Name: Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocytencultuur voor het bestuderen van matrix-cel metabole overspraak. Dit model ondersteunt onderzoek naar adipogene differentiatie en weefselhomeostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa en Retha Geiss voor hulp bij studie coördinatie. SEM werd uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Dit project werd gesteund door NIH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans affaires Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot en haalbaarheids subsidie van het Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteranen Administratie VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Figuur 4 van dit manuscript werd oorspronkelijk gepubliceerd in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1; 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, en is gereproduceerd met toestemming van Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Voor toestemming om dit materiaal te hergebruiken, gaat u naar http://global.oup.com/academic/rights.

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
<li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li>
<li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+960%22%5BJournal%5D)">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li>
<li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR%CE%B3+and+adipocyte+size%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+human+adipose+tissue%3A+composition%2C+distribution%2C+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li>
<li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li>
<li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+fibrosis%2C+hypertrophy%2C+and+hyperplasia%3A+correlations+with+diabetes+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li>
<li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li>
<li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li>
<li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Patholology%22%5BJournal%5D)">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
<li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Macedonian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li>
<li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia%27s+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165(2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

De ECM-adipocyte cultuur model biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontleden van de individuele rollen van ECM en cellen in het dicteren van Ultimate tissue fenotype. Het ECM-isolatie protocol is vrij reproduceerbaar, maar de variabiliteit in het decellularisatie proces kan worden waargenomen. De dag 3 delipidation stap is een cruciaal punt in het protocol. Bij de voltooiing van de nachtelijke extractie, moet delipidatie van de matrix worden aangetoond door de polaire oplosmiddel oplossing geel te worden, terwijl de m...

De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen een mechanische steiger voor weefsels, maar houdt ook in complexe Overspraak met cellen die erin wonen, reguleren van diverse processen die nodig zijn voor weefselhomeostase, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, signalering en metabolisme1. Terwijl gezonde ECM een essentiële rol speelt bij het behoud van de normale weefsel functie, is disfunctionele ECM betrokken bij meerdere ziekten2.
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in de pathogenese van metabole ziekten. Obesitas wordt geassocieerd met overmatige adipocyte hypertrofie en cellulaire hypoxie, defecten in adipocyte cellulaire metabolisme, en vetweefsel endoplasmisch reticulum en oxidatieve stress en ontsteking. Terwijl slecht begrepen, deze complexe processen samenspannen te beschadigen vetweefsel nutriënten buffercapaciteit, wat leidt tot nutriënten overloop van vetweefsel, toxiciteit in meerdere weefsels, en systemische metabole ziekte3,4 ,5. De opeenvolging van gebeurtenissen en specifieke mechanismen die ten grondslag liggen aan vetweefsel falen zijn slecht begrepen, maar wijzigingen in adipeus weefsel ECM zijn betrokken. De samenstelling van de ECM is veranderd in vetweefsel in menselijke en muriene obesitas, met verhoogde afzetting van ECM-eiwitten samen met kwalitatieve biochemische en structurele verschillen in de vetweefsel-ECM geassocieerd met menselijke metabole ziekte, waaronder type 2 diabetes en hyperlipidemie6,7,8,9,10,11.
Ondanks deze observaties, de rol van adipeus weefsel ecm in bemiddelen vetweefsel dysfunctie is niet goed gedefinieerd. Dit is deels te wijten aan een gebrek aan Tractable experimentele modellen die een dissectie van de specifieke rollen van ECM en adipocytes in de regulering van Ultimate adipeus weefsel functie toestaan. ECM-adipocyten cultuur simuleert beter de in vivo omgeving van native vetweefsel in ten minste twee opzichten. Ten eerste biedt de ECM-cultuur een moleculaire omgeving die lijkt op inheems vetweefsel, inclusief inheemse collagens, Elastinen en andere matrix proteïnen die afwezig zijn in de standaard 2D-cultuur. Ten tweede is de cultuur op 2D-plastic aangetoond dat het adipocyten metabolisme verandert via mechanische effecten als gevolg van een verminderde elasticiteit van kunststof substraat12, die de ECM-cultuur elimineert.
Methoden om biologische steigers te engineeren door isolatie van ECM uit decellularized vetweefsel en andere weefsels zijn bestudeerd in de context van regeneratieve en reconstructieve geneeskunde en weefsel engineering13,14, 15,16,17,18. We hebben eerder de methodologie gepubliceerd waarin we deze methoden hebben aangepast om een in vitro 3D-model van humane ECM-adipocyten cultuur te ontwikkelen, met behulp van ECM en adipocyten stamcellen (preadipocytes) afgeleid van humane viscerale vetweefsels11. In dit artikel beschrijven we deze methoden in detail. De decellularisatie procedure voor menselijk vetweefsel is een vierdaags proces waarbij mechanische en enzymatische behandelingen worden uitgevoerd om cellen en lipide te verwijderen, waardoor een biologische steiger blijft die kenmerken van het weefsel behoudt waaruit het is afgeleid. Decellularized ECM ondersteunt adipogenic differentiatie van menselijke preadipocytes, en wanneer gereconstitueerd met adipocytes, onderhoudt microarchitectuur en biochemische en ziekte-specifieke kenmerken van intact vetweefsel en houdt zich bezig met metabole functies die kenmerkend zijn voor inheemse vetweefsel. Deze matrix kan alleen worden bestudeerd of herplaatst met cellen, het toestaan van studie van interacties en overspraak tussen de cellulaire en extra-cellulaire componenten van vetweefsel.

<table><tbody><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL cryovial tube</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m nylon mesh filter</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3&rsquo;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plates</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP231</td><td>Ontvlambaar, bijtend</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#G5882</td><td>Bijtend</td></tr><tr><td>Hexamethyldisalizane</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#440191</td><td>Ontvlambaar, bijtend</td></tr><tr><td>Human insulin solution</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A415</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5627</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td>Bijtend</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#93482</td><td>Bijtend</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation Fluid</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation Counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors, forceps, sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorensen's phosphate buffer</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>T-150 culture flask</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homo

een menselijke 3d-extracellulaire matrix-adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole overspraak

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

De extracellulaire matrix (ECM) speelt een centrale rol bij het reguleren van weefselhomeostase, het betrekken van Overspraak met cellen en het reguleren van meerdere aspecten van cellulaire functie. De ECM speelt een bijzonder belangrijke rol in de vetweefsel functie bij obesitas, en veranderingen in vetweefsel ECM afzetting en samenstelling zijn geassocieerd met metabole ziekte bij muizen en mensen. Tractable in vitro-modellen die een dissectie van de rollen van de ECM mogelijk maken en cellen die bijdragen aan het wereldwijde weefsel fenotype zijn schaars. We beschrijven een roman 3D in vitro model van menselijke ECM-adipocyte cultuur die het mogelijk maakt studie van de specifieke rollen van de ECM en adipocytes in het reguleren van vetweefsel metabole fenotype. Humaan vetweefsel is decellularized te isoleren van ECM, die vervolgens wordt herbevolkt met preadipocytes die vervolgens worden gedifferentieerd binnen de ECM in volwassen adipocytes. Deze methode creëert ECM-adipocyten constructies die metabolisch actief zijn en kenmerken van de weefsels en patiënten waarvan zij afkomstig zijn, behouden. We hebben dit systeem gebruikt om ziekte-specifieke ECM-adipocyten overspraak in menselijk vetweefsel aan te tonen. Dit cultuur model biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rollen van de ECM en adipocytes in het bijdragen aan wereldwijd adipeus weefsel metabole fenotype en maakt studie van de rol van de ECM in het reguleren van vetweefsel homeostase.

Bereiding van adipeus weefsel ECM, zaaien met preadipocytes, en in vitro differentiatie in volwassen adipocytes resulteren in duidelijke sequentiële morfologische veranderingen in weefsel die visuele beoordeling van de vooruitgang in het hele protocol mogelijk maakt (Figuur 1) . Preadipocyten die worden gebruikt om de ECM te zaaien, worden geïsoleerd met behulp van Collagenase-spijsvertering uit afzonderlijke BTW-monsters (Figuur 2</stron...

We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Ons protocol toont aan dat de ECM adipogene differentiatie kan bevorderen bij afwezigheid van klassieke adipogene bemiddelaars en is de eerste die ziektespecifieke regulatie van cellulair metabolisme door de ECM aantoont. Onze techniek biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rol van de ECM en adipocyten in vetweefsel metabolisme en laat studie van de rol van de ECM bij het reguleren van vetweefsel homeostase. Vergeleken met de standaard 2D-celcultuur, ons 3D-model zorgt voor meer robuust onderzoek en dissectie van cross-talk tussen adipocyten en vetweefsel ECM in de context van type 2 diabetes.We raden aan om te beginnen met kleinere monsters om te meten hoe goed het cellulair is. Houd in gedachten is er interpatient variabiliteit in hoe goed de cellen groeien en hoe goed het weefsel decellulariseert. Het is belangrijk om het weefsel voor en na elke stap te observeren om ervoor te zorgen dat het weefsel gedecellulariseerd raakt en om mogelijke verschillen tussen monsters te begrijpen.Na het verkrijgen van visceraal vetweefsel of BTW uit een operatie, bereid het voor opslag door het toevoegen van 5-10 gram van het weefsel tot 15-25 milliliter vriesbuffer oplossing in een 50 milliliter conische buis. Dompel het monster volledig onder en bewaar het op min 80 graden Celsius tot decellularisatie. Voor preadipocyte isolatie, plaats twee gram van een vers monster van intacte BTW in 20 milliliter collagenase type II oplossing, dan invoegen steriele schaar in de buis en grondig gehakt het weefsel.Eenmaal gehakt tot een fijne drijfmest, incubeer het in de collagenase oplossing op 37 graden Celsius op een orbitale shaker gedurende 60 minuten. Na de incubatie filtert u de resulterende verteerd door een nylon gaas van 100 micrometer in een verse conische buis van 50 milliliter. De verteerde moet een geel-oranje vloeistof met matige viscositeit en een kleine hoeveelheid resterende strengen van onverteerd weefsel.Centrifugeren het monster op 270 keer g gedurende 10 minuten, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in twee milliliter van 1X RBC lysing oplossing met een pipet. Incubeer de oplossing voor een minuut bij 25 graden Celsius, voeg dan 10 milliliter van 15%FBS DMEM F12 en centrifuge het op 270 keer g gedurende 10 minuten. Om de ECM voor te bereiden, vries/ontdooi het eerder bevroren BTW-monster tot 37 graden Celsius door het gedurende 20 minuten in een voorverwarmd waterbad uit te broeden met periodieke zachte handmatige agitatie.Eenmaal ontdooid, breng het weefsel terug naar min 80 graden Celsius gedurende 20 minuten en herhaal het vries/dooiproces drie keer eindigend met ontdooien. Gebruik steriele tangen om het BTW-monster over te brengen naar een verse conische buis van 15-25 milliliter enzymatische oplossing 1 om ervoor te zorgen dat het monster volledig is ondergedompeld. Dan incubeer het 's nachts op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 130 RPM.Op de volgende dag, was het monster drie keer met 15-25 milliliter spoelbuffer oplossing, gieten van de oplossing na elke wasbeurt. Breng het monster naar een verse buis van 50 milliliter met 15-25 milliliter enzymatische oplossing 2 en incubeer het 's nachts uit. Herhaal de wasbeurten met de spoelbufferoplossing en breng het monster over naar een verse buis met 15-25 milliliter polaire oplosmiddelextractieoplossing.Incubeer het monster 's nachts tijdens het schudden. Na incubatie met de polaire oplosmiddeloplossing is het belangrijk om het monster te onderzoeken op lipideverwijdering. Als het grootste deel van de lipide niet wordt verwijderd, kan het nodig zijn om deze stap te herhalen.Er kan een kortere incubatietijd worden gebruikt. Breng het monster na de incubatie over in een verse buis met 15-25 milliliter spoelbufferoplossing en was het monster drie keer op de shaker. Was vervolgens het monster drie keer met 70% ethanol oplossing, gieten van de ethanol na elke wasbeurt.Was het monster eenmaal met opslagoplossing en gebruik steriele tangen om over te brengen naar een verse buis met 15-25 milliliter opslagoplossing om het volledig onder te dompelen. Het monster kan vervolgens maximaal een maand bij vier graden Celsius worden bewaard. De isopropanol en ethanol zijn ontvlambaar en moeten op kamertemperatuur zijn en in brandbaar afval worden afgevoerd.Elk menselijk afval moet gescheiden van het gebruikelijke biohazardafval worden verwijderd. Breng de opgeslagen ECM-fragmenten over naar afzonderlijke putten van een 24-putplaat met steriele tangen die zoveel fragmenten toevoegen als nodig is voor de geplande downstream-tests. Was ze drie keer met 500 microliters van 70% ethanol op een orbitale shaker en hydrateer ze vervolgens door ze drie keer te wassen met PBS.Gebruik steriele schaar om de ECM in 100 milligram fragmenten te snijden. Plaats elk fragment in een put van een 24-put plaat en incubeer de plaat op 25 graden Celsius gedurende 15 minuten om overtollige PBS te extruderen uit de fragmenten. Verwijder vervolgens voorzichtig eventuele overgebleven PBS uit de putten met een pipet.Zaad elk fragment met 20 microliters preadipocyte cel suspensie door pipet de cellen rechtstreeks in de ECM. Plaats de pipetpunt in de ECM en zet deze voorzichtig in het midden van de matrix om ervoor te zorgen dat de celsuspensie niet overloopt en aan de onderkant van de put terechtkomt. Als de celsuspensie overstroomt van de ECM, verwijdert u de pipetpunt van die locatie en plaatst u deze elders in de ECM.Na het zaaien van cellen, incubeer de ECM gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius. Vul elk goed met 500 microliters groeimedia om de gezaaide ECM-fragmenten te bedekken. Kweek de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 72 uur.Na 72 uur, zorgvuldig aspirate de groeimedia zonder verstoring van de ECM fragment. Voeg 500 microliters van differentiatie media en cultuur van de cellen voor 14 dagen het veranderen van de media om de twee tot drie dagen. Controleer op differentiatie met behulp van lichte microscopie.Cellen zullen zich ophopen lipiden, bruin-geel van kleur en worden meer bolvormig als ze onderscheiden. De bereiding van vetweefsel ECM, zaaien met preadipocyten en in vitro differentiatie in rijpe adipocyten werd gecontroleerd met scanning elektronenmicroscopie die decellularisatie van ECM en daaropvolgende herkapseling van lipide met adipocyten bij herzaaiing en differentiatie aan het licht bracht. Collageen 1 specifieke immunohistochemie van gedecellulariseerde ECM toonde onderhoud van collageen micro architectuur, terwijl Olie Red-O kleuring van levende en vaste 3D ECM-adipocyte constructies toonde lipide met adipocyten.De in ECM gedifferentieerde adipocyten werden gescreend op adipogene genen met behulp van kwantitatieve real-time PCR, waaruit bleek dat deze genen in de gedifferentieerde cellen zijn opgevuld ten opzichte van ongedifferentieerde preadipocyten die in ECM worden gekweekt. Het volledige verschil in transcriptieniveaus wordt weergegeven. Vier combinaties van ECM en adipocyten van diabetische en niet-diabetische proefpersonen werden onderworpen aan metabole fenotypering.Verminderde glucose opname in lipolytische functie werd ontdekt in constructies van diabetische weefsels. Belangrijk is dat niet-diabetische ECM de insuline-gestimuleerde glucoseopname en lipolytische capaciteit in diabetische adipocyten redt. Verontreiniging van de geïsoleerde preadipocyten, het gedecellulariseerde weefsel en de opnieuw gezaaide ECM is niet ongewoon.Steriliteit moet zorgvuldig worden gehandhaafd in het hele protocol.

a-human-3d-extracellular-matrix-adipocyte-culture-model-for-studying

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).

Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay

Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.

Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

Dit protocol beschrijft de fabricage van 3D-botconstructies met behulp van menselijke osteocyten die zijn ingebed in methacrylgelatine (GelMA) hydrogels, aangevuld met gedecellulariseerde extracellulaire matrix. De methode is goedkoop, schaalbaar en compatibel met basislaboratoriumapparatuur, en biedt een translationeel platform voor het bestuderen van processen van musculoskeletale ziekten.

Een 3D-botkweekplatform met menselijke osteocyten en gedecellulariseerde extracellulaire matrix voor het modelleren van musculoskeletale aandoeningen

Met een ex vivo explant-model worden kleine stukjes van het rostrale deel van visceraal wit vetweefsel van magere muizen 7–10 dagen gekweekt, waardoor ontsteking in vetweefsel tijdens vetrijke voeding kan worden geïnduceerd en bestudeerd.

Een ex vivo muismodel voor vetrijke vetachtige vetweefselontsteking

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Leer een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocytencultuur voor het bestuderen van matrix-cel metabole overspraak. Dit model ondersteunt onderzoek naar adipogene differentiatie en weefselhomeostase.

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

Meer video's verkennen