Integratie van bioinformatica benaderingen en experimentele validaties om de rol van Inkeping signalering in ovariële kanker te begrijpen

Bioinformatica is een handige manier om informatie uit gegevenssets te extraheren. Experimenteren is even belangrijk voor validatie. We combineren beide benaderingen om de rol van inkeping signalering bij eierstokkanker te onderzoeken.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onderzoekers de informatie uit de bioinformatica databases kunnen gebruiken om hun onderzoeksrichting te plannen voordat ze een experiment uitvoeren. Met geaccumuleerde bio-informatica gegevens van menselijke ziekten, wetenschappers zijn niet langer geblinddoekt. Experimenten kunnen worden uitgevoerd om specifieke bevindingen te valideren, wat kan leiden tot verbeterde therapieën of diagnose van ziekten.

Voor meta-A analyse van de associatie van een gen van belang met een specifiek type kanker, maak een account aan met een academisch gekoppeld e-mailadres om toegang te krijgen tot de PRECOG database en voer het e-mailadres en wachtwoord in dat is gekoppeld aan het account in de inlogterminal. Klik op Details weergeven en voer het gen van belang in de zoekbalk in. Gebruik vervolgens de schuifbalk om de survival Z-score te verkrijgen voor het specifieke kankertype van belang.

Om de associatie tussen genexpressieniveaus en eierstokkankerstadia te onderzoeken, navigeer je naar de CSIOVDB-webpagina en voer je de naam van het gen van belang in de zoekbalk in. Klik vervolgens op het tabblad Overleven. Als u genexpressiegegevens wilt beoordelen in diverse, normale en tumorweefsels, gaat u naar het GENT-portaal en klikt u op het tabblad Zoeken.

Selecteer in de trefwoordsectie het gensymbool voor de termen in het vervolgkeuzemenu, voert het gensymbool in van het gen van belang en selecteer Weefsel voor de typeoptie. Klik op de knop Zoeken. Overzichtsgrafieken van de genexpressie in normale en tumorweefsels van verschillende kankertypen, gebaseerd op de U133A- en U122 Plus 2-platforms, worden weergegeven.

Klik vervolgens op de koppeling Download van resultaatgegevens om toegang te krijgen tot de gedetailleerde informatie over de waarden van genexpressie, weefseltypen en gegevensbronnen. Als u wilt zoeken naar genetische veranderingen en signaleringsnetwerken, opent u de CBIO-portalwebpagina en klikt u met behulp van de query op de bestemmingspagina op de organen of weefsels van belang onder sectie Studies selecteren, selecteert u de specifieke studie van belang en klikt u op Query by Gene. Selecteer in de sectie Genomic Profiles selecteren de mutaties, putative copy number changes van GISTIC of mRNA expression option.

Selecteer de bijbehorende gegevens in het menu Patiënt/aanvraagset selecteren en voer de doelgensymbolen in het queryvak van Enter Genes in. Klik op de knop Query verzenden en open het tabblad Netwerk om het gewenste gennetwerk op te halen. Klik vervolgens op het tabblad Bestand en selecteer PNG opslaan als afbeelding voor het downloaden van netwerkafbeeldingen.

Om vliegen te maken met NICD of NICD en mam overexpressie, de juiste vliegbestanden voor te bereiden en de temporele en regionale genexpressie targeting techniek toe te passen om de spatiotemporale genexpressie te controleren, volgens standaardprotocollen. Verhoog de vliegen op 18 graden Celsius tot volwassenheid, alvorens over te schakelen naar 29 graden Celsius met gist voor 48 uur. Voeg aan het einde van de 29 graden Celsius-incubatie drie milliliter PBS toe aan een embryocollectieschotel en verdoven de vliegcultuur met een kooldioxidepad.

Gebruik een ontleden microscoop om een verdoofde vrouwelijke vlieg te identificeren, en gebruik een paar ontleden tangen om zorgvuldig pak de onderste thorax van de vlieg. Dompel de vlieg onder in de PBS in de embryo collectie schotel, en gebruik een tweede paar tangen om de onderbuik knijpen, trekken zachtjes om de inwendige organen vrij te geven. Zoek en los het paar eierstokken van het vlieglichaam en breek de gespierde schede, gelegen aan het achterste uiteinde van de eierstokken, om de ovarialen te scheiden.

Plaats vervolgens de geïsoleerde eierstokken in een 1,5 milliliter centrifugebuis, met 500 microliter PBS op ijs. Wanneer alle eierstokken zijn verzameld, vervang de PBS met 500 microliter van 4% formaldehyde, en plaats de buis op een nutator gedurende 10 minuten. Gooi aan het einde van de incubatie de fixatieve weg en was de eierstokken met drie, 15 minuten spoelingen in één milliliter PBT per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, label de eierstokken met 150 microliter van 10 microgram per milliliter DAPI gedurende 10-15 minuten op de nutator. Aan het einde van de incubatie was je de eierstokken één keer gedurende 10 minuten met één milliliter PBT, gevolgd door twee wasbeurten van 10 minuten in PBS. Verwijder na de tweede wasbeurt alle, behalve de laatste 300 microliter pbs, en gebruik een 200 microliter pipetpunt om de eierstokken meerdere malen te tritereren om de eierkamers te bevrijden.

Vervolgens, voorzichtig sediment het eierstokweefsel door middel van een snelle spin in een microcentrifuge, en verwijder zo veel PBS mogelijk zonder verstoring van de eierstok pellet. Met behulp van een 1.000 microliter pipet tip, breng ongeveer drie druppels montage-oplossing naar de buis, en gebruik een 200 microliter pipet tip met ongeveer 0,33 millimeter bijgesneden vanaf het einde om de gehele 120 microliter van eierstokhoudende montageoplossing over te brengen op een glazen microscoop schuif. Plaats voorzichtig een coverslip glas over de montageoplossing en sluit de randen af met transparante nagellak.

Gebruik dan een confocale microscoop bij een 10x vergroting met een 0.8 diafragma om beelden van de gekleurde en gemonteerde eierstokken te verwerven. Met behulp van de PRECOG portal zoals aangetoond, de Z-scores van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 in eierstokkanker kan worden verkregen. De negatieve Z-scorewaarden geven de slechte algehele overleving aan van patiënten met een hoog expressieniveau van de drie genen.

Met behulp van de CSIOVD-database om deze bevindingen te bevestigen, geeft een hoge expressie van NOTCH2, NOTCH3 en MAML1 verder aan met een slechte algehele en ziektevrije overleving. Verdere permutatietests suggereren dat NOTCH2, NOTCH3 en MAML1 sterk worden uitgedrukt in tumorweefsels. Op basis van deze drie kerngenen kan een signaleringsnetwerk worden gecreëerd om de 50 meest veranderde naburige genen te bieden die ook in hetzelfde pad zitten met de hoogste mutatiepercentages.

Van belang, de overexpressie van de Drosophila-equivalent NOTCH gen, NICD, alleen, veroorzaakt geen tumoren in Drosophila. Terwijl de overexpressie van NICD en mam samen tumoren in fruitvliegjes induceert, zoals blijkt uit de aanwezigheid van meerdere epitheellagen en geaccumuleerde cellen. Verdere experimenten validatie kan de weg vrijmaken voor de identificatie van potentiële nieuwe medicamenteuze therapie doelen, ziekte biomarkers, en gepersonaliseerde behandelingen.