Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur
November 26th, 2019
Het doel van dit protocol is om temperatuur te gebruiken om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te regelen. Het voordeel van deze methode maakt het niet alleen mogelijk om stroomsnelheden in situ te reguleren, maar maakt ook dynamische controle mogelijk, zoals periodiek afstemmen van stroomsnelheden op en neer.
Actieve materie is gebruikt in verschillende toepassingen zoals moleculaire schaduwen. Om de toepassing naar een hoger niveau te tillen, moeten we het vermogen ontwikkelen om de actieve materie lokaal te controleren. Wij bieden een gebruiksvriendelijke methode die geen wijziging van de actieve vloeistof vereist.
Noch de noodzaak om het optische pad van de microscoop te wijzigen om de lokale controle van de actieve vloeistof te bereiken. Onze methode kan worden toegepast op een breed scala van systemen waar de belangrijkste reacties gehoorzamen aan de onjuiste wet, zoals de microtubbule zweefvliegen of enzym gebaseerde systemen. De opstelling omvat een watercirculatiesysteem.
Als er lekkages optreden, kan water de microscoop beschadigen. Daarom is het, voordat we ons protocol aannemen, belangrijk om ervoor te zorgen dat het systeem lekvrij is. Ons protocol vereist montage van het glasmonster op een temperatuurstadium.
Terwijl het manuscript de montageprocedure beschrijft, mist het mechanische subtiliteiten zoals het beveiligen van het monster aan het stadium. Het aantonen van de procedure, zal Teagan Bate, Edward Jarvis, en Megan Varney. Teagan en Edward zijn afgestudeerde studenten, en Megan is een student van een laboratorium.
Om actieve vloeistoffen in een Eppendorf buis voor te bereiden, meng 16 punt zeven microliters van acht milligram per milliliter microtubuli met zes punt zeven microliters van een punt acht micromolar kinesin motor clusters, en een punt een microliter van 500 millimolar DTT in hoogzout M2B. Bundel microtubuli door toevoeging van 11 punt vier microliters van zeven procent gewicht in gewicht polyethyleenglycol. Activeer kinesinemotoren door twee punt acht microliters van 50 millimolar ATP toe te voegen.
Houd de ATP-concentraties op peil door twee punt acht microliter stock pyruvaat kinase/lactaat dehydrogenase toe te voegen en 13-punts drie microliters van 200 millimolar fosfosfovaavaat. Verminder de foto bleken effect door het toevoegen van 10 microliter van 20 millimolar Trolox, een punt een microliter van drie punt vijf milligram per milliliter catalase, een punt een microliter van 20 milligram per milliliter glucose oxidase, en een punt een microliter van 300 milligram per milliliter glucose. Volg de beweging van de vloeistof door het toevoegen van een punt zes microliters van nul punt nul twee vijf procent volume volume door volume tracer deeltjes.
Voeg m2B met hoogzout toe om een totaal volume van 100 microliter te bereiken. Spoel vervolgens een polyacrylamide gecoate glazen glijbaan en dek slip met DI water. Droog de glazen met lucht onder druk.
Plaats de glazen op een schoon, plat oppervlak. Snijd een drie millimeter breed kanaal in de wasfilm. De totale breedte is dezelfde breedte als de glazen afdekbrief op 20 millimeter.
Steek de was tussen de dia en de cover slip om een flow cell kanaal voor vloeistof te vormen. Kleef het glas aan de wasfilm door het glaswascomplex op een 80 graden Celsius-hete plaat te plaatsen om de was te smelten. Druk tijdens het smelten voorzichtig op de afslag met een pipettenpunt om de wasfilm gelijkmatig aan de glasoppervlakken te hechten.
Na hechting koelt u het glascomplex af tot kamertemperatuur. Laad de voorbereide actieve vloeistoffen onmiddellijk naar het stroomkanaal met de pipetpunt schuin verwijderd van de kanaalopening en in contact met het glazen schuifoppervlak. Verzegel het kanaal met UV-lijm.
Na het bouwen van een temperatuurregelingsinstelling plaatst u het actieve vloeistofmonster op het saffieroppervlak met de schuifzijde die het oppervlak bereikt. Zet de glazen schuif met papiertape vast. Bevestig de ThermoSensor met kopertape aan het oppervlak van de afdekslip.
Om de setup te monteren op een microscoop stadium, met de cover slip schuif naar de doelstellingen, zet de setup met microscoop stadium naaldklemmen. Zet de temperatuurregelaar en de aquariumpomp aan. Volg de richtlijnen van de fabrikant om de doeltemperatuur in te stellen.
Schakel temperatuurregeling in. En neem temperatuurgegevens van ThermoSensor op. Beeld het monster met een constant tijdsinterval op een fluorescerende microscopie die is uitgerust met een GFP-filterkubus om de Alexa 488-gelabelde tracerdeeltjes in de actieve mix te controleren.
Pas het tijdsinterval aan om de verplaatsing van de tracer tussen frames binnen negen pixels te laten liggen. Voor beeldvormende tracers die zich met 10 micrometer per seconde bewegen, met behulp van een viervoudige doelstelling, wordt het tijdsinterval aanbevolen om één tot vijf seconden te zijn. Sla de afbeeldingen op als TIF-bestanden, geef de bestanden een naam op basis van framenummer en bewaar ze in een aparte map.
Voor deze kinesine gedreven microtubuli gebaseerde actieve vloeistoffen, werd de temperatuur gecontroleerd op 10, 20, 30, en 40 graden Celsius. De temperatuurschommelingen waren vier uur lang binnen nul punt 1 tot 3 graden Celsius, wat de stabiliteit en betrouwbaarheid van deze temperatuurregelingsopstelling aantoonde. De tracers werden om de twee seconden afgebeeld, wat de sequentiële beelden mogelijk maakten voor het volgen van traceertrajecten.
De gemiddelde snelheden gemeten op 20 tot 36 graden Celsius, bleek bijna tijd onafhankelijk op nul tot twee uur. Waar bij 10 en 40 graden Celsius, de gemiddelde snelheden vervallen snel veroorzaakt door microtubuli depolymerization onder de 16 graden Celsius en de kinesine clusters defect boven 36 graden Celsius respectievelijk. Toen de systeemtemperaturen elke 30 minuten tussen de 20 en 30 graden Celsius werden afgewisseld, versnelden niet alleen de gemiddelde snelheden van de actieve vloeistoffen en vertraagden ze dienovereenkomstig, maar reageerden ze ook binnen 10 seconden op de temperatuurverandering.
Actieve vloeistoffen beginnen te defect raken, wanneer gekoeld onder 16 of verwarmd boven 36 graden. Dus bij het manipuleren van de temperatuur controller, zorg ervoor dat de temperatuur tussen de 16 en 36 graden. Het vermogen om actieve vloeistof lokaal af te stemmen, maakt het mogelijk om de vloeistofkracht te sturen, zoals het leveren van ladingen van punt A naar punt B of het ontwikkelen van een microfluidity-apparaat dat geen fysieke klep vereist.
De acrylamide die wordt gebruikt om glaswerk te coaten is een neurotoxine dat via de huid kan absorberen. Draag de juiste beschermende apparatuur zoals handschoenen, labjassen en veiligheidsbrillen om risico's te minimaliseren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont een methode om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te beheersen met behulp van temperatuur. Deze aanpak maakt in situ regulering en dynamische afstemming van stroomsnelheden mogelijk.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Actieve materie
- Vloeistofdynamica
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Actieve materie heeft toepassingen in verschillende gebieden, inclusief moleculaire schaduwen.
- Lokale controle van actieve vloeistoffen is essentieel voor het bevorderen van deze toepassingen.
- De methode vereist geen wijzigingen aan de actieve vloeistof.
- Het vermijdt ook veranderingen in de optische pad van de microscoop.
Doel van de Studie
- Om een eenvoudige methode voor lokale controle van actieve vloeistoffen te ontwikkelen.
- Om de bruikbaarheid van actieve materie in wetenschappelijke toepassingen te verbeteren.
- Om een veelzijdige aanpak te bieden die op verschillende systemen toepasbaar is.
Gebruikte Methoden
- Implementatie van een watercirculatiesysteem.
- Temperatuurmanipulatie om stroomsnelheden te beheersen.
- Toepassing van de methode op systemen die volgens de foutieve wet gehoorzamen.
- Gebruik in microtubulus glij-assays en enzym-gebaseerde systemen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle regulering van stroomsnelheden in situ.
- Dynamische controle van stroomsnelheden bereikt door temperatuuraanpassingen.
- Methode toepasbaar op een breed scala aan actieve materie systemen.
- Geen wijzigingen nodig voor de actieve vloeistof of microscoopopstelling.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak om actieve vloeistoffen te beheersen.
- Het verbetert de potentiële toepassingen van actieve materie in onderzoek.
- Deze methode zou kunnen leiden tot vorderingen in verschillende wetenschappelijke gebieden.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
