Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Intracellulaire bacteriën scheiden effector-eiwitten af in de gastheer die biologische paden kunnen manipuleren om de overleving van ziekteverwekkers te bevorderen. Het onthullen van gastheerdoelen van effectoren is essentieel voor het begrijpen van intracellulaire ziekteverwekkers zoals Chlamydia trachomatis. Gisttoxiciteit en suppressor schermen kunnen belangrijke inzicht geven met betrekking tot het natuurlijke biologische doel van bacteriële effector eiwitten en kan vooral nuttig zijn wanneer een bindende partner onbekend is.

We tonen de gist toxiciteit en suppressor testen hier voor screening voor Chlamydia trachomatis effector eiwitten, maar deze techniek is ook gebruikt voor het karakteriseren legionella pneumophila en Coxiella burnetii effectors. Begin met het inenten van vijf milliliter enkele drop-out bouillon met de enkele kolonie gist getransformeerd met de effector eiwit dat plasmide. Gebruik gist getransformeerd met de vector alleen als een negatieve controle en incubeer het entcuum 's nachts op 30 graden Celsius tijdens het schudden.

Voeg de volgende dag 180 microliter steriel water toe aan de A2 via A6-putten van een 96-putplaat. Vortex de nachtelijke cultuur en voeg 180 microliter gist toe aan goed A1. Verdun vervolgens de gist in de putten in serie met water. Gebruik een multi-channel pipet om vijf microliter van elke verdunning op enkele drop-out glucose en single drop-out galactose agar platen spot en incubaat de platen op 30 graden Celsius gedurende 48 uur.

Na de incubatie, visueel beoordelen toxiciteit door het vergelijken van de groei van gist uitdrukken van de effector eiwit geteeld op de galactose-bevattende media aan de groei van gist uitdrukken van de vector alleen. Inoculeren 100 milliliter van de enkele drop-out bouillon met een milliliter van de eerder bereidgist voorraad en incubeer het voor 16 tot 24 uur bij 30 graden Celsius met schudden op 150 RPM. Op de volgende dag, voeg de gehele 100 milliliter van de nachtcultuur aan 900 milliliter voorverwarmde enige drop-out bouillon toe en kweek de fles vier tot vijf uren bij 30 graden Van Celsius terwijl het schudden.

Na de incubatie, pellet de cultuur op 6.000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 250 milliliter steriel water. Herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.

Dan resuspend de pellet in 250 milliliter van een millimolar lithium acetaat. Pellet de cultuur door centrifugatie, verwijder het lithiumacetaat en zet de pellet opnieuw op in 9,6 milliliter van 50%PEG 3350. Voeg vervolgens transformatiereagentia toe zoals beschreven in het manuscript en pas het volume aan tot 15 milliliter met steriel water dat voorzichtig omkeert om te mengen.

Incubeer het mengsel op 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 750 microliter DMSO toe en broed in een waterbad bij 42 graden Celsius gedurende nog eens 30 minuten. Het toevoegen van de DMSO voor een hitteschok is cruciaal om een hoge transformatie-efficiëntie te bereiken.

Na de incubatie, pellet de gist door centrifugeren op 3,000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant en was de pellet met 10 milliliter steriel water herhaal dan de centrifugatie om de gist pellet. Resuspend de pellet in acht milliliter water.

Bepaal de transformatie-efficiëntie door het monster één tot 10 te verdunnen en 100 microliter van elke verdunning op dubbele drop-out agar te verdunnen. Dan plaat 200 microliter van het monster op dubbele drop-out galactose agar platen en de platen incuberen op 30 graden Celsius gedurende 48 tot 96 uur of totdat kolonies verschijnen. Zodra kolonies zijn verschenen, patch ze op dubbele drop-out galactose agar en broeden ze voor nog eens 24 tot 48 uur.

Gebruik een deel van de patch om vijf milliliter dubbele drop-out bouillon inenten en het inoculum 's nachts in te broeden op 26 graden Celsius met schudden bij 150 RPM. Voeg de volgende dag 180 microliter steriel water toe aan vijf putten van een 96-putplaat die begint met goed A2. Vortex de nachtelijke cultuur mix. Voeg 180 microliter gist toe om A1 goed te doen en verdun het serieel met behulp van het water in putten A2 tot en met A6. Spot vijf microliters van elke verdunning op enkele drop-out glucose en single drop-out galactose agar platen ervoor te zorgen dat de giftige effector alleen als een controle.

Broed de platen op 30 graden Celsius gedurende 48 uur en vergelijk de groei van de gist met toxische effector alleen met de groei van gist met de potentiële suppressor. Om suppressors te bevestigen die verminderde toxiciteit in vergelijking met de giftige effector alleen hebben aangetoond, isoleer het plasmid volgens manuscriptrichtingen en zet het opnieuw in de giftige gist. Inenting dubbele drop-out glucose bouillon met een kolonie van de transformatie plaat.

Incubeer het 's nachts en ter plaatse op dubbele drop-out glucose en galactose agar om onderdrukking van toxiciteit te bevestigen. Voorafgaand aan het uitvoeren van de gist suppressor scherm, de effector eiwitten van belang werden getest op toxiciteit in gist. Het eiwit van belang werd uitgedrukt in gist onder de controle van een galactose induceerbare promotor en de groei op galactose werd vergeleken met de groei op glucose.

Toen CT229 werd getest op toxiciteit, werden kleinere kolonies en groeionderdrukking waargenomen. Idealiter moet een twee tot drie log afname worden waargenomen om verder te gaan met gist suppressor schermen. De suppressor scherm werd uitgevoerd door het transformeren van de giftige stam met de gist genomische bibliotheek pYAP 13 en plating de transformatoren op galactose agar.

De verkregen suppressor klonen werden gespot op dubbele drop-out galactose agar om onderdrukking van toxiciteit te bevestigen. Suppressors pSup1 en pSup2 onderdrukten de toxiciteit van het effector-eiwit, terwijl pSup3 dat niet deed. Deze procedures vereisen zorgvuldige aandacht voor detail in aanvulling op kritische voorbereidende werkzaamheden, waaronder het hebben van grote hoeveelheden media en platen klaar voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment.

Zodra suppressors zijn geïdentificeerd, experimenten kunnen worden uitgevoerd om interacties met de effector van belang met inbegrip van pull downs, immunofluorescentie colocalisatie, effector knock-out of knockdown van host factoren geïdentificeerd in de schermen te verifiëren. De ontwikkeling van deze techniek voor Chlamydia-effectoren heeft gezorgd voor versnelde voorlopige karakterisering van effector-eiwitten en heeft geholpen om onze inspanningen te richten op het verduidelijken van de onderliggende moleculaire mechanismen die interacties met gastheerpathogen bemiddelen.