Name: Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer hoe je de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties vastlegt via Cleared Heart driedimensionale beeldvorming. Deze methode met passive CLARITY en confocale microscopie helpt onderzoekers celgedrag tijdens hartregeneratie te volgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor dit project werd verstrekt door de UW School of Medicine and Public Health van het Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), en een American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor het gebruik en de verzorging van proefdieren en in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee in de School of Medicine and Public Health aan de Universiteit van Wisconsin-Madison. Alle methoden werden uitgevoerd op wilde type C57BL/6J (B6) en transgene muislijnen verkregen van Jackson Laboratories.
1. Coronaire Slagader Occlusie (Myocardial Infarct) Geïnduceerd via ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD) in 1-dag-oude neonatale muizen6
<ol><li>Scheid de 1-daagse neonatale pups van de moeder door ze in een schone kooi te plaatsen, samen met een aantal van het originele nestmateriaal.</li>
	<li>Plaats de helft van de kooi op een verwarmingskussen ingesteld op middelhoog vuur. De pups moeten aan de onverwarmde kant van de kooi blijven, maar pas na de operatie op de verwarmde kant worden geplaatst.</li>
	<li>Maak een steriele chirurgische ruimte onder een operatiemicroscoop. Verzamel gesteriliseerde chirurgische apparatuur(tabel 1).</li>
	<li>Verdoven de pup via onderkoeling: wikkel de pup in gaas om direct huidcontact met ijs te voorkomen en begraaf het in een ijsbed voor ongeveer 3-4 min. Controleer onderkoeling van de muizen periodiek door het uitvoeren van een teen knijpen. Neonaten tolereren onderkoeling goed, echter, langdurige blootstelling aan onderkoeling kan leiden tot bevriezing en daaropvolgende mortaliteit.</li>
	<li>Eenmaal verdoofd, plaats de muis op het chirurgische gebied in de supine positie, het vastzetten van de armen en benen met tape. Steriliseren van het chirurgische gebied van de muis met een antiseptische oplossing.</li>
	<li>Zoek de onderste borst regio en maak een dwarse incisie in de huid met kleine ontleden schaar. Om het chirurgische zicht van de ribben te verbreden, scheidt u de huid van de spier door de huid voorzichtig op te tillen met een paar verbandtangen en zachtjes tegen de intercostale spieren te drukken met de kleine schaar in de gesloten positie.</li>
	<li>Zoek de vierde intercostale ruimte(figuur 1A)en maak een kleine, oppervlakkige punctie met behulp van scherpe tangen, oppassen dat u geen inwendige organen doorboort. Voer een botte dissectie door het verbreden van het gebied tussen de intercostale spieren met dressing tangen. Een goede anatomische positionering van de incisie is essentieel voor de juiste toegang tot het hart.</li>
	<li>Leid het hart voorzichtig uit de borstholte door een vinger te plaatsen en toenemende druk aan de linkerkant van de buik toe te passen terwijl u de intercostale ruimte openhoudt met verbandtangen(figuur 1B). Zodra het hart buiten de borst is, verwijder de dressing tangen, verlichten de druk, en laat het hart te rusten op de intercostale spieren.</li>
	<li>Zoek de LAD als het gebied van het hart dat minder gepoold bloed heeft en zich in de juiste anatomische positie bevindt(figuur 1C). De LAD kan alleen worden gezien onder de microscoop als het hart wordt benaderd binnen een paar minuten na het begin van de operatie.</li>
	<li>Voer LAD-ligatie uit door de LAD te hechten met een 6-0 hechting(figuur 1D). Bind twee keer een vierkante knoop om een hartinfarct te veroorzaken (figuur 1E). De diepte van de hechting in het myocardium kan variëren, maar een goede anatomische positionering van de LAD-ligatie is cruciaal voor reproduceerbaarheid. Bij het ligaturen van de LAD, moet de hechting strak worden getrokken, maar zorgvuldig om de LAD niet te verbreken. Blancheren aan de top van het hart zal onmiddellijk worden gezien (Figuur 1E)</li>
	<li>Laat het hart terug glijden in de borstholte; dit proces kan voorzichtig worden vergemakkelijkt met dressing tangen. Hecht de ribben samen met een chirurg knoop gevolgd door een vierkante knoop, met behulp van stompe tangen om de bovenste set van ribben te tillen, terwijl het passeren van een 6-0 hechting door de bovenste en onderste set van ribben.</li>
	<li>Verwijder de tape die werd gebruikt om de achterpoten van de pup te beveiligen.</li>
	<li>Hecht de huid aan elkaar door het plaatsen van een kleine hoeveelheid huidlijm op de bovenbuik. Pak vervolgens de huid van de onderbuik met fijne tangen en bedek het blootgestelde borstgebied. Beperk de hoeveelheid overtollige lijm die overblijft op de pups, omdat dit de kans op afstoting en kannibalisme door de moeder kan verhogen.</li>
	<li>Onmiddellijk vergemakkelijken het herstel van anesthesie door het plaatsen van de pup op een verwarmingskussen ingesteld op middelhoog vuur. Schakel periodiek de plaatsing van de neonaten om alle delen van het lichaam gelijkmatig op te warmen.</li>
	<li>Laat het neonaat 10-15 min direct op het verwarmingskussen blijven.</li>
	<li>Maak het restbloed schoon en lijm met een alcoholdoekje.</li>
	<li>Bedek buitenlandse geuren op neonaten door het hele lichaam te wrijven met beddengoed uit de oorspronkelijke kooi. Plaats de pup in de kooi aan de verwarmde kant, terwijl andere operaties worden uitgevoerd.</li>
	<li>Zodra alle operaties zijn voltooid en pups zijn warm en mobiel, breng het nest samen met het originele nestmateriaal naar de kooi van de moeder.</li>
	<li>Controleer de muizen gedurende 30-60 min na de operatie en kijk uit voor de acceptatie van de pups door de moeder te laten nestelen en/of verzorgen.</li>
	<li>Controleer de muizen de ochtend na de operatie. Als moeder bedroefd is en de pups niet heeft genest, overweeg dan een pleegmoeder voor de pups.</li>
</ol>2. Clearing the Mouse Heart with Passive CLARITY21,22,23
<ol><li>Verdoven de muis met isoflurane. Voer een teensnufje uit om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is.</li>
	<li>Plaats de muis op een schoon, chirurgisch gebied in de supine positie, het vastzetten van de armen en benen met tape.</li>
	<li>Handhaven isoflurane sedatie op de muis met behulp van een neuskegel totdat het hart wordt geëxtraheerd.</li>
	<li>Open de onderste borst door de vacht net onder het xiphoid-proces te houden met weefseltangen en maak een incisie over de breedte van de ribbenkast met behulp van de grote ontledende schaar.</li>
	<li>Snijd naast de distale delen van de ribbenkast met chirurgische schaar.</li>
	<li>Stel de membraanspier bloot door het xiphoid-proces met weefseltangen te grijpen. Maak het middenrif los met gebogen tangen.</li>
	<li>Met behoud van een greep van het xiphoid proces, trek het weefsel cranially totdat het kloppende hart toegankelijk is.</li>
	<li>Grijp het hart aan de basis met gebogen tangen en ontleed het hart uit de borstholte door het snijden van de aorta en superieure vena cava met iridectomie schaar.</li>
	<li>Terwijl het hart nog klopt, plaats het hart in een petrischaaltje gevuld met PBS, zodat het hart pompen uit het bloed binnen als het blijft kloppen. Hartinfarct kan worden bevestigd door te controleren of de plaatsing van de hechting is in de juiste anatomische positie voor LAD ligatie.</li>
	<li>Knijp voorzichtig in het hart met tangen om het hart het resterende bloed te laten verdrijven.</li>
	<li>Breng het muishart over in een wegwerp 2,5 mL glazen schil flacon met 2 mL PBS. Was het resterende bloed weg door het hart op een shaker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) meerdere keren uit te broeden. Wijzig de PBS-oplossing telkens totdat PBS duidelijk blijft.</li>
	<li>Gooi de PBS weg en vul de flacon met 2 mL koude 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 4 uur bij RT (figuur 2A).</li>
	<li>Gooi na incubatie de PFA en de flacon weg met 2 mL PBS. Was het hart op een shaker voor 10 minuten op RT. Herhaal de wasstap twee maal, aftappen en vullen van de flacon met nieuwe PBS elke keer volledig weg te wassen overtollige PFA.</li>
	<li>Gooi PBS weg en vul de flacon met 2 mL van 4% acrylamide en 0,5% VA-044 oplossing. Incubeer 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Voer de volgende dag polymerisatie uit door de flacon gedurende 3 uur over te brengen naar een warmteblok van 37 °C.</li>
	<li>Breng het hart in een nieuwe glazen schaal flacon en herhaal stap 2.12 (PBS wascyclus).</li>
	<li>Verwijder PBS en vul de flacon met 2 mL clearingoplossing (tabel 2). Incubeer bij 37 °C tot het hart is gewist. Verander de oplossing en vul elke 2-3 dagen met verse Clearing Solution. Het opruimproces kan enkele weken duren (figuur 2B-C). LET OP: P1-harten duren meestal ongeveer 3-5 dagen, terwijl P21-harten bijna een maand kunnen duren voordat clearingoplossing-incubatie is voltooid.</li>
	<li>Gooi PBS weg en vul de flacon met 2 mL PBS en herhaal stap 2.12 (PBS wascyclus). Vul de flacon bij met verse PBS en broed 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Als immunostaining wordt uitgevoerd, slaat u stappen 2.21–2.22 over en gaat u over tot sectie 3 voor immunovlekken. Als u uitsluitend vertrouwt op endogene fluorescentie, gaat u verder met de stappen 2.21–2.22 en slaat u sectie 3 over.</li>
	<li>Verwijder PBS en wijzig de oplossing in Refractive Index Matching Solution (RIMS) (tabel 3). Incubeer 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Na incubatie kan het gewiste weefsel worden opgeslagen in RIMS-oplossing bij RT. Weefsel kan wit en ondoorzichtig lijken in het midden wanneer het voor het eerst in RIMS wordt overgebracht; weefsel moet transparant worden nadat het enkele weken bij kamertemperatuur in velgen is geïncubeerd(figuur 2D).</li>
</ol>3. Optioneel: Immunohistochemie Kleuring van het hele-mount muishart
<ol><li>Verwijder het gewiste hart uit de RIMS-oplossing en plaats in een schone 2,5 mL glazen flacon met 2 mL PBST (PBS met 0,1% Triton-X 100)</li>
	<li>Was het hart in PBST 3 keer op een orbitale rotator met 30 min incubaties bij RT.</li>
	<li>Blokkeer niet-specifieke antilichaambinding door het hart onder te dompelen in 2 mL van 20% blokkerende buffer (verdund in PBST) en uitte met rotatie gedurende 3 uur bij RT. Breng over naar 4 °C om 's nachts te bevlekken met rotatie. OPMERKING: Het blokkeren van buffer is gemaakt van normaal serum dat overeenkomt met de soort waarin het secundaire antilichaam is verhoogd.</li>
	<li>Was het hart in PBST 3 keer met rotatie voor 5 min incubaties bij RT.</li>
	<li>Dompel het hart onder in het primaire antilichaam (verdund in 2% blokkerenbuffer met PBST) en voorkom lichtblootstelling door het glasflesl in aluminiumfolie te wikkelen. Incubeer met rotatie 's nachts bij RT. OPMERKING: Vanaf dit punt moet aluminiumfolie continu worden gebruikt om de secundaire te beschermen tegen blootstelling aan omgevingslicht.</li>
	<li>Incubeer nog eens 24 uur met rotatie bij 4 °C.</li>
	<li>Na primaire kleuring herhaalt u stap 3.2 (lange PBST-wascyclus) om het ongebonden primaire antilichaam uit het weefsel te verwijderen. Verleng de was met een 's nachts incubatie met rotatie bij RT.</li>
	<li>Werken in een gebied met beperkte verlichting om secundaire blootstelling aan antilichaamlicht te voorkomen, dompel het hart onder in secundair antilichaam (verdund in 2% blokkerenbuffer met PBST) en incubeer met rotatie gedurende 3 uur bij RT. Breng over naar 4 °C om te bevlekken met 's nachts rotatie.</li>
	<li>Herhaal op de volgende dag stap 3.2 (lange PBST wascyclus) om ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.</li>
	<li>Vervang de oplossing door 2% blokkeringsbuffer (verdund in PBST). Verwijder resterende ongebonden antilichaam door 's nachts te wassen met rotatie bij RT.</li>
	<li>Controleer de volgende dag of overtollig secundair antilichaam is verwijderd met behulp van confocale microscopie. Breid de was indien nodig uit en vervang dagelijks de 2% blokkerende bufferoplossing. Ga zodra weinig tot geen niet-specifieke secundaire aanwezig is.</li>
	<li>Bewaar het met immuun gekleurde hart in PBS bij 4 °C.</li>
	<li>Vlak voor de volledig monterenmicroscopie, broed het hart in RIMS oplossing 's nachts op 37 °C. Verleng de incubatie met nog eens 24 uur als het weefsel nog steeds niet volledig is geklaard.</li>
	<li>Bewaar het volledig gerooide en immuungekleurde hart in RIMS bij RT.</li>
</ol>4. Visualiseren niet-myocyte populaties in 3D met Single-Photon Confocale Microscopie Imaging van de Gewist Muis Hart
OPMERKING: Als muisharten embryonaal worden geoogst, gaat u verder met punt 4.1. Voor muisharten die postnataal worden geoogst, gaat u verder met punt 4.2.
<ol><li>Beeldvorming van de gewistembryonale muis hart<ol>
<li>Vul de microscoop depressie dia met de PBS oplossing.</li>
		<li>Pak voorzichtig het gewiste hart op met gebogen tangen en plaats het weefsel op de glijbaan.</li>
		<li>Monteer de glijbaan met een glazen coverslip. Het weefsel kan nu worden afgebeeld onder een confocale microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging de gewistpostnatale muis hart<ol>
<li>Vul de helft van de kamer van de depressie dia met PBS oplossing. Om een kamer te creëren die groot genoeg is om een volwassen muishart te passen, werd een 3D-geprinte polypropyleendepressiedia op maat gemaakt (figuur 4).</li>
		<li>Pak voorzichtig het gewiste hart op met gebogen tangen en plaats het weefsel in de kamer. Vul het resterende volume van de kamer met PBS.</li>
		<li>Vul de kamer met PBS, zodat het oppervlak van de vloeistof vormt een koepel boven de bovenkant van de kamer. Monteer de dekselschuif. Het weefsel kan nu worden afgebeeld onder een rechtopstaande confocale microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li>
<li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+infarct+artery+location%2C+acute+total+coronary+occlusion%2C+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li>
<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li>
<li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li>
<li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553(2018).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomateria%22%5BJournal%5D)">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li>
<li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li>
<li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013(2016).</li>
<li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice%2C+A+Model+of+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).</li>
<li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754(2018).</li>
<li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li>
<li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li>
<li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Cel-cel interacties tussen cardiomyocyten en niet-myocyte populaties zijn een bepalende factor van de vraag of het hart fibrose zal ondergaan of herstellen na letsel. Ontdekkingen zijn gedaan waaruit blijkt dat een verscheidenheid van celtypes, waaronder zenuwen14, epicardiale cellen24, peritoneale macrofagen25, arterioles12,13, en lymfatische endotheelcellen26, spelen...

Het hart is al lang beschouwd als een post-mitotisch orgaan, maar recent bewijs toont aan dat cardiomyocyte vernieuwing optreedt in het volwassen menselijk hart op ongeveer 1% per jaar1. Echter, deze lage tarieven van cardiomyocyte omzet zijn onvoldoende om het enorme verlies van weefsel dat optreedt na letsel aan te vullen. Een hart dat heeft geleden een hartinfarct zal verliezen ongeveer een miljard cardiomyocyten, vaak dienen als een prelude op hartfalen en plotselinge hartdood2,3. Met meer dan 26 miljoen mensen getroffen door hartfalen wereldwijd, is er een onvervulde behoefte aan therapieën die de schade toegebracht door hart-en vaatziekten kan keren4.
Om deze kloof in de therapieën te overbruggen, zijn wetenschappers begonnen met het onderzoeken van evolutionair geconserveerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endogene regeneratie na letsel. Een model voor het bestuderen van zoogdier hartregeneratie is de neonatale muis. Binnen de week na de geboorte hebben neonatale muizen een robuuste regeneratieve respons na hartschade5. We hebben eerder aangetoond dat neonatale muizen hun hart kunnen regenereren via cardiomyocyte proliferatie na een apicale resectie5. Hoewel deze techniek hartregeneratie in de neonaten kan oproepen, mist de operatie klinische relevantie voor menselijke hartletsels. Om een menselijk letsel in het neonatale muismodel na te bootsen, hebben we een techniek ontwikkeld om een hartinfarct te veroorzaken door middel van een coronaire slagader occlusie6. Deze techniek vereist chirurgische ligatie van de linker voorste dalende slagader (LAD), die verantwoordelijk is voor het leveren van 40%-50% van het bloed aan de linker ventriculaire myocardium6,7. Zo resulteert de operatie in een infarct dat een aanzienlijk deel van de linker ventriculaire wand beïnvloedt. Deze schade aan het myocardium zal cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie bij neonaten stimuleren5.
De coronaire oclusie chirurgie biedt een zeer reproduceerbare en direct translationele methode om de innerlijke werking van hartregeneratie te ontdekken. De neonatale chirurgie parallellen coronaire slagader atherosclerose in het menselijk hart, waar accumulatie van plaque binnen de binnenwanden van de slagaders kan leiden tot een occlusie en de daaropvolgende hartinfarct8. Als gevolg van een leegte in therapeutische behandelingen voor patiënten met hartfalen, een occlusie in de LAD wordt geassocieerd met sterftecijfers tot 26% binnen een jaar na letsel9, en bijgevolg is genoemd de "weduwe maker." Vooruitgang in de therapieën vereist een model dat nauwkeurig de complexe fysiologische en pathologische effecten van cardiale letsel weerspiegelt. Ons chirurgisch protocol voor neonatale muis hartletsel biedt een platform waarmee onderzoekers de moleculaire en cellulaire signalen die zoogdier hartregeneratie signaal na letsel te onderzoeken.
Recent onderzoek benadrukt de dynamische relatie tussen de extracellulaire omgeving en het verspreiden van cardiomyocyten. Bijvoorbeeld, de postnatale regeneratieve venster kan worden uitgebreid door het verminderen van de stijfheid van de extracellulaire matrix rond het hart10. Biomaterialen uit de neonatale extracellulaire matrix kunnen ook hartregeneratie bevorderen bij volwassen zoogdierharten na hartletsel11. Ook de begeleidende cardiomyocyteproliferatie is een angiogene respons12,13; bijkomende slagadervorming die uniek is voor het regenererende hart van de neonatale muis bleek essentieel te zijn voor het stimuleren van hartregeneratie12. Bovendien heeft ons lab aangetoond dat zenuwsignalering cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie reproduceert via modulatie van groeifactorniveaus, evenals de ontstekingsreactie na letsel14. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om niet-myocyte celpopulaties te traceren in reactie op hartletsel. Om dit doel te bereiken, hebben we gebruik gemaakt van de Cre-lox recombination systeem in transgene muizen lijnen te nemen constitutieve of voorwaardelijke expressie van fluorescerende reporter eiwitten voor lineage tracing. Bovendien kunnen we geavanceerde methoden gebruiken om de kloonexpansiepatronen te bepalen met de Rainbow muislijn, die is gebaseerd op de stochastische expressie van de Cre-afhankelijke, multi-color fluorescerende verslaggevers om de kloonexpansie van gerichte celpopulaties te bepalen15. Gebruik te maken van afstamming traceren met de neonatale kransslagader occlusie chirurgie is een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de ingewikkelde cellulaire mechanismen van hartregeneratie.
Het bijhouden van de afstamming van fluorescerende gelabelde cellen met driedimensionale (3D) hele orgaanbeeldvorming is moeilijk te bereiken met behulp van traditionele sectioning en reconstructie techniek - vooral wanneer celpopulaties kwetsbaar zijn, zoals zenuwvezels of bloedvaten. Terwijl directe geheel-mount beeldvorming van het orgaan door optische sectioning oppervlakkige celpopulaties kan vangen, structuren die diep in het weefsel verblijven ontoegankelijk blijven. Om deze barrières te omzeilen, zijn weefselclearingtechnieken ontwikkeld om de ondoorzichtigheid van hele orgaanweefsels te verminderen. Onlangs zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt op clear lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-gebaseerde methoden, die vast weefsel wissen via lipide extractie16. Er worden ook stappen ondernomen om de brekingsindex te homogeniseren en vervolgens de lichtverstrooiing te verminderen terwijl imaging17. Een dergelijke methode is actieve helderheid, die lipideafbraak versnelt met behulp van elektroforese om het wasmiddel door het hele weefsel te penetreren18. Hoewel effectief, deze weefsel clearing methode vereist dure apparatuur en kan weefselschade veroorzaken, waardoor de aanpak onverenigbaar met fragiele celpopulaties zoals de hartzenuwen19. Zo maken we gebruik van de passieve CLARITY-benadering, die afhankelijk is van warmte om de penetratie van detergentia voorzichtig te vergemakkelijken, waardoor we helpen bij het behoud van ingewikkelde celstructuren20,21.
Passieve HELDERHEID wordt meestal beschouwd als minder efficiënt dan actieve HELDERHEID18,omdat de techniek vaak gepaard gaat met twee belangrijke obstakels: het onvermogen om de gehele orgaandiepte te wissen en de uitgebreide hoeveelheid tijd die nodig is om volwassen weefsels te wissen. Onze passieve CLARITY-aanpak overwint beide barrières met een snel clearingproces dat in staat is om neonatale en volwassen hartweefsel volledig te zuiveren. Onze passieve CLARITY tissue clearing techniek heeft een efficiëntie bereikt die de visualisatie van een verscheidenheid van hartcelpopulaties mogelijk maakt, met inbegrip van zeldzame populaties verspreid over het volwassen hart. Wanneer het gewiste hart wordt afgebeeld met confocale microscopie, kan de architectuur van celspecifieke patronen tijdens ontwikkeling, ziekte en regeneratie worden verlicht.

<table><tbody><tr><td>1-thioglycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene Sutures</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Polypropyleennaden</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>Half gebogen, gekarteld, 4 inch</td></tr><tr><td>Plakken pincet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Dissectie, 4.5 inch</td></tr><tr><td>Glazen flacon</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 x 35 mm flacon met dop</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Dichtheidsgradiëntmedium</td></tr><tr><td>Iridectomieschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2 mm snijrand</td></tr><tr><td>Grote dissectieschaar</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Recht, 6 inch</td></tr><tr><td>Naaldharing</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 inch</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scherp pincet</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>Fijne punt, recht, 4.25 inch</td></tr><tr><td>Kleine dissectieschaar</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm snijrand</td></tr><tr><td>Natriumazied</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselpincet</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>Medium weefsel, 1X2 tanden</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td></td><td>Wateroplosbare azo-initiator</td></tr></tbody></table>

het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via cleared heart driedimensionale beeldvorming

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Hart- en vaatziekten overtreft alle andere doodsoorzaken en is verantwoordelijk voor maar liefst 31% van de sterfgevallen wereldwijd. Deze ziekte manifesteert zich bij hartletsel, voornamelijk in de vorm van een acuut hartinfarct. Met weinig veerkracht na letsel, zal het eens gezonde hartweefsel worden vervangen door vezelig, niet-contractiele littekenweefsel en vaak een prelude op hartfalen. Om nieuwe behandelingsopties in regeneratieve geneeskunde te identificeren, heeft het onderzoek zich gericht op gewervelde dieren met aangeboren regeneratieve mogelijkheden. Een dergelijk model organisme is de neonatale muis, die reageert op hartletsel met robuuste myocardiale regeneratie. Om een verwonding bij de neonatale muis te veroorzaken die klinisch relevant is, hebben we een operatie ontwikkeld om de linker voorste dalende slagader (LAD) te oconeren, waarbij een hartinfarct wordt weerspiegeld dat wordt veroorzaakt door atherosclerose in het menselijk hart. Wanneer gekoppeld aan de technologie om veranderingen bij te houden, zowel binnen cardiomyocyten als niet-myocytenpopulaties, biedt dit model ons een platform om de mechanismen te identificeren die hartregeneratie begeleiden. Het verkrijgen van inzicht in veranderingen in hartcelpopulaties na letsel eenkeer zwaar vertrouwd op methoden zoals weefselsectie en histologisch onderzoek, die beperkt zijn tot tweedimensionale analyse en vaak schade aan het weefsel in het proces. Bovendien missen deze methoden de mogelijkheid om veranderingen in cellijnen te traceren, in plaats daarvan bieden ze slechts een momentopname van de blessurerespons. Hier beschrijven we hoe technologisch geavanceerde methoden in lineage tracing modellen, hele orgaan clearing, en drie-dimensionale (3D) whole-mount microscopie kan worden gebruikt om mechanismen van cardiale reparatie op te helderen. Met ons protocol voor neonatale muis myocardiale infarct chirurgie, weefsel clearing, en 3D hele orgaan beeldvorming, de complexe trajecten die cardiomyocyte proliferatie induceren kan worden ontrafeld, onthullen nieuwe therapeutische doelen voor hartregeneratie.

Vaak zijn de twee meest uitdagende stappen begeleiden het hart uit de borstholte en ligating de LAD. Om deze stappen op te lossen, kunnen aanpassingen worden gedaan bij de plaatsing van de eerste punctie tussen de vierde intercostale spieren; als de punctie en de botte dissectie zich te dicht bij het borstbeen bevinden, kan het hart de borstholte mogelijk niet verlaten(figuur 1A).
Bovendien kan een verhoogde druk op de linkerbuik nodig zijn om dit...

Cardiomyocyte proliferatie na letsel is een dynamisch proces dat een symfonie van extracellulaire signalen van niet-myocyte celpopulaties vereist. Met behulp van afstamming strekken, passieve helderheid, en drie-dimensionale whole-mount confocale microscopie technieken, kunnen we analyseren de invloed van een verscheidenheid van celtypes op cardiale reparatie en regeneratie.

Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

De endogene hartregeneratie is een dynamisch proces waarbij meerdere celtypen in overleg samenwerken om een robuuste regeneratieve respons te monteren. Turen in het regeneratieve weefsel via 3D-beeldvorming van het gewiste hart in reactie op letsel kan helpen bij de reconstructie van de cellulaire dynamiek die deze hartregeneratieve reactie begeleiden. Ons protocol is speciaal ontworpen om cellen te volgen tijdens de ontwikkeling en regeneratie.We voorzien geen beperkingen in het breed toepassen van onze clearing-, kleur- en beeldvormingstechnieken op andere orgaantypen. Voor LAD-geïnduceerde coronaire occlusie steriliseert u eerst het chirurgische gebied van een verdoofd eendags-oude neonatale pup met antiseptische oplossing. Maak een dwarse huid incisie in de borst regio.Om de huid van de spier te scheiden, gebruikt u een paar verbandkrachten om de huid voorzichtig op te tillen terwijl u de schaar voorzichtig tegen de intercostale spieren drukt in een gesloten positie. Zoek de vierde intercostale ruimte en gebruik kleine tangen om een kleine oppervlakkige punctie te maken die ervoor zorgt dat de inwendige organen worden vermeden. Met behulp van stompe dissectie en de dressing tangen, verwijden het gebied tussen de intercostale spieren net tot een vinger kan worden toegepast op de linkerkant van de buik, terwijl het houden van de intercostale ruimte open met dressing tangen om voorzichtig begeleiden het hart uit de borstholte.Zodra het hart is geëxtraheerd, laat het hart rusten op de intercostale spieren en lokaliseren van de LAD als het gebied van het hart met minder gepoold bloed. Om een hartinfarct te veroorzaken, gebruik een 6-0 hechting om een vierkante knoop stevig rond het vat twee keer te binden zonder de slagader te verbreken. Blancheren aan de top moet onmiddellijk worden waargenomen.Het is belangrijk om consistent te blijven op de hechting plaatsing langs de LAD voor een soortgelijke infarct grootte. Dit wordt het beste bereikt door de toegang tot het hart snel, terwijl het bloed nog steeds stroomt door de slagaders. Wanneer de hechting is geplaatst, laat het hart terug glijden in de borstholte.Hecht de ribben samen met een chirurg en een vierkante knoop met behulp van stompe tangen om de bovenste set van ribben op te heffen tijdens het passeren van een 6-0 hechting door de bovenste en onderste set van ribben. Breng een klein volume van de huid lijm op de bovenbuik en gebruik fijne tang om de huid van de onderbuik positie over de blootgestelde borst regio. Plaats de pup vervolgens op een verwarmingskussen en voer de ligatie uit op het volgende dier.Wanneer alle operaties zijn uitgevoerd, terug te keren de warme en mobiele pups naar de huis kooi van de moeder. Voor passieve helderheid van het geoogste hartweefsel, 21 dagen postchirurgie na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen, plaats de muis op een schone chirurgische gebied in de supine positie en zet de ledematen met tape. Met behulp van weefsel tangen, pak de vacht net onder de xiphoid proces en maak een incisie verspreid over de breedte van de ribbenkast.Snijd naast de distale delen van de ribbenkast en gebruik de tangen om het xiphoïde proces op te heffen om het middenrif bloot te leggen. Maak het middenrif los met gebogen tangen en trek het weefsel cranially totdat het kloppende hart toegankelijk is. Gebruik de gebogen tangen om het hart aan de basis te grijpen en gebruik een iridectomieschaar om de aorta en superieure vena cava te snijden.Plaats het kloppende hart in een petrischaaltje PBS, zodat het hart alle bewaarde bloed eruit pompt. Het hartinfarct kan worden bevestigd door een correcte anatomische plaatsing van de LAD ligatie. Wanneer het hart stopt met kloppen, knijp dan voorzichtig het orgaan met tangen om het resterende bloed te verdrijven en breng het monster over in een wegwerp 2,5 milliliter glazen schaal flacon met twee milliliter PBS.Plaats de flacon minstens 30 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en verander de PBS-oplossing om de 10 minuten totdat de oplossing vrij van bloed blijft. Wanneer de PBS duidelijk is, vervang de PBS met twee milliliter koude 4%paraformaldehyde voor een incubatie van vier uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten van 10 minuten op de shaker met twee milliliter verse PBS per wasbeurt. Vul na de laatste wasbeurt de flacon met twee milliliter van 4%acrylamide aangevuld met 0,5%VA-044 oplossing voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.De volgende dag, plaats de flacon in een 37 graden Celsius warmteblok voor drie uur. Breng aan het einde van de polymerisatie het hart over in een nieuwe glazen schaal flacon en was het hartweefsel in twee milliliter verse PBS 10 minuten per keer dat de PBS aan het einde van elke incubatie wordt vernieuwd. Wanneer de PBS duidelijk is, vervang de wasbuffer door twee milliliter clearing oplossing.Broed het exemplaar enkele weken op 37 graden Celsius tot het hart helder is, waardoor de opruimoplossing om de twee tot drie dagen wordt vernieuwd. Wanneer het orgel helder is, was het exemplaar met PBS op de shaker zoals aangetoond voordat u de flacon bijvult met verse PBS voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende dag, vervang de PBS met VELGEN voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius.Aan het einde van de incubatie wordt het weefsel volledig geklaard. Het weefsel moet na enkele weken transparant worden. Voor beeldvorming van het gewiste postnatale muizenhart na hartinfarctinductie, vul de helft van een kamer van een op maat gemaakte depressieglijbaan met PBS en gebruik gebogen tangen om het gewiste hart zorgvuldig in de kamer over te brengen.Vul het resterende volume van de kamer met PBS. Vul vervolgens de kamer met PBS totdat het oppervlak van de vloeistof een koepel boven de bovenkant van de kamer vormt en monteer de afdekkingsdia voordat het weefsel wordt gebeeldt door confocale microscopie volgens standaard beeldvormingsprotocollen. Als de punctie en stompe dissectie te dicht bij het borstbeen liggen, kan het zijn dat het hart de borstholte niet kan verlaten.Als het hart niet gemakkelijk de holte verlaat, druk uitoefenen op de linkerbuik om het proces te vergemakkelijken. Complicaties kunnen optreden van het rusten van het hart op de intercostale spieren. Daarom is het belangrijk om de stompe dissectie tot een minimale grootte in een horizontale oriëntatie te houden, zodat de LAD een duidelijke visualisatie en toegankelijkheid mogelijk maakt.Merk op dat een oppervlakkige ligatie minder ruimte zal hebben voor aanpassing in de uiteindelijke hechtingsplaatsing en dat de hechting rond de LAD moet worden uitgevoerd met gecontroleerde gestage bewegingen. Tegen het einde van de clearing stap, moet het hele hart consequent ondoorzichtig zijn zonder verkleuring in het midden. Na een paar dagen in RIMS-oplossing bij kamertemperatuur, moet het hart volledig worden gewist en kan enige weefseluitbreiding worden waargenomen.Zoals waargenomen door tdTomato reporter eiwitexpressie, de hartzenuwen zijn vooral oppervlakkig met sommige populaties woonachtig in de epicardial laag. Belangrijk is dat de bevestiging van de reporter eiwitexpressie behouden blijft na het ondergaan van het duidelijkheidsprotocol zoals aangetoond. Clearing en imaging het 3D-hart biedt perspectief in de locatie en morfologie van hartcelpopulaties.Dit stelt ons in staat om nieuwe aspecten te identificeren in celpatronen en celcelinteracties.

capturing-cardiac-injury-response-targeted-cell-populations-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Een verfijnde methode van weefselopruiming werd ontwikkeld en toegepast op het volwassen muizenhart. Deze methode is ontworpen om dicht, autofluorescent hartweefsel te zuiveren, met behoud van gelabelde fibroblastfluorescentie toegeschreven aan een genetische reporterstrategie.

Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

Driedimensionale (3D) reconstructie van hartschade bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) maakt getrouwe kwantificering en co-lokalisatie van geassocieerde ziekte-beïnvloedende patronen mogelijk. Hier wordt een automatiseerbare lichtbladgeleide beeldvormingsbenadering geboden voor gelijktijdige meting van hartschade, risicogebied en immuuncelrespons.

Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie

De huidige 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) test introduceert een verfijnd TTC-kleuringsprotocol dat de analyse van myocardletsel met microscopische resolutie mogelijk maakt, waardoor hoogwaardige beelden worden geproduceerd die een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van infarctgrootte en levensvatbaarheid van cardiomyocyten op cellulair niveau mogelijk maken.

Een microscopische 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride-assay voor nauwkeurige en betrouwbare analyse van myocardschade

Leer hoe je de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties vastlegt via Cleared Heart driedimensionale beeldvorming. Deze methode met passive CLARITY en confocale microscopie helpt onderzoekers celgedrag tijdens hartregeneratie te volgen.

Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming

Meer video's verkennen