Name: Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer intravitale microscopie van post-capillaire venulen in de cremaster spier van muizen. Deze methode visualiseert leukocyten-endotheel interacties en is essentieel voor onderzoek naar ontsteking en sepsis in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) 01GL1746E als onderdeel van het PRIMAL Consortium. De auteurs erkennen Britta Heckmann en Silvia Pezer voor bekwame technische bijstand.

De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde en specifieke ziekteverwekker-vrije voorwaarden bij IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de lokale IRB en het Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Duitsland.
1. Anesthesietoediening
<ol><li>Verdoof de muis door intraperitoneale (i.p.) bolusinjectie van 125 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine.</li>
	<li>Plaats en bevestig de muis in een rugligfietspositie op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis (36,5-38 °C) te behouden. Gebruik een niet-opneembare steriele hechting (6/0) om een eenvoudige lus rond de frontale tanden te winden en de verbindingsuiteinden van de hechting aan het verwarmingskussen vast te plakken. Deze fixatie is bedoeld om de mond open te houden om verstoring van de ademhaling te voorkomen.</li>
	<li>Controleer de muis op de juiste diepte van anesthesie door interdigitale teenknijpen (terugtrekking mag niet worden gezien).</li>
	<li>Zodra voldoende anesthesie is bereikt, gaat u over tot chirurgische voorbereiding. Herhaaldelijk bevestigen anesthesie langs de lopende experiment om de 30 min. Re-toediening van geneesmiddelen zoals hierboven beschreven indien nodig.</li>
	<li>Equilibrate fysiologische zoutoplossing (PSS, samenstelling: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04, 2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) met 5% CO2/95% N2 gedurende 15 minuten. Bel PSS continu met 5% CO2/95% N2 gedurende het hele experiment en blijf op 37 °C.</li>
</ol>2. Chirurgische bereiding van de luchtpijp en halsslagader (facultatief)
<ol><li>Ontleed de huid van de nek gebied door zachtjes trekken van de huid met pincet in de middellijn. Gebruik een schaar om een cirkelvormige snede van 1-2 cm in diameter aan te brengen om voldoende ruimte te geven voor chirurgische voorbereiding.</li>
	<li>Ontleed zorgvuldig de omliggende spier-, vet- en bindweefsels met behulp van een pincet.</li>
	<li>Maak een dwarse snede (~ 1,3 mm) in de luchtpijp met behulp van kleine chirurgische schaar en introduceer een polyethyleenbuis (I.D x O.D. 0,034" x 0,050") in het staartuiteinde van de luchtpijp om de bovenste luchtwegen te beveiligen.</li>
	<li>Bevestig de buis in de luchtpijp door een enkele cirkelvormige knoophechting (6/0 USP).</li>
	<li>Zoek de halsslagader langs de rechterkant van de luchtpijp en ontleed het omringende weefsel van de halsslagaderwand. Als alternatief kan de halsslagader of ook de staartader worden gebruikt voor infuustoegang. Probeer letsel aan de nervus vagie te voorkomen, omdat deze zich dicht bij elkaar bevindt.</li>
	<li>Geef twee stukken hechting (6/0) onder de halsslagader. Plaats de eerste schedelhechting proximale, dicht bij de splitsing van halsslagaders en bind het permanent. De tweede hechting zal worden gevestigd ongeveer 5-8 mm distaal van de eerste en later worden gebruikt om de buis te beveiligen in de halsslagader. Bind het nog niet vast.</li>
	<li>Bereid een polyethyleenbuis (I.D x O.D. 0,011" x 0,024") met een lengte van 30 cm door het uiteinde te buigen naar een 1 mL spuitnaald gevuld met zout (0,9% NaCl). Rigoureus spoelen is belangrijk om luchtembolie tijdens de voorbereiding te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik een 7 mm vaatclip om de halsslagader los van de tweede hechting te klemmen.</li>
	<li>Voer een kleine dwarse snede (~ 0,5 mm) in de halsslagader uit en introduceer de steriele polyethyleenbuis. Zet de buis in de slagader met behulp van de tweede hechting voorbereid voor.</li>
	<li>Verwijder de vatclip en breng voorzichtig een beetje spanning aan op de spuit die is aangesloten op de polyethyleenbuis. Deze halsslagader katheter kan nu worden gebruikt om drugs toe te dienen of bloedmonsters te nemen indien nodig, zelfs controle van de bloeddruk of hartslag is mogelijk met de respectieve apparaten.</li>
</ol>3. Chirurgische voorbereiding van de cremasterspier
<ol><li>Breng de muis op de verwarmingspad (samen met de verwarming pad) naar de op maat gemaakte plastic frame bedrijf het podium voor latere microscopie. Oriënteer de muis met zijn scrotum naar het microscoopstadium.<ol>
<li>Herbeoordeling van de diepte van anesthesie voordat u verdergaat; indien nodig een kwart tot halve dosis anesthesie opnieuw toe dienen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lokaliseer het scrotum, houd het op zijn meest distale deel met behulp van pincet, trek het voorzichtig en snijd een cirkelvormige sectie van scrotale huid met ongeveer 5 mm in diameter. Zorg ervoor dat de onderliggende structuren, zoals de cremaster spier, niet worden geschaad. Zorg ervoor dat het open weefsel goed gehydrateerd blijft met een zoutoplossing.</li>
	<li>Ontleed los bindweefsel met behulp van twee pincet en lokaliseren beide teelballen.</li>
	<li>Houd een testis distally en voorzichtig beginnen te trekken uit, het verwijderen van omliggende bindweefsel stap voor stap.</li>
	<li>Zodra de testis is buiten, pin zijn distale einde aan de rubberen ring rond het podium. Bij exteriorisatie, hydrateer het weefsel met zoutoplossing tijdens het hele proces.</li>
	<li>
Kritieke stap: Verwijder bindweefsel voorzichtig zonder de onderliggende cremasterspier te beschadigen. Overtollig bindweefsel kan het gezichtsvermogen in latere microscopie belemmeren en kan wazige beelden produceren.</li>
	<li>Pin het distale deel van de testis naar beneden en open de cremaster spier door een kleine dwarse snede (ongeveer 1 mm), gevolgd door longitudinale incisie van de zeer distale tot het proximale einde. Als gevolg hiervan moet de cremaster spier sferisch openen. Macroscopisch zichtbaar vat mag niet worden doorgesneden, omdat dit van invloed kan zijn op de hemodynamica.</li>
	<li>Verdeel de spier voorzichtig over het glazen podium en pin deze vast aan de rubberen ring. Zorg ervoor dat u de centrale regio niet aanraakt of beschadigt, want hier wordt microscopie uitgevoerd. Let op: Overtollige stretch kan de bloedstroom belemmeren.</li>
	<li>Speld de resterende testis opzij om toegang te geven tot de regio van belang. Bevochtig je herhaaldelijk met PSS om uitdroging te voorkomen. De gemonteerde spier is nu klaar voor microscopie.</li>
</ol>4. Intravitale microscopie
<ol><li>Plaats de gemonteerde cremaster spier in de rechtopstaande microscoop en uitvoeren microscopie met behulp van een 40x doelstelling.</li>
	<li>Gegevens verkrijgen en exporteren met behulp van hoge doorvoerimaging spectrografie.</li>
	<li>Voer opnames uit onder continue superfusie met voorverwarmde PSS17(35-37 °C). Breng superfusie door een kleine slang die is geplakt op de rechte doelstelling van de microscoop om continu druipen van PSS naast het doel naar beneden op het spierweefsel mogelijk te maken.</li>
	<li>Identificeer postcapillaire venules (samenvloeiing van twee kleinere vaten) en meet de microcirculatie op venules met een diameter van 20-40 μm.</li>
	<li>Neem hoge resolutie beelden van de microcirculatie van de cremaster spier in een tijdsbereik van 30 s. Aangezien er tijdens de opname lichte samentrekking en ontspanning van het spierweefsel kan zijn, zorg ervoor dat u de focus voortdurend aanpast. Over het algemeen heeft de muis de neiging om een stabiele circulatie vertonen voor ongeveer 2 uur. Het is mogelijk om verschillende opnames van verschillende schepen uit verschillende regio's te verwerven. Een of beide testis kan vervolgens worden gebruikt. OPMERKING: Aangezien dit een ontstekingsmodel is, zijn veelvoorkomende manieren van inductie: systemische toepassing of lokale scrotale injectie van pro-inflammatoire mediators en superfusie met bijvoorbeeld N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP). N Lokale TNF-α stimulatie wordt vaak gebruikt om leukocyten werving te activeren; LPS-geïnduceerde endotoxemie is een model van SIRS ernstige systemische ontsteking.</li>
</ol>5. Leukocytevisualisatie
LET OP: Aanhanger en rollende leukocyten kunnen gemakkelijk worden gezien zonder verdere visualisatie. Om de middenlijn snelheid van vrij bewegende leukocyten te bepalen, uit te voeren differentiële vlekken.
<ol><li>Als eGFP gelabelde muizen worden gebruikt, analyseer ze dan direct met fluorescentiemicroscopie.</li>
	<li>Voor niet-eGFP gelabelde muisstammen, gebruik rhodamine kleuring.<ol>
<li>Toedienen rhodamine 6G op 0,2 mg/kg lichaamsgewicht. Herhaalde doses kunnen nodig zijn om voldoende kleurintensiteiten te bereiken. Zorg ervoor dat u kleine volumes behoudt, omdat grotere volumes van invloed kunnen zijn op hemodynamische parameters.</li>
		<li>Voor onmiddellijke vlekken van leukocyten, het toedienen van de vlek via de halsslagader. Als de dissectie van de halsslagader niet is uitgevoerd, kan voldoende kleuring worden bereikt door middel van een i.p. toepassing met dezelfde dosis18. Als alternatief voor halsslagader katheterisatie, kan elke andere veneuze katheterisatie worden uitgevoerd. OPMERKING: Houd in gedachten dat rhodamine kleuring, in tegenstelling tot eGFP etikettering, toont tijd verval van fluorescentie intensiteit evenals een totale kleuring maximum van ongeveer 80% van de leukocyten bij hogere concentraties.</li>
		<li>Visualiseer vrij bewegende rhodamine gekleurde leukocyten door fluorescentie microscopie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Einde van het experiment
OPMERKING: De totale geschatte tijd om dit protocol uit te voeren moet 90 – 150 minuten zijn.
<ol><li>Beëindig het experiment met euthanasie door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Voor verdere analyses, zoals transmigratie, fix de cremaster spier in PFA, terwijl nog steeds uitgerekt op het podium en gekleurd voor histologie als nodig is.</li>
</ol>7. Offline analyse
<ol><li>Analyseer de volgende parameters als eenvoudige tellingen tijdens het afspelen van video's.<ol>
<li>Rolling flux berekenen [getal/min]: aantal rollende cellen dat een denkbeeldige lijn/min passeert</li>
		<li>Bereken hechting [getal/mm2]:aantal cellen dat aan de vaatwand kleven in het gezichtsveld ≥ 30 s/vasculair oppervlak [mm2].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meet de volgende hemodynamische en microvasculaire parameters worden gemeten met behulp van ImageJ.<ol>
<li>Bereken de diameter van het vat [μm] als de binnenwanddiameter.</li>
		<li>Bereken de lengte van het vat [μm] als de lengte van de middellijn van het vat.</li>
		<li>Bereken de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg"> middenlijnsnelheid verkregen uit frame-to-frame video-analyse van vrij bewegende leukocyten in de middenlijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de volgende vergelijkingen als schatting.<ol>
<li>Bereken het vasculaire oppervlak in [mm2]:vatlengte [μm] x vatdiameter [μm] x π x 10-6.</li>
		<li>Bereken de <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg"> </img>wandschuifsnelheid : 4,9 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg"> x (8 x middenlijnsnelheid x 0,625/vatdiameter [μm]).</li>
		<li>Bereken de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg"> </img>gemiddelde doorbloedingssnelheid : middenlijnsnelheid <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg"> x 0,625.</li>
		<li>Bereken de <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg"> </img>totale leukocytenflux : systemische leukocytentelling <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg"> x (gemiddelde doorbloedingssnelheid <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg"> x 60/1000) x π x <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg"> </img>.</li>
		<li>Bereken rollende fluxfractie [%]: rollende flux/totale leukocyteflux x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422(2014).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).</li>
<li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li>
<li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li>
<li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avon+Andrian%2C+UH+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).</li>
<li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li>
<li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+%28IRI%29+of+the+rat+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).</li>
<li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457(2019).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).</li>
<li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

IVM als methode is veel gebruikt om verschillende celtypes in verschillende organen te bestuderen en is uitgebreid beschreven en besproken19. Het belangrijkste doel van deze studie is om een efficiënte aanpak te bieden voor het opzetten en uitvoeren van IVM in de cremaster spier. Het beoefenen van de methode zal betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren. Planning en standaardisatie zijn dus belangrijke factoren om de techniek onder de knie te krijgen. Bovenal is de techniek zeer afhankel...

Intravital microscopie (IVM) is een veel toegepast instrument op het gebied van leukocytenbiologie. Leukocyten rekrutering volgt een cascade van goed gedefinieerde gebeurtenissen geïnitieerd door leukocyten vangen, rollen en hechting aan de endotheelwand, en ten slotte transmigratie en extravasatie van leukocyten naar de werkelijke plaats van ontsteking1. Elke stap wordt bemiddeld en gecontroleerd door verschillende chemokines (bijvoorbeeld IL-8/CXCL8), receptoren (bijvoorbeeld LFA-1, Mac-1) en bijbehorende endotheelcelhechtingsmoleculen (bijvoorbeeld ICAM-1, VCAM-1 en E-Selectin)2,3. De interactie van verschillende regelgevende sites, controlerende factoren en bemiddelaars van de leukocyten rekruteringcascade zoals receptor van geavanceerde glycatieeindproducten (RAGE), intercellulaire hechtingsmolecuul 1 (ICAM-1), C-X-C motief ligand (CXCL)1/2 en hun receptor CXCR2 werden ontdekt met behulp van IVM4,5,6,7,8,9.
De methode van IVM is beschreven voor veel verschillende organen en weefsels zoals de darm10, huid11, lymfeklieren12, de embryonale dooier zak13 en anderen. Echter, de meest bestudeerde methode van IVM is de cremaster model, voor het eerst beschreven bij ratten14. Terwijl nog steeds gebruikt bij ratten15, de methode wordt tegenwoordig vooral toegepast in muizen als gevolg van de hoge overvloed aan verschillende transgene lijnen. Onze groep heeft onlangs gewezen op de potentiële rol van cremaster IVM op het gebied van inflammatoire muscolopathies zoals Duchenne Spierdystrofie (DMD) bestuderen dystrophin-deficiënte mdx muizen16. Door zijn dunne verweven en gemakkelijk toegankelijke vezelsamenstelling vertegenwoordigt de cremaster spier de ideale kandidaatspier die als geheel moet worden bestudeerd met behulp van lichte of fluorescerende microscopie. Leukocyte nevenwerving en extravasatie vinden voornamelijk plaats in postcapillaire venules, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd op een continue spierlaag in de cremaster spier.
Het voordeel van in vivo beeldvorming in vergelijking met andere in vitro testen is de biologische context in een levend organisme. Tegelijkertijd kan het afdekken van celspecifieke bijdragen aan gewijzigde leukocytenwerving aanvullende in vitro modellen vereisen, zoals stroomkamers of endotheliale tests. De combinatie van meerdere methoden levert de meeste overtuigende gegevens op. Wetenschappers moeten zich bewust zijn van de beperkingen van de cremaster model als een chirurgische manipulatie zal leiden tot meer leukocyten handel en werving. Daarom is baseline recruitment moeilijk in te schatten met deze methode. Ondanks de brede toepassing, IVM van de cremaster kan een uitdaging zijn en een nieuwe setup kan tijd en middelen te vestigen. We bieden nu een eenvoudig protocol dat zal helpen om een aantal van de gemeenschappelijke fouten in IVM te voorkomen. Ook zullen beperkingen worden besproken en gratis methoden zullen worden gemarkeerd waar van toepassing.
IVM van de cremaster vertegenwoordigt een ideale aanpak die moet worden toegepast op het gebied van ontstekings- en infectieuze studies. Meer specifiek kan het cremaster-model van groot belang zijn voor wetenschappers die skeletspierbiologie bestuderen in de context van ontstekingsziekten.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>anesthesie. Generic / IUPAC Naam: ketamine</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Artikelnummer: 1205&nbsp;</td><td>anesthesie. Generic / IUPAC Naam: xylazine (als hydrochloride)</td></tr><tr><td>Zoutoplossing</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>chirurgische voorbereiding. Generic / IUPAC Naam: natriumchloride</td></tr><tr><td>Spuitnaald Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>chirurgische voorbereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Hechtdraad 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>chirurgische voorbereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis #10&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Leveranciersnummer 427401</td><td>chirurgische voorbereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis #90&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Leveranciersnummer 427421</td><td>chirurgische voorbereiding&nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>CAS Nummer 989-38-8&nbsp;</td><td>leukecytenkleurstof. Generic / IUPAC Naam: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoaat</td></tr><tr><td>Instelling Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staande microscoop&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51W1</td><td>microscopie</td></tr><tr><td>40-voudig objectief&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 &times; /0.80 W</td><td>microscopie</td></tr><tr><td>ImSpector software</td><td>Lavision Biotec GmbH</td><td>ver. 4.0.469</td><td>software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td>ver. 1.51j8</td><td>software</td></tr></tbody></table>

leukocyten infiltratie van cremaster spier in muizen beoordeeld door intravital microscopie

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopie (IVM) wordt veel gebruikt om fysiologische en pathofysiologische processen te monitoren binnen de leukocyten rekruteringcascade in vivo. Het huidige protocol vertegenwoordigt een praktische en reproduceerbare methode om de leukocyten endotheelinteractie te visualiseren die leidt tot het rekruteren van skeletspieren in skeletspierafgeleid weefsel in het intacte organisme van de muis. Het model is van toepassing op alle onderzoeksgebieden die zich richten op granulocyteactivering en hun rol bij ziekte.
We bieden een stapsgewijs protocol om de methode te begeleiden en mogelijke valkuilen en technische problemen te benadrukken. Het protocol behandelt de volgende aspecten: experimentele instellingen en vereist materiaal, anesthesie van de muis, dissectie van de cremaster spier evenals tracheale en halsslagader cannulation, IVM opnames en offline analyse. Gegevensformaten zoals aanhangende leukocyten, rolling flux (RF) en rolling flux fraction (RFF) worden in detail uitgelegd en passende toepassingen worden besproken. Representatieve resultaten van dystrofinedeficiënte mdx muizen worden verstrekt in de resultaten sectie.
IVM is een krachtig instrument om de rekrutering van leukocyten in vivo te beoordelen; het afzetten van bijvoorbeeld endotheel- en leukocytenfunctie kan echter een combinatie met ex vivo opstellingen zoals stroomkamerexperimenten vereisen. Bovendien kan de genetische achtergrond van dieren van belang een grote invloed hebben op de aanwerving van basislijnen, waardoor individuele aanpassing van het verstrekte protocol vereist is. Ondanks zijn beperkingen kan IVM dienen als een platform om in vitro bevindingen gemakkelijk te vertalen naar een levend gewerveld organisme.

IVM volgens het meegeleverde protocol zal unieke inzichten opleveren in de cascade van leukocyten rekrutering in skeletspieren. De resultaten sectie zal zich richten op typische resultaten verkregen door IVM en wijzen op potentiële problemen die kunnen tegenkomen.
De experimentele opstelling voor intravitale microscopie wordt beschreven in figuur 1. Voorbereiding van de cremaster spier en verwijdering van bindweefsel is cruciaal om gerichte microscopische beelden ...

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Deze praktische en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om de endotheel leukocyten interacties die leiden tot leukocyte recruitment binnen een intacte muis te visualiseren. Deze techniek presenteert ook een krachtig instrument voor het monitoren van fysiologische en pathofysiologische processen binnen de leukocyte recruitment cascade in vivo. De methode kan worden toegepast in verschillende ontstekings- en septische modellen.Zo hebben we onlangs gewezen op de relevantie ervan in de studie van musculopathieën waarbij overdreven spier leukocyten infiltratie. Onze suggestie aan collega-wetenschappers die overwegen het gebruik van deze techniek is om zo veel hands-on ervaring mogelijk als de methode is zeer gevoelig voor kleine afwijkingen. Het aantonen van de procedure zal Simon Kranig zijn, een clinicus en senior wetenschapper van mijn lab.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in de verdoofde experimentele dier, bevestig de muis in een dorsale ligfiets positie op een 37 graden Celsius verwarming pad en gebruik maken van een niet-onnadrukbare steriele 6-0 hechting om een eenvoudige lus wind rond de frontale tanden. Plak de verbindingsuiteinden van de hechtin

leukocyte-infiltration-cremaster-muscle-mice-assessed-intravital

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een weefsel voorbereiding is beschreven voor visualisatie en experimentele manipulatie van de levende microcirculatie. In verdoofde mannelijke muizen, is de dunne, zeer goed doorbloede cremaster spier voorbereid intravitale microscopie tot microvasculaire netwerken, inclusief arteriolen, capillairen en venulen studie. Dit preparaat wordt gemakkelijk aangepast voor ratten en hamsters.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale...

Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

In vivo beeldvorming van de gewrichten is een waardevolle techniek om het migratiegedrag van leukocyten en moleculaire dynamiek binnen de ontstoken gewrichten te ontdekken. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor in vivo beeldvorming van de gewrichten met behulp van een muismodel van type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA).

In Vivo Beeldvorming onthult het migratiegedrag van leukocyten binnen de gewrichten

Leer intravitale microscopie van post-capillaire venulen in de cremaster spier van muizen. Deze methode visualiseert leukocyten-endotheel interacties en is essentieel voor onderzoek naar ontsteking en sepsis in vivo.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Meer video's verkennen