Analyse van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken door middel van cluster-geïnduceerde desorptie /Ionisatie massaspectrometrie
1 maart 2020
Neutraal SO2 clusters van lage kinetische energie (< 0,8 eV/bestanddeel) worden gebruikt om complexe oppervlaktemoleculen zoals peptiden of lipiden te desorberen voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie met behulp van een ionenvalmassaspectrometer. Er is geen speciale monstervoorbereiding vereist en real-time observatie van reacties is mogelijk.
Desorptie ionisatie veroorzaakt door neutrale SO2 clusters die we in het kort DINeC noemen, is een zachte en efficiënte desorptie ionisatie methode. We gebruiken het onder andere voor massaspectrometrie van biomoleculen, zoals peptiden en eiwitten. Als DINeC, desorptiemoleculen intact van de monsteroppervlakken, worden subtiele chemische veranderingen in deze moleculen gemakkelijk gedetecteerd in de massaspectra.
Het proces wordt geïllustreerd in de volgende simulatie. De inkomende clusters verbrijzelt door in-cluster oppervlak impact. De oppervlakte isotoop dipeptide wordt opgelost in een van de clusterfragmenten en gedesorpteerd door dit proces.
In het experiment wordt de bundel van SO2-clusters geproduceerd via supersonische expansie van een gepulseerd mondstuk. De moleculen die worden opgelost en geïoniseerd tijdens de impact van het clusteroppervlak worden overgebracht naar de ionenval voor massaspectrometrie. Typische massaspectra tonen alleen pieken op de MO-setwaarden van het intacte molecuul.
Het demonstreren van de procedure zal Karolin Bomhardt, en Pascal Schneider, twee promovendi in mijn laboratorium. Snijd voor standaardmonsters de substraten van siliciumwafers met een dikte van ongeveer 0,5 tot één millimeter in stukken van één bij één vierkante centimeter. Reinig de siliciumsubstraten in een ultrasoonbad van ethanol en aceton gedurende 15 minuten per stuk.
Droog de substraten in een stroom droog stikstofgas. Laat vervolgens vijf tot 30 microliter van de monsteroplossing op het substraat vallen. Afhankelijk van de dampspanning van het oplosmiddel, laat het monster drogen onder omgevingsomstandigheden of in een desiccator totdat alle oplosmiddel is verdampt en een droge film is gevormd.
Denk aan de eenvoudigste voorbereidingsregeling. Als voorbeeld, voor het onderzoek van highlighter inkt, gewoon een stip op het substraat oppervlak te trekken. Monteer de monsters op de monsterhouder met plakband of klemmen aangedraaid door schroeven.
Monteer bovendien een referentiemonster zoals een micrometer dikke folie van Angiotensin II op de monsterhouder. Druk vervolgens op Vent load lock om het laadslotsysteem te ventileren. Wacht vijf minuten, of tot de atmosferische druk is bereikt.
Open het laadslot en monteer de monsterhouder. Sluit het laadslot en pomp de laadslotkamer naar een druk onder twee keer 10 tot de negatieve vijf millibar. Open de klep naar de DINeC-kamer en breng de monsterhouder met de overdrachtsstang over naar de hoofdmanipulator.
Bevestig de monsterhouder aan de manipulator. Trek de overdrachtsstang in en sluit de klep tussen het laadslot en de DINeC-kamer. Open de klep tussen de gasfles en het mondstuk.
Pas de druk van het zwaveldioxide- en heliumgasmengsel bij de omtrek van het gasmengsysteem aan op 15 bar. Stel de positie van de manipulator in op de positie van het referentiemonster. Voor het meten van kationische massaspectra, stel het monster en het raster bias op plus 40 volt, en plus zeven volt respectievelijk.
Om het gepulseerde mondstuk en de iontrap massaspectrometer aan te drijven, stelt u de externe functiegenerator in op twee Hertz. Stel met de delaygenerator de vertraging in tussen het duidelijke valsignaal van de ionenvanger en het triggersignaal voor het gepulseerde mondstuk op vijf milliseconden. Selecteer in de Bruker-besturingssoftware op de pagina Modus van het hoofddialoogvenster de optie Verbeterde resolutie voor scanmodus.
Typ in M over Z 50 tot 3000 voor bereik, typ 0,1 milliseconden voor accumulatietijd, typ 10 cycli voor gemiddeld en selecteer voor polariteit positief voor de meting van kationische massaspectra en negatief voor het meten van anionische spectra. Zodra een druk onder de drie keer 10 tot de negatieve zes millibar is bereikt in de DINeC-kamer, start de meting. Stel de waarde M over Z in op de respectievelijke massa om het tijdsafhankelijke chromatogramsignaal te volgen.
Druk op Werken in de besturingssoftware. Begin met het opnemen van de metingen door op de knop Opnemen te drukken. Meet het testspectrum van een referentiemonster, zoals Angiotensin II gedurende ongeveer 300 seconden.
Optimaliseer de signaalintensiteit door aanpassing van de vertraging tussen het duidelijke valsignaal en het signaal dat het gepulseerde mondstuk activeert. Met de vertraging geoptimaliseerd, verplaats de manipulator naar de positie van het te meten monster. Klik op de knop Opnemen om massaspectra te verwerven gedurende de tijdspanne van belang.
Nadat de meting is voltooid, laadt u de desbetreffende gegevensset in het programma Gegevensanalyse zoals hier voor de referentiemeting wordt weergegeven. Selecteer de tijdspanne van belang in het chromatogram met de juiste knop van de muis. Het gemiddelde spectrum wordt weergegeven in een apart venster.
Klik op Het bestand exporteren als ASCII om het spectrum te exporteren als een gegevensbestand voor verdere verwerking in een programma naar keuze. Het DINeC massaspectrum van een Angiotensin II monster veranderde met de tijd als het monster werd verwarmd tot ongeveer 140 graden Celsius. Zodra de temperatuur de uiteindelijke waarde bereikte, daalde de piek van het aangevallen protinated molecuul bij M over Z gelijk aan 1047 en werden nieuwe pieken waargenomen.
Het proces wordt samengevat in deze drie grafieken. De extra pieken bij M over Z gelijk aan 932, 1012 en 1029 werden goed waargenomen. Analyse van de reactiekinetiek toont aan dat de entiteit met M over Z gelijk aan 1029 een tussenproduct is dat verder werd afgebroken in kleinere fragmenten naarmate de intensiteit eerst toenam en vervolgens afnam.
De belangrijkste kenmerken van DINeC zijn de zachte aard van het desorptieproces, de efficiëntie en de hoge oppervlaktegevoeligheid. Ze komen allemaal samen met de lage eisen met betrekking tot monsterbereiding. DINeC kan dus worden toegepast op een breed scala aan verschillende monsters, variërend van organische schorsmaterialen tot complexe oppervlakteadsorbaten in het submonolaaggebied.
In alle gevallen kan volledige chemische informatie in real time worden verkregen.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe desorptie-ionisatiemethode met behulp van neutrale SO2-clusters, genaamd DINeC, voor massaspectrometrische analyse van biomoleculen. De techniek maakt real-time observatie van chemische veranderingen in peptiden en eiwitten mogelijk zonder uitgebreide monstervoorbereiding.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Massaspectrometrie
- Biomoleculaire Analyse
- Oppervlaktechemie
Achtergrond
- DINeC is een zachte desorptie-ionisatiemethode.
- Het maakt de analyse van complexe oppervlaktemoleculen mogelijk.
- Real-time monitoring van reacties is mogelijk.
- Minimale monstervoorbereiding is vereist.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van DINeC voor massaspectrometrie aan te tonen.
- Om subtiele chemische veranderingen in biomoleculen te analyseren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor monstervoorbereiding en meting.
Gebruikte methoden
- Productie van SO2-clusters via supersonische expansie.
- Desorptie van moleculen door impact op het clusteroppervlak.
- Overdracht van geïoniseerde moleculen naar een iontrap-massaspectrometer.
- Real-time data-acquisitie en analyse van massaspectra.
Belangrijkste resultaten
- Massaspectra tonen intacte moleculaire pieken.
- Nieuwe pieken verschijnen naarmate de temperatuur tijdens de analyse stijgt.
- Reactiekinetiek onthult de vorming van intermediaire soorten.
- DINeC demonstreert een hoge oppervlaktegevoeligheid en efficiëntie.
Conclusies
- DINeC is een veelzijdige methode die toepasbaar is op diverse monsters.
- Het biedt uitgebreide chemische informatie in realtime.
- De geringe eisen voor monstervoorbereiding vergroten het nut van deze methode.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
DINeC maakt zachte, matrixvrije desorptie/ionisatie van complexe biomoleculen vanaf oppervlakken mogelijk, wat real-time monitoring van chemische modificaties ondersteunt zonder uitgebreide monstervoorbereiding. Deze mogelijkheid verbetert de targetvalidatie en het mechanistische risicomanagement in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, fragmentatievrije massespectra van peptiden en eiwitten te leveren met een gevoeligheid op sub-monolaarniveau. De compatibiliteit van de methode met ion trap MSn maakt gedetailleerde structurele elucidatie mogelijk, waardoor het voorspellend vertrouwen bij lead-identificatie en preklinische workflows wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door intacte moleculaire ionen en subtiele chemische veranderingen in peptiden en eiwitten te detecteren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van zachte desorptie die labiele modificaties behoudt, waardoor het aantal fout-negatieven in target engagement-studies wordt verminderd.
- Predictieve waarde: Levert kwantitatieve gegevens over de oppervlaktebezetting tot 0,1% van een monolaag, wat helpt bij de triage van portefeuilles op basis van target-abundantie en modificatiestatus.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert matrix-vrije, kwantitatieve massaspectra die een betrouwbare detectie van oppervlaktegebonden analyten mogelijk maken zonder ionisatiesuppressie.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay via consistente generatie van clusterstralen en ionenvangstoverdracht, waardoor variabiliteit tussen runs wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor diverse monstertypes, van organische extracten tot gemanipuleerde oppervlakken, wat de gereedheid voor high-throughput screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt real-time observatie van oppervlaktereacties mogelijk, zoals H/D-uitwisseling of thermische ontbinding, waardoor kinetische analyse van biomoleculaire stabiliteit mogelijk wordt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door continue chemische informatie te verschaffen van oppervlakte-adsorbaten naar bulkmoleculen onder identieke analytische condities.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Ondersteunt go/no-go-criteria door degradatie-intermediairen en reactiepaden te identificeren die de stabiliteit of effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen kunnen beïnvloeden.
Integratie van pipeline en workflow
DINeC integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor studies die oppervlakkige, real-time monitoring van biomoleculaire interacties of modificaties vereisen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door posttranslationele modificaties en ligand-geïnduceerde conformationele veranderingen op oppervlakken te detecteren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door reproduceerbare desorptie van intacte moleculen, wat kwantitatieve outputs levert voor hit-bevestiging en het in kaart brengen van structuur-activiteitsrelaties.
- Analytics: Levert massaspectra met een hoge resolutie en MSn-mogelijkheden waarmee teams moleculaire toestanden, modificatieplaatsen en fragmentatiepatronen onder verschillende condities kunnen vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door tijdsonafhankelijke chemische veranderingen in peptiden en eiwitten onder gecontroleerde thermische of chemische stress te monitoren.
- Enterprise Hergebruik: Functioneert als een herbruikbare analytische capaciteit over verschillende afdelingen heen, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd en consistentie van gegevens over projecten heen mogelijk wordt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door de moleculaire integriteit te behouden en de detectie van labiele soorten mogelijk te maken die verloren kunnen gaan bij intensere ionisatiemethoden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde parameters voor de clusterstraal en minimale monsterbehandeling, waardoor de technische variantie wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door matrixvereisten te elimineren en directe analyse van native monsters mogelijk te maken, wat de kosten voor verbruiksartikelen en de voorbereidingstijd verlaagt.
- Impact op portfolio: Informeert risicogecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling via real-time kinetische gegevens over oppervlaktereacties, wat helpt bij de vroegtijdige identificatie van risico's.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in clusterstraalgeneratie, de bediening van ionenvallen en principes van de oppervlaktewetenschap voor een optimale opstelling en data-interpretatie.
- Vereist toegang tot een gepulseerd mondstuksysteem, infrastructuur voor het hanteren van zwaveldioxide- en heliumgas, en een compatibele ionenvalkoppelspectrometer met MSn-mogelijkheden.
- Vraagt om standaardisatie tussen teams voor monsterbevestiging, substraatreiniging en droogprotocollen om oppervlaktehomogeniteit en een reproduceerbare desorptie-efficiëntie te garanderen.
- Omvat aanpassingen bij de overgang van modelpeptiden naar complexe native monsters of heterogene oppervlakken, waarbij optimalisatie van de oppervlaktebezetting noodzakelijk is.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van ultrahoog vacuüm en potentiële clusterfragmentatie-effecten bij hogere impactenergieën, die beheerst moeten worden om zachte desorptie te behouden.
