Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

De heterogeniteit van skeletstructuren is een obstakel bij het bestuderen van de genexpressie bij het ontwikkelen van kraakbeen en bot. Dit protocol biedt een methode voor nauwkeurige isolatie van aangrenzende, maar verschillende weefsels. We optimaliseren de laserafvangmicrodissection voor kraakbeen en het bot met behulp van cresyl violette kleuring om deze weefsels te visualiseren voor nauwkeurige verzameling door het handhaven van een hoge RNA-integriteit voor latere analyse.

Andere weefsels kunnen worden geïsoleerd als cresyl violet voldoende onderscheid van doelweefsel biedt en de RNA-kwaliteit hoog blijft na onze verwerkingsmethode. Dergelijke weefsels omvatten craniofaciale hechtingen en hersenen. Cryosectioning is de meest veeleisende vaardigheid in dit protocol.

Zorg ervoor dat het weefsel snel wordt ontleed en ingebed om de hoogste integriteit van RNA te behouden. Om deze procedure te beginnen, ontleedt het embryo of weefsel van belang. Sluit het monster in een wegwerp inbeddingsvorm met optimale snijtemperatuurverbinding en pas de oriëntatie van het monster aan met een tip of naald.

Bevries de monsters snel in een droogijs en methyl-2-buteenbad. Bereid vervolgens een dekselcontainer met droogijs door een vel aluminiumfolie op het droge ijs te plaatsen voor tijdelijke opslag van dissectiemonsterglijbanen tijdens cryosectioning. Breng het verse bevroren exemplaar in de emmer droogijs.

Plaats een laag van optimale snijtemperatuur verbinding op een cryostat monster houder, en onmiddellijk plaats het monster op de top van de optimale snijtemperatuur verbinding met zachte druk. Wanneer de optimale snijtemperatuurverbinding volledig bevroren is, bevestigt u de houder met het monster in de cryostat snijarm. Laat het monster 15 minuten in de cryostat staan om het te equiliberen met de snijtemperatuur.

Vervolgens, sectie van het weefsel op een dikte van 12 micrometer en het verzamelen van de plakjes op PEN membraan dia's. Lijn opeenvolgende secties op het membraan uit. Zodra de dia is voltooid, laat u de secties een paar minuten drogen en breng de glijbaan vervolgens over op de folie in de droge ijscontainer totdat alle vereiste glijbanen worden verzameld.

Bewaar de dia's op min 80 graden Celsius in een diavak. Om te beginnen, bereiden drie gelabelde 15 milliliter centrifuge buizen. Voeg 45 milliliter ethanol van 80% toe aan elke buis.

Plaats drie buizen op ijs. Plaats een buis met 45 milliliter ethanol van 95% en een buis met 100% ethanol op ijs. Voeg vervolgens 45 milliliter xyleen toe aan een 50 milliliter centrifugebuis bij kamertemperatuur.

Ontdooi een PEN membraan schuif kort door het te plaatsen tegen een gehandschoende hand, en was het twee keer gedurende 30 seconden in elk van de buizen met 80% ethanol met agitatie om de optimale snijtemperatuur verbinding te verwijderen. Leg vervolgens de glijbaan op een vel aluminiumfolie. Pipette 8 milliliter van 1%cresyl violet en 50% ethanol op de glijbaan en vlek gedurende 30 seconden.

Was de glijbaan in de derde buis met 80% ethanol gedurende 30 seconden. Dehydrateer de glijbaan door het passeren van de buis met 95% ethanol gedurende 30 seconden, de buis met 100% ethanol gedurende 30 seconden, en ten slotte, de buis met xyleen gedurende 30 seconden. Plaats hierna de glijbanen vijf minuten op een delicate taakwisser om de xyleenafvoer te laten uitlekken en de secties te laten drogen.

Zet eerst de microdissectionmicrodicctionmicroscoop, laser en computer van de laserafvang aan. Log in op de computer en start de software. Wanneer het groene lampje is ingeschakeld, drukt u op de rode knop om de laser te activeren.

Wanneer het licht rood wordt, is de laser klaar voor gebruik. Steek de dop van een 5 milliliter PCR buis in de collector. Pipette 50 microliter extractiebuffer in de dop en steek het verzamelapparaat in de microscoop.

Klik in het venster wijzigingscollectorapparaat op de knop Verplaatsen naar referentiepunt om de verzamelprogramma naar het referentiepunt te verplaatsen. Pas de focus aan om het referentiepunt duidelijk weer te geven. Klik vervolgens op de linker ontlaadknop op de werkbalk om de diahouder te verlagen.

Plaats de schuif in de houder met het weefsel gedeelte naar beneden gericht, en steek de houder terug in het podium. Klik op Doorgaan in het venster Wijzigingsmodel. Als u de laserparameters wilt instellen, selecteert u de besturingsoptie van het lasermenu of klikt u op het laserpictogram.

Pas de volgende parameters naar wens, macht, dat is de kracht van de laser, diafragma, dat is de breedte van de laser, en snelheid, dat is de snijsnelheid in draw en cut-modus. Begin met een 5X doelstelling om de interessegebieden te vinden en schakel over naar het doel dat het beste het interessegebied laat zien. Kies de buis voor de collectie door te klikken op het merk op de collector, kies dan verplaatsen en knippen of tekenen en knippen.

Zodra de snede is voltooid, zal het doelweefsel met PEN membraan vallen in de dop van de collectie buis door de zwaartekracht. Herhaal dit selectie- en snijproces om indien nodig meerdere aandachtsgebieden te trekken. Laad hierna de collector uit en sluit de PCR-buis voorzichtig.

Plaats de microontsneden weefsels op droog ijs. Ontdooi de microontsneden weefsels bij kamertemperatuur, centrifuge vervolgens kort en broed de monsters gedurende 30 minuten uit op 42 graden Celsius. Draai hierna de lysebuffer naar beneden in de 5 milliliter PCR-buis.

Voer DNase-behandeling en RNA-extractie uit met behulp van een RNA-isolatiekit, volgens de instructies van de fabrikant. In deze studie wordt een geoptimaliseerde laserafvangmicrodissection van kraakbeen en bot uitgevoerd, waarbij het gebruik van cresylviolet-kleuring wordt benadrukt in een snelle procedure om kraakbeen en bot te visualiseren voor nauwkeurige weefselverzameling met behoud van een hoge RNA-integriteit voor latere analyse. Observatie van de dia's toont aan dat alle onderzochte kraakbeenvlekken magenta zijn gekleurd en dat alle gemineraliseerde weefsels bruin of zwart zijn gekleurd.

Zowel kraakbeen als bot zijn gemakkelijk te onderscheiden van andere weefsels op meerdere anatomische plaatsen. Meckel's Kraakbeen, condylar kraakbeen, en de mandibulaire botgebieden worden geselecteerd en geïsoleerd door laser vangen microdissection. Om voldoende RNA voor het naten te verkrijgen, trekt u 10 gebieden van Meckel's Kraakbeen, 10 regio's condylar kraakbeen of vier gebieden van mandibulair bot in respectievelijk drie afzonderlijke opvangbuizen.

RNA wordt vervolgens geëxtraheerd, en het totale RNA wordt geanalyseerd met behulp van een bioanalyzer. Deze laser capture microdissection protocol wordt gebruikt op verschillende weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia, en de RNA integriteit nummer metingen geven een hoge RNA kwaliteit. Differentiële genexpressie analyse wordt vervolgens uitgevoerd.

Er zijn 4.006 genen significant en verschillend uitgedrukt tussen het mandibulaire bot en Meckel's Kraakbeen. Genen die specifiek zijn voor osteoblasten of osteocyten worden meer uitgedrukt in het mandibulaire bot, terwijl chondrocyte specifieke genen zijn meer sterk uitgedrukt in Meckel's Kraakbeen. Bovendien worden osteoclastmarkers meer uitgedrukt in het mandibulaire bot, wat wijst op een succesvolle isolatie van gerichte weefsels.

Na deze procedure kan genexpressieanalyse, inclusief qPCR en RNA-seq, worden uitgevoerd. Deze methoden kunnen de genexpressie van het transcriptoom in specifieke weefsels of gebieden van belang binnen heterogene weefsels analyseren.