coverslip in een milieukamer te monteren die is ingesteld op 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide, met donkere panelen voor beeldvorming. Ga dan verder met de incubatie voor een totaal van vier uur. Voer de time lapse imaging uit op een omgekeerde microscoop met een 100X, 1.49 numeriek diafragma, olieonderdompeling doelstelling, een dual disk confocal systeem, en een betrouwbare autofocus systeem.Definieer de beeldvormingsparameters zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zoek een cel in profase, en focus in het Z-vlak dat overeenkomt met het centrum van de monopolaire mitotische as. Dan verwerven beelden om de 5 seconden, meer dan een minuut, zonder binning en geen verlichting tussen de belichtingen.Begin met het laden van de numerieke analysesoftware en het toevoegen van de u-track V2.2.0-map in het softwarezoekpad, de zogenaamde filmkiezer GUI, vanuit het opdrachtvenster. Importeer vervolgens de raw-bestanden die worden gegenereerd door de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Voer handmatig het numerieke diafragma van de doelstelling en het tijdsinterval in dat wordt gebruikt voor beeldvorming.Zodra alle afbeeldingen zijn geladen, slaat u de ingevoerde timelapse-serie op als een film door opslaan als filmlijst en de u-trackoptie aan de rechterkant van het dialoogvenster te selecteren. Selecteer microtubuli plus-ends in het pop-upmenu en klik op oke, waarmee een nieuw dialoogvenster wordt geopend om de parameters van de drie stappen van de analyse te bepalen. Klik voor stap één op instellingen en selecteer komeetdetectie in het vervolgkeuzemenu.Definieer de parameters voor het verschil van gaussian filter en de waterscheiding segmentatie, zoals beschreven in het manuscript. Selecteer vervolgens instellingen toepassen op alle films en klik op toepassen. Selecteer voor stap twee de microtubuli plus-end-dynamiek en gebruik de instellingsopties om de waarden te definiëren voor het koppelen, dichten van hiaten, samenvoegen en splitsen en de filterfuncties van Kalman, afhankelijk van het tekstmanuscript.Voor problemen met dimensionaliteit kiest u twee in het vervolgkeuzemenu en gebruikt u vijf frames voor maximale tussenruimte om te sluiten en drie frames voor de minimale lengte van tracksegmenten vanaf de eerste stap. Selecteer net als voorheen de instellingen toepassen op alle films en klik op toepassen. Kies voor stap drie de classificatie van microtubbuledynamica als een methode voor trackanalyse en definieer de parameters via de instellingsknop.Selecteer de vakken voor het verwijderen van tracks aan het begin en einde van de film en maak histogrammen voor statistieken. Selecteer in de vervolgkeuzelijst twee tot drie frames voor voorwaartse gap en 95e percentiel van forward gap-snelheidsverdeling, voor respectievelijk voorwaartse en achterwaartse herindeling. Zodra alle parameters zijn gedefinieerd, selecteert u het selectievakje controleren/uitvinken toepassen op alle films en voert u alle selectievakjes films uit in het u-trackvenster voor het besturingselementvenster en drukt u op Uitvoeren.Er wordt een bericht weergegeven zodra de verwerking van de film is voltooid. De pEB3-tdTomato plasmid werd van voorbijgaande aard uitgedrukt in HeLa cellen. De cellen werden gesynchroniseerd met DME behandeling.Time lapse films van microtubuli groei werden geanalyseerd, en de resulterende groei snelheid en dynamiek werden uitgezet. De parameters die worden beschreven om de analyse te beïnvloeden, zoals de maximale tussenruimtelengte en de maximale krimpfactor, zijn gewijzigd voor dezelfde set timelapse-films. De overeenkomstige waarden van groeisnelheid en dynamiek werden berekend.Hoewel de resulterende groeisnelheid niet significant werd beïnvloed, was de dynamiek anders toen de maximale afstandslengte werd gewijzigd. In alle drie de gevallen was de detectie van microtubbule subsporen vergelijkbaar, maar de reconstructie van de volledige MT-trajecten werd meestal beïnvloed toen de maximale afstandslengte op 15 werd ingesteld. Om te beoordelen of beeldvormingsvoorwaarden het gedrag van microtubuli verstoorden, werden de eerste en tweede helften van de time lapse-serie afzonderlijk geanalyseerd en werden de bijbehorende groeisnelheid en dynamiek vergeleken.Zoals verwacht werden er geen significante verschillen vastgesteld. Het is belangrijk om in gedachten te houden, dat omdat de cellen worden gesynchroniseerd in prometafase, de dichtheid van microtubuli zeer hoog is. Daarom moet men de parameters van de analyse zeer zorgvuldig instellen, om verschillende microtubuli niet verkeerd te identificeren.De meting van de microtubulidynamiek met deze methode kan worden vergeleken met studies van andere biologische doelen direct, indirect, het reguleren van microtubuli.

measurement-microtubule-dynamics-spinning-disk-microscopy-monopolar

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the interference reflection microscopy (IRM) technique to visualize microtubules growing on a coverslip surface in the presence of a suitable buffer. Upon illumination with incident light, the coverslip-buffer interface and buffer-microtubule interface reflect light, which combines to create an interference pattern, enabling the visualization of microtubules as high-contrast images against a bright background.

Interference Reflection Microscopy for Label-Free Visualization of Microtubule Dynamics

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

De assemblage en positionering van de mitotische spindel zijn afhankelijk van de gecombineerde krachten die worden gegenereerd door microtubulusdynamiek, motoreiwitten en cross-linkers. Hier presenteren we onze recent ontwikkelde methoden waarin de geometrische beperking van sferische emulsiedruppels wordt gebruikt voor de bottom-up reconstituitie van basische mitotische spindels.

Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.

Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Dit protocol is gewijd aan de microtubule plus-end visualisatie door EB3-eiwittransfectie om hun dynamische eigenschappen in primaire celkweek te bestuderen. Het protocol werd geïmplementeerd op menselijke primaire huidfibroblasten verkregen van patiënten met de Ziekte van Huntington.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.

Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Leer microtubulusdynamiek meten in gesynchroniseerde HeLa-cellen door draaiende schijf microscopie en MATLAB-analyse. Deze methode vermindert fototoxiciteit en ondersteunt onderzoek naar ziekteprocessen.

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

Meer video's verkennen