Name: Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer hoe je enteroiden isoleert uit muizenileum en celproliferatie en overleving kwantificeert met behulp van flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van geneesmiddel- en cytokine-effecten op darmepitheelcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 en 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University (KF-GN-202004). De Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030), en The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Dit werk wordt ook ondersteund door Tang Scholar van Soochow University.

Dit protocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) van soochow University.
1. Intestinale isolatie en cultuur
<ol><li>Isolatie van darmcrypten en enteroïdecultuur<ol>
<li>Euthanaser een 8 weken oude wild-type muis met CO 2-inademing. Gebruik weefseltangen en fijne irisschaar om ongeveer 8 cm ileum uit te ontleden.</li>
		<li>Spoel uit met behulp van een spuit met gavage voeding naald met ongeveer 40 mL van ijskoude Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), dan in de lengte gesneden met een schaar en open het ileum.</li>
		<li>Snijd het ileum in kleine (0,5−1,0 cm) stukken. Plaats de stukken in 5 mL steriele ijskoude DPBS in een conische buis van 15 mL en rock vervolgens 5 min op ijs.</li>
		<li>Gebruik een pipetcontroller om de DPBS aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 1 (2 mM EDTA in DPBS). Rock voor 30 min op ijs.</li>
		<li>Gebruik de pipetcontroller om buffer 1 aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacharose in DPBS). Schud 2−3 min met de hand (~80 shakes/min).</li>
		<li>Neem een 20 μL druppel buffer 2 inhoud na het schudden en inspecteren onder een microscoop.</li>
		<li>Filter buffer 2-inhoud met een steriele celzeef van 70 μm en verzamel vervolgens de gefilterde buffer met een conische buis van 50 mL.</li>
		<li>Pipetteer 20 μL filtraat op de glijbaan om de crypten te tellen. Breng een voldoende volume buffer 2 van stap 1.1.7 om ervoor te zorgen dat er ~ 500 crypten / goed.</li>
		<li>Draai naar beneden bij 150 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Zodra het spinnen klaar is, zuigt voorzichtig de supernatant aan.</li>
		<li>Schorscrypten in 50 μL keldermembraanmatrix (bijvoorbeeld Matrigel) per 500 crypten, pipeter op en neer (voorzichtig zijn om bellen te vermijden), plaats dan een 50 μL druppel van keldermembraanmatrix/cryptemix in het midden van één put in een 24-putplaat. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C om keldermembraanmatrix te polymeriseren.</li>
		<li>Voeg na 30 min polymerisatie voorzichtig 600 μL minigut media toe (geavanceerde Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 units/mL], 10 mM Hepes, N2-supplement [1:100], B27 supplement [1:50] met epidermale groeifactor [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], en Y27632 [10 μM]) aan elke put, dan de plaat terug te geven aan de 37 °C incubator. Observeer elke dag onder een microscoop en verander de media elke 2−3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enteroid passaging OPMERKING: Voor lange culturen moeten enteroïden ongeveer elke week worden gesplitst.<ol>
<li>Om de enteroïden te passeren, plaats je de weefselkweekplaat op ijs. Aanzuigen van de media en voeg 1 mL koude DPBS aan elke put. Gebruik een P1000 tip om op en neer te pipeteren totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven.</li>
		<li>Ga één keer op en neer door een insulinespuit van 1 mL (27 G) en in een conische buis van 15 mL. Draai 5 min bij 150 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Gebruik pipet om DPBS te verwijderen. Resuspend in 50 μL van kelder membraan matrix / goed.</li>
		<li>Plaats de plaat in een 37 °C incubator gedurende 30 min om keldermembraanmatrix te laten polymeriseren. Overlay elk goed met 600 μL enr media (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), dan terug de plaat naar de incubator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Flow Cytometry Analyse van EdU-positieve cellen in Enteroïden
OPMERKING: Figuur 1 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van EdU-positieve cellen in enteroïden.
<ol><li>Incubatie van enteroïden met EdU<ol>
<li>Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.</li>
		<li>Stel de controlegroep (onbehandelde enteroïden) en experimentele groep (enteroïden behandeld met 5 ng/mL interleukine 22 [IL-22]). Bereid ten minste drie replica's voor elke groep.</li>
		<li>Voeg EdU toe aan het ENR-medium om EdU-medium voor te bereiden met een concentratie van 50 μM. Voeg 600 μL EdU medium toe aan elke put en broed gedurende 2 uur in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder EdU behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.</li>
	</ol></li>
	<li>Oogsten van enteroïden uit keldermembraanmatrix<ol>
<li>Gebruik een pipetcontroller om EdU medium aan te zuigen en 1x wassen met DPBS. Voeg 1 mL DPBS toe.</li>
		<li>Gebruik P1000 pipet tip en pipet op en neer totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven. Breng over op een 15 mL-buis en draai op 300 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 500 μL cel-dissociatieenzymen(Tabel van materialen)toe en broed gedurende 15 min bij 37 °C. Gebruik P200 pipet tip en pipet op en neer om enteroïden te breken in enkele cellen.</li>
		<li>Voeg 3 mL DMEM-medium toe dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en herhaaldelijk pipett met een P1000 pipettip.</li>
		<li>Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen van de supernatant medium. De cellen opnieuw opschorten met 1 mL DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixatie en permeabilisatie van cellen<ol>
<li>Breng de celvering over op een 1,5 mL-buis, draai op 300 x g voor 5 min en gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Hersuspendeer cellen met 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA), bevestig 15 min bij kamertemperatuur (RT) en spin naar beneden bij 300 x g voor 5 min. Aanzuigen van de supernatant met een pipet tip, was 1x met DPBS, en spin naar beneden om de supernatant te verwijderen.</li>
		<li>Cellen opnieuw opschorten met 1 mL van 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof. Incubeer voor 10 min bij RT.</li>
		<li>Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen de supernatant. Was 1x met DPBS en draai naar beneden om de supernatant te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van EDe<ol>
<li>Bereid voorraadoplossingen voor elk onderdeel vooraf: 1) werkoplossing van de Alexa Fluor azide, 2) werkoplossing van 1x EdU-reactiebuffer en 3) 10x voorraadoplossing van EdU-bufferadditief.</li>
		<li>Bereid 1x EdU buffer additief door verdunning van de 10x oplossing 1:10 in gedeïoniseerd water. Bereid deze oplossing vers voor.</li>
		<li>Bereid reactiecocktail volgens tabel 1. LET OP: Voeg de ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld. Gebruik de reactiecocktail binnen 15 min na bereiding.</li>
		<li>Voeg 100 μL reactiecocktails toe aan elke 1,5 mL buis. Resuspend de cellen, beschermen tegen licht, uitbroeden voor 30 min bij RT.</li>
		<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en zuig de reactieoplossing voorzichtig aan met pipettip.</li>
		<li>Voeg 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve penetrant toe aan elke buis om 1x te wassen bij RT. Centrifuge op 300 x g voor 5 min, aanzuigen van de supernatant met pipet tip zachtjes, en opnieuw de cellen in 1 mL van DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse van cellen per stroomcytometrie<ol>
<li>Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel vervolgens de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL. Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit. OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest.</li>
		<li>Selecteer het juiste kanaal (volgens het type Alexa Fluor azide in de EdU kit; hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150-350 V) voor flow cytometrie analyse.</li>
		<li>Gating strategie<ol>
<li>Teken een FSC-A (x-as) vs. SSC-A (y-as) pseudocolor plot en verdeel de meeste cellen naar het zichtbare bereik van de stip kaart door het aanpassen van de spanning. Selecteer de celpopulatie (R1) en sluit het celpuin in de linkerbenedenhoek uit.</li>
			<li>Stel vanuit de R1-celpopulatie een FSC-A (x-as) vs. FSC-H (y-axis) pseudocolor plot, en stel de poort om enkele cellen (R2) te selecteren om celklontjes uit te sluiten.</li>
			<li>Van de R2 celpopulatie, vaststellen van de fluorescentie intensiteit (x-as) vs. celnummer (y-as) plot, en gebruik de negatieve controle om de poort in te stellen. Het gebied van het tl-signaal is een positief celgebied (R3). Vergelijk de verhouding van EdU-positieve cellen (R3) tussen de experimentele en controlegroepen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Flow Cytometry Analyse van PI-positieve cellen in Enteroïden
OPMERKING: Figuur 2 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van PI-positieve cellen in enteroïden.
<ol><li>Incubatie van enteroïde cellen met PI<ol>
<li>Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.</li>
		<li>Stel de controlegroep (onbehandeld) en experimentele groep (IL-22 behandeld) in met ten minste drie replicaties voor elke groep.</li>
		<li>Voeg PI toe aan het ENR-medium om PI-medium voor te bereiden met een concentratie van 3 μM.</li>
		<li>Voeg 600 μL PI medium toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder PI behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oogst enteroïden uit de matrix van het keldermembraan na de stappen 2.2.1−2.2.5.</li>
	<li>Analyse van cellen per stroomcytometrie<ol>
<li>Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL.</li>
		<li>Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit. OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest.</li>
		<li>Selecteer het juiste kanaal (hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150–350 V) voor stroomcytometrieanalyse.</li>
		<li>Gebruik dezelfde gatingstrategie als beschreven in punt 2.5.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor de cultuur van enteroïden in vitro en kwantificering van EdU- en PI-positieve cellen in de enteroïden door stroomcytometrie. Er zijn verschillende voordelen van deze strategie. Ten eerste wordt EdU-etikettering gebruikt om woekercellen in enteroïden te detecteren. In vergelijking met traditionele BrdU-test is de EdU-etiketteringsmethode sneller, gevoeliger en nauwkeuriger. EdU is zeer vergelijkbaar met thymine (T), die thymine vervangt in DNA-synthese tijdens de celd...

Een fundamentele functie van darmepitheelcellen is het beschermen van de intrede van luminale inhoud zoals pathogene bacteriën en toxines1,2. Om een dergelijke functie uit te voeren, vermenigvuldigen darmstamcellen zich voortdurend en onderscheiden ze zich in een verscheidenheid van epitheelcellen, waaronder enterocyten en secretoire cellen, die een barrière vormen door het vormen van nauwe verbindingen3. De snelle vernieuwing van darmepitheelcellen vereist een strikte coördinatie van celproliferatie, celdifferentiatie en celdood4,5. Verminderde celproliferatie of overmatige celdood leidt tot epitheelschade en gecompromitteerde barrièrefunctie1,6. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met inflammatoire darmziekten7,8.
Een methode om darmcrypten te kweken is eerder ontwikkeld. Met behulp van deze techniek groeien geïsoleerde muiscrypten uit tot darmorganoïden (enteroïden), die crypte-villusachtige structuren hebben en alle darmepitheelcellijn9,10bevatten. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is een thymidine analoog die in staat is om thymine (T) te vervangen in DNA dat replicatie ondergaat tijdens celproliferatie. De proliferative cellen kunnen snel en nauwkeurig worden gelabeld door EdU kleuring. Propidiumjodide (PI) is een analoog van ethidiumbromide die rode fluorescentie vrijgeeft bij het inbrengen in dubbelstrengs DNA. PI detecteert specifiek dode cellen, omdat het alleen door het beschadigde celmembraan gaat.
In dit protocol beschrijven we eerst hoe crypten uit de dunne darm van murine te isoleren en ze vervolgens te kweken als enteroïden in vitro. Vervolgens beschrijven we hoe de proliferative en dode cellen in enteroïden te analyseren door EdU en PI integratie en flow cytometrie.

<table><tbody><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm sterile cell strainer</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm sterile cell strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td></td><td></td><td>2 mM EDTA in DPBS</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td></td><td></td><td>54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sucrose in DPBS</td></tr><tr><td>C57/B6 mice</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR media</td><td></td><td></td><td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Life technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut media</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>R&amp;D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Nonionic surfactant (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Operating Scissor (12,5 cm)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast microscope</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van proliferative en dode cellen in enteroïden

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Het darmepitheel fungeert als een barrière die voorkomt dat de inhoud van de armatuur, zoals pathogene microbiota en toxines, de rest van het lichaam binnendringt. Epitheliale barrière functie vereist de integriteit van darmepitheelcellen. Terwijl epitheelcelproliferatie een continue laag cellen onderhoudt die een barrière vormt, leidt epitheelschade tot barrièredisfunctie. Als gevolg hiervan kan de luminaalinhoud via een onbeperkt pad over de darmbarrière lopen. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met veel darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte. Geïsoleerde muis darmcrypten kunnen worden gekweekt en onderhouden als crypt-villus-achtige structuren, die worden genoemd intestinale organoïden of "enteroïden". Enteroïden zijn ideaal om de proliferatie en celdood van darmepitheelcellen in vitro te bestuderen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om het aantal proliferative en dode cellen in gekweekte enteroïden te kwantificeren. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en propidiumjodide worden gebruikt om woekerende en dode cellen in enteroïden te etiketteren, en het aandeel van vermenigvuldigende en dode cellen wordt vervolgens geanalyseerd door stroomcytometrie. Dit is een nuttig hulpmiddel om de effecten van medicamenteuze behandeling op darmepitheliale celproliferatie en celoverleving te testen.

Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in kelder membraan matrix. Enteroïden begonnen knoppen te vormen 2 dagen na isolatie. Op dag 6 hadden enteroïden veel knoppen met veel puin (dode cellen) in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgegeven in dit stadium (figuur 3).
Talrijke studies hebben aangetoond dat ontstekingscytokinen essentieel zijn voor het behoud van darmepitheelhomeostase. Abnormale expressie van ontstekingscytoki...

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Dit protocol is nuttig voor enteroïde isolatie in een cultuur naast het onderzoeken van celproliferatie en de overleving in enteroïden. Wetenschappers kunnen deze techniek toepassen op kweek enteroïden en het effect van geneesmiddelen en inflammatoire cytokinen op darmeppitheelcellen in vitro bestuderen. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot watertherapie van inflammatoire darmziekte.We passen deze methode toe om een aantal therapeutische cytokinen te vinden. Deze methode biedt inzicht in darmeppitheelproliferatie en overleving;daarnaast kan het ook worden gebruikt in organoïden, gekweekt rond andere weefsels dan de darm. Om darmcrypten te isoleren en enteroïde cultuur uit te voeren, gebruik maken van weefsel tangen en vinden iris schaar te ontleden ongeveer acht centimeter ileum van een geëuthanaseerde acht weken oude wild-type muis.Gebruik een spuit met een gavage voernaald om het ileum door te spoelen met ongeveer 40 milliliter ijskoude Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing, snijd vervolgens in de lengte met een schaar en open het ileum. Snijd het ileum in kleine stukjes en leg ze in vijf milliliter steriele ijskoude DPBS in een conische buis van 15 milliliter. Dan rock het monster voor vijf minuten op ijs.Gebruik een pipet controller om de DPBS aan tezuilen en te vervangen door 10 milliliter koude buffer een. Na 30 minuten op ijs te hebben gegesteenten, gebruikt u de pipetcontroller om buffer één aan te trekken en te vervangen door 10 milliliter koude buffer twee. Dan schudden voor twee tot drie minuten met de hand op ongeveer 80 shakes per minuut.Na het schudden, inspecteer een twintig micro liter druppel buffer twee inhoud onder een microscoop om ervoor te zorgen dat er crypten met korrelige Paneth cellen. Filter buffer twee inhoud met een 70 micron steriele celzeef en verzamel de gefilterde buffer in een conische buis van 50 milliliter. Pipette 20 microliter filtraat op de dia om de crypten te tellen.Breng een voldoende volume van de gefilterde buffer twee inhoud om ervoor te zorgen dat er ongeveer 500 crypten per goed. Draai naar beneden op 150 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en dan zorgvuldig aspirate de supernatant. Resuspend de crypten in 50 microliter van kelder membraan matrix per 500 crypten.Pipet op en neer zorgen om bubbels te voorkomen. Plaats een 50 microliter druppel van kelder membraan matrix en crypte mix in het midden van een put van een 24 put plaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de keldermembraanmatrix te polymeriseren.Na 30 minuten van polymerisatie, zorgvuldig toe te voegen 600 microliter van minigut media aan elke put. Breng de plaat terug naar de 37 graden Celsius incubator, en observeer elke dag onder een microscoop, waardoor de media om de twee tot drie dagen veranderen. Om de enteroïden door te geven, plaats de weefselkweekplaat op ijs, aspirate de media, en voeg een milliliter koude DPBS aan elke put.Gebruik een P1000-tip om op en neer te pipetten totdat er geen matrixbrokken overblijven. Geef het monster door een insulinespuit van één milliliter en naar beneden in een conische buis van 15 milliliter. Na vijf minuten naar beneden te hebben gedran rondgedraaid op 150 keer G en vier graden Celsius, gebruikt u een pipet om de DPBS te verwijderen.Stel de enteroïden opnieuw op in 50 microliter van keldermembraanmatrix per put. Plaats de plaat in de 37 graden Celsius incubator gedurende 30 minuten om de kelder membraan matrix te polymeriseren. Dan, overlay elk goed met 600 microliters van ENR media en de plaat terug te keren naar de incubator.Groeien enteroïden voor vijf tot zeven dagen voordat ze doorgeven in een nieuwe 24 put plaat met behulp van een splitsing verhouding van een tot twee. Voeg 600 microliters van ENR-medium toe aan elke put en broed de enteroïden vervolgens vier tot vijf dagen in de 37 graden Celsius-incubator. Stel de controlegroep van onbehandelde enteroïden en de experimentele groep enteroïden op die behandeld worden met vijf nanogram per milliliter interleukine-22.Bereid ten minste drie replicaties voor elke groep. Voeg 600 microliters van EdU medium toe aan elke put van enteroïden, behalve een put om te gebruiken als een negatieve controle voor achtergrondaftrekking. Broed de plaat twee uur in een couveuse van 37 graden Celsius.Om enteroïden uit de keldermembraanmatrix te oogsten, gebruikt u een pipetcontroller om EdU-medium aan tezuigen en één keer te wassen met DPBS. Voeg vervolgens een milliliter DPBS toe. Gebruik een P1000 pipette tip om pipet op en neer totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven.Breng het monster naar een 15 milliliter buis en spin naar beneden op 300 keer G gedurende vijf minuten voor het weggooien van de supernatant. Voeg 500 microliter van celdissociatie enzymen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een P200 pipettip om op en neer te pipetten en enteroïden in enkele cellen te breken.Voeg vervolgens drie milliliter van Dulbecco's Modified Eagle Medium toe met 10%foetaal runderserum en herhaaldelijk pipet met een P1000 pipettip. Na vijf minuten centrifugeren op 300 keer G en het opslokken van de supernatant, schorten we de cellen op in één milliliter DPBS. Om fixatie en permeabilisatie van cellen uit te voeren, breng je eerst de celsuspensie over naar een enkele vijf milliliter buis, spin je vijf minuten naar beneden op 300 keer G en gooi je de supernatant weg.We schorten de cellen op in één milliliter van 4%paraformaldehyde en stellen gedurende 15 minuten vast bij kamertemperatuur. Na vijf minuten centrifugeren op 300 keer G, de supernatant aanzuigen met een pipetpunt. Was de cellen eenmaal met de DPBS en draai weer naar beneden om de supernatant te verwijderen.Resuspend de cellen met een milliliter van 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor het wassen van de cellen met DPBS als voorheen. Om de EdU te detecteren, voeg 100 microliter reactiecocktail toe aan elke 1,5 milliliter buis. Resuspend de cellen, en hen te beschermen tegen licht, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Na het centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten, voorzichtig aanzuigen de reactie oplossing met een pipette tip Voeg 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve penetrant aan elke buis te wassen een keer bij kamertemperatuur. Na centrifugatie zoals voorheen, schorten we de cellen op in één milliliter DPBS. Filter de geresuspendeerde cellen met een 40 micron zeef en verzamel de gefilterde cellen in een 15 milliliter conische buis.Voer feiten over machinedetectie zo snel mogelijk uit. Selecteer het juiste kanaal en de juiste spanning voor de analyse van de stroomcytometrie. Teken voor de gatingstrategie een FSC-A versus SSC-A pseudocolor plot en verdeel de meeste cellen naar het zichtbare bereik van de puntkaart door de spanning aan te passen.Selecteer de celpopulatie als R1 en sluit het celpuin in de linkerbenedenhoek uit. Van de R1 cel populatie, stel een FSC-A versus FSC-H pseudocolor plot. Stel de poort in om afzonderlijke cellen te selecteren die als R2 zijn aangeduid en celklonen uit te sluiten.Van de R2 cel populatie, vast te stellen de fluorescentie intensiteit versus celnummer plot en gebruik maken van de negatieve controle om de poort in te stellen. Het gebied van het fluorescerende signaal is een positief celgebied aangeduid als R3.Vergelijk de verhouding van deze EdU-positieve cellen tussen de experimentele en controlegroepen. Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in de kelder membraan matrix.Enteroïden begonnen twee dagen na isolatie knoppen te vormen. Op dag zes, enteroïden had veel knoppen met veel puin in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgevoerd in dit stadium.Enteroïden werden behandeld met IL-22 gedurende 3 dagen, waarna het synthetische DNA werd gelabeld met EdU in het rood om celproliferatie aan te geven. IL-22 behandelde enteroïden vertoonden een verhoogd aantal EdU-positieve cellen. IL-22 verhoogde vermenigvuldigende cellen van 40,1% tot 83,5%, zoals geanalyseerd door flow cytometrie.IL-22 behandeling verhoogde ook de celdood in enteroïden aangegeven door propidium jodide kleuring in rood. IL-22 verhoogde dode cellen van 4,9% tot 16,2%, zoals geanalyseerd door flow cytometrie. Tijdens de crypt isolatie vooruitgang eerlijke schudden is nodig na het toevoegen van buffer om ervoor te zorgen genoeg crypten worden geschud.Wij adviseren het inspecteren van inhoud onder de microscoop. Na deze procedure kunnen we ook de gedifferentieerde epitheelentypes en enteroïden kwantificeren met behulp van specifieke Deze methode zal onderzoekers helpen om darmeppitheeldifferentiatie in enteroïden te onderzoeken. Na de ontwikkeling van deze vraag maakt een manier voor onderzoekers op het gebied van gastro-enterologie om de ontwikkelings- of pathologische vragen in de snede te verkennen.

quantification-of-proliferative-and-dead-cells-in-enteroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode om humane enteroïden te kweken uit kleine darmcrypten en colonoïden uit coloncrypten die zijn verzameld uit zowel chirurgisch weefsel als biopsieën. In dit methodologische artikel presenteren we de kweekmodaliteiten die essentieel zijn voor het succesvolle groeien en onderhouden van humane enteroïden en colonoïden.

Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.

Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Enteroïden zijn in opkomst als een nieuw model voor het bestuderen van weefselfysiologie en pathofysiologie, medicijnontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Hier beschrijven we een 2D-enteroïde-afgeleid kweeksysteem van rundercellen dat co-kweek met relevante weefselceltypen mogelijk maakt. Dit model biedt een translationeel voordeel voor modellering van gastro-intestinaal onderzoek.

Generatie van een rundvee primair enteroïde-afgeleid tweedimensionaal monolaagkweeksysteem voor toepassingen in translationeel biomedisch onderzoek

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van apicaal-out darmorganoïden uit standaard matrix-ingebedde organoïde culturen. Het schetst ook de daaropvolgende opname van EdU in actief prolifererende cellen en de semiautomatische kwantificering van EdU-positieve cellen.

Genereren van apicaal-out darmorganoïden en beoordeling van de proliferatiesnelheid van organoïden met behulp van EdU-labeling

Leer hoe je enteroiden isoleert uit muizenileum en celproliferatie en overleving kwantificeert met behulp van flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van geneesmiddel- en cytokine-effecten op darmepitheelcellen.

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

Meer video's verkennen