Name: Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer protocollen voor evaluatie van T-folliculaire helpercellen en kiemcentrum B-cellen tijdens influenza A virusinfectie bij muizen. Deze methode helpt immunologen immunresponsen bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het personeel van flow cytometrie faciliteit, ABSL2 faciliteit en SPF dierlijke faciliteit van Institut Pasteur van Shanghai voor hun technische hulp en advies. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: Strategic Priority Research Program van de Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), de National Natural Science Foundation of China (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege gespecialiseerde rollen in het bieden van B-celhulp voor het genereren van antilichamen met een hoge affiniteit, zijn Tfh-cellen uitgebreid bestudeerd in de mechanismen van differentiatie en manipulatie om nieuwe strategieën voor het ontwerp van vaccins te bieden. Influenzavirusinfectie veroorzaakt krachtige Tfh- en GC B-celresponsen, waardoor het een geschikt model is voor dit onderzoeksveld. In dit artikel beschreven we protocollen van influenzavirusinfectie door intranasale inenting, evaluatie van Tfh-geassoci...

In het afgelopen decennium zijn talrijke studies gericht op de nieuw geïdentificeerde CD4+ T-celsubset, Tfh-celsubset, voor zijn essentiële rollen in de ontwikkeling van het kiemcentrum (GC) B. B-cellymfoom 6 (Bcl6), dat voornamelijk wordt beschouwd als een genrepressor, is de afstammingsbepalende factor van Tfh-cellen voor het bewijs dat ectopische expressie van Bcl6 voldoende is om Tfh-differentiatie aan te drijven, terwijl een tekort aan Bcl6 resulteert in verdwenen Tfh-differentiatie1,2,3. In tegenstelling tot andere CD4+ T helper subsets die hun effectorfunctie uitvoeren door migratie naar de plaatsen van ontsteking, bieden Tfh-cellen de B-cel vooral hulp in de B-cel folliculaire zone van milt en lymfeklier. Co-stimulatory moleculen ICOS en CD40L, spelen een belangrijke rol in de interactie tussen Tfh en GC B cellen. Tijdens Tfh-differentiatie verzendt ICOS de nodige signalen van cognate B-cellen en fungeert het ook als een receptor die migratiesignalen ontvangt van omstander B-cellen voor B-celzonelokalisatie4,5. CD40L is een bemiddelaar van signalen van Tfh-cellen voor de proliferatie en overleving van B-cellen6. Een andere factor die dezelfde rol speelt als CD40L is de cytokine IL21, die voornamelijk wordt uitgescheiden door Tfh-cellen. IL21 reguleert rechtstreeks de ontwikkeling en productie van GC B-cellen van antilichamen met een hoge affiniteit, maar de rol ervan in Tfh-differentiatie is nog steeds controversieel7,8. PD-1 en CXCR5, die nu het meest worden gebruikt bij het identificeren van Tfh-cellen in flowcytometrie-analyse, spelen ook een belangrijke rol in de differentiatie en functie van deze subset. CXCR5 is de receptor van B-cel folliculaire chemokine en bemiddelt de lokalisatie van Tfh-cellen in B-celzakjes9. PD-1 is nu geïdentificeerd om niet alleen de folliculaire geleidingsfunctie te hebben, maar ook kritieke signalen over te brengen tijdens het proces van GC B-cellen affiniteitsrijping10. Op basis van deze bevindingen zou het evalueren van de expressie van deze moleculen in feite de rijping en functie van Tfh-cellen kunnen weerspiegelen.
GC is een geïnduceerde voorbijgaande microanatomische structuur in secundaire lymfoïde organen en sterk afhankelijk van Tfh-cellen, waardoor het een perfecte uitlezing is om de Tfh-respons te evalueren. In GC, na het ontvangen van signalen gemedieerd door cytokines en co-stimulatory moleculen, B cellen zijn onderworpen aan klasse schakelen en somatische hypermutatie om high-affinity antilichamen te genereren11. Differentiële antilichaamklasseschakeling vindt plaats in differentiële cytokine-niche, waarbij IL4 en IL21 IgG1-klasseschakeling induceren, terwijl IFNγ IgG2-klasseschakelinginduceert 12. Plasmacellen zijn de producenten van uitgescheiden antilichamen en zijn terminaal gedifferentieerde cellen. Net als Tfh-cellen wordt de ontwikkeling van B-cellen in GC geassocieerd met dynamische expressie van veel belangrijke moleculen. Op basis van de huidige studie kunnen GC B-cellen worden geïdentificeerd als B220+PNA+Fas+ of B220+GL7+Fas+ cellen en plasmacellen, in vergelijking met hun precursoren, downregulate expressie van B220 en upregulate CD138 expressie13. Bovendien kunnen beide kenmerken worden gedetecteerd in flowcytometrie en immunofluorescentieanalyse, waardoor de GC-respons op de juiste manier wordt geëvalueerd.
Robuuste cellulaire en humorale reacties worden geïnduceerd in influenzavirusinfectie, waarbij Tfh- en Th1-cellen CD4+ T-celrespons14domineren, waardoor het een perfect model is voor Tfh-cellen differentiatiestudie. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), een veelgebruikte muis-aangepaste stam, wordt vaak gebruikt in deze studie14,15,16. Hier beschrijven we enkele basisprotocollen van Tfh-studierelevante test bij influenzavirusinfectie: 1) intranasale inenting van pr8-virus; 2) antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B- en plasmacellen en IL21-detectie met stroomcytometrie; 3) histologische visualisatie van GC; 4) detectie van antigeenspecifieke antilichaamtiter in serum met ELISA. Deze protocollen bieden de nodige technieken voor nieuwe onderzoekers in Tfh-geassocieerde studie.

<table><tbody><tr><td>Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>clone:7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>clone: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>clone:GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>clone:IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>clone:IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>clone:MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>clone:7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>clone:29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>Intracelluar staining of IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>human FCc IL-21 receptor</td><td>R&amp;D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B and plasma cells staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>clone:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>clone:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>clone:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>clone:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Assay of HA-specific antibody titer with ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrate Reagent Set</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>dilute Alexa Fluor 488-streptavidin</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long gold antifade reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van t folliculaire helpercellen en kiemcentrum respons tijdens influenza a virus infectie bij muizen

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Folliculaire Helper (Tfh) cellen zijn een onafhankelijke CD4+ T cel subset gespecialiseerd in het bieden van hulp voor germinaal centrum (GC) ontwikkeling en het genereren van high-affinity antilichamen. Bij influenzavirusinfectie worden robuuste Tfh- en GC B-celresponsen geïnduceerd om effectieve virusuitroeiing te vergemakkelijken, wat een gekwalificeerd muismodel voor Tfh-geassocieerde studie oplevert. In dit artikel beschreven we protocollen bij de detectie van basis Tfh-geassocieerde immuunrespons tijdens influenzavirusinfectie bij muizen. Deze protocollen omvatten: intranasale inenting van het influenzavirus; flowcytometriekleuring en analyse van polyklonale en antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B-cellen en plasmacellen; immunofluorescentiedetectie van GCs; enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) van influenzavirusspecifiek antilichaam in serum. Deze tests kwantificeren in feite de differentiatie en functie van Tfh-cellen bij influenzavirusinfectie, waardoor hulp wordt geboden voor studies naar het ophelderen van differentiatiemechanisme en manipulatiestrategie.

Karakterisering van de morbiditeit van de muis bij influenzavirusinfectie Na influenzavirusinfectie zijn muizen minder actief en anorexia als gevolg van ziekte, wat wordt weerspiegeld door ernstig gewichtsverlies, een veelgebruikt symptoom om de morbiditeit van de muis te controleren19. Zoals getoond in figuur 1a,begonnen met het PR8-virus geïnfecteerde muizen gewicht te verliezen op dag 6, bereikten het hoogste verliesniveau op d...

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

T-folliculaire helpercellen zijn een nieuw geïdentificeerd subset van CD4 T-cellen die hulp bieden aan B-cellen bij de productie van hoogwaardige antilichamen. Het aantonen van de identificatie van Tfh-cellen bij een influenzavirusinfectie zal nieuwe onderzoekers helpen begrijpen hoe ze de nodige technieken voor Tfh-geassocieerde studies moeten uitvoeren. Omdat een onjuiste virustiter mortaliteit of een te zwakke immuunrespons kan veroorzaken, adviseren we dat de titer wordt bepaald voordat een experiment wordt uitgevoerd.Voor PR8-virusinoculatie van acht weken oude mannelijke C57 zwarte 6 muizen. Onder bioveiligheidsniveau 2-condities, ontdooi een opgeslagen PR8-virusstock van min 80 graden Celsius op ijs. Vortex de virus om een homogene oplossing te verkrijgen.Verdun het virus tot twee platforming eenheden per microliter van PBS in een voorgekoelde 1,5-milliliter buis en bevestig een gebrek aan reactie op het knijpen in de geanesthetiseerde dieren. Vortex de virus opnieuw. Laad een 20-microliter pipettentip met 10 microliters virus.Voeg voorzichtig druppels virus toe aan één naris van maximaal drie gesedateerde dieren voordat u de inoculatie aan de andere kant herhaalt. Plaats vervolgens alle muizen in sternal recumbency in warme kooien met monitoring tot volledige herstel, en weeg elke muis dagelijks gedurende 10 dagen. Aan het einde van het experiment plaatst u de muizen in een bioveiligheidsniveau 2 laminar flow hood, en bevestigt u het eerste dier aan een absorberend, papier bedekt schuim dissectiebord.Gebruik dissectiescharen om de huid langs de buikmiddellijn te snijden, de huid te strekken met een pincet en de huid op het dissectiebord vast te maken. Open het peritoneum om de milt te verzamelen en plaats de milt in een 70-micrometer filter met een 6-centimeter schotel bevattend 5 milliliters DMEM gesupplementeerd met 1%FBS. Splits het middenrif en de ribben tot aan de thymus en bevestig de rib aan de zijkant om de borstholte te onthullen.Verplaats de long en het hart om de mediastinale lymfeknood nabij de ventrale zijde van de trachea te lokaliseren. Plaats vervolgens de lymfeknood in zijn eigen zeef in een tweede 6-centimeter schotel bevattend 5 milliliters medium en gebruik 3-milliliter spuitkolven om beide weefsels voorzichtig door het gaas van beide zeefvlakken te malen. Spoel elke zeef met 1 milliliter vers DMEM plus FBS, en breng de celsuspensies over naar afzonderlijke 15-milliliter centrifugebuizen.Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellets grondig in 1 milliliter vers DMEM plus FBS per buis. Voeg vervolgens vier extra milliliters medium toe aan de miltcelsuspensie en plaats beide buizen op ijs. Om de cellen te kleuren voor CXCR5-expressie, draai de buis meerdere keren om te mengen en breng 2 keer 10 tot de 6 cellen per monster over naar individuele FACS-buizen.Voeg 2 milliliters kleurbuffer toe aan elke buis en meng de cellen door te vortexen. Pellet de cellen door centrifugatie en gooi de supernatanten weg. Tik voorzichtig elke buis twee keer op absorberend papier en klik voorzichtig met de twee onderkanten om de cellen in het resterende supernatant te hersuspenderen.Blokkeer de niet-specifieke binding met 0,2 microliters Fc-receptorblok per buis en klik voorzichtig met de buis om te mengen voordat u de buizen gedurende 10 minuten op ijs plaatst. Aan het einde van de incubatie, voeg 0,3 microliters biotin anti-muis CXCR5 toe aan elke buis en meng door voorzichtig te klikken. Plaats de buizen gedurende één uur op ijs met voorzichtig klikken om de 30 minuten.Aan het einde van de incubatie, voeg 2 milliliters kleurbuffer toe aan de buizen en vortex om te mengen voordat u de cellen door centrifugatie sedimenteert. Gooi de supernatant weg en klik om de cellen in het resterende buffer op te schorsen. Plaats vervolgens de buizen op ijs en label de cellen met antilichamen tegen het oppervlaktemarkeringsmolecuul van belang zoals uiteengezet in de tabel zoals net gedemonstreerd.Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 2 milliliters kleurbuffer en suspendeer elke pellet in 400 microliters verse kleurbuffer voor analyse door middel van flowcytometrie. PR8-virus geïnfecteerde muizen beginnen op dag zes gewicht te verliezen, bereiken het hoogste verlies op dag acht en keren terug naar de initiële gewichtsniveaus op dag 10. Zoals verwacht, wordt gewichtsverlies niet waargenomen bij PBS-behandelde controlemuizen.Virusinfectie leidt ook tot een robuuste lymfocytexpansie binnen de drainerende lymfeknood. Zoals waargenomen door flowcytometrische analyse, initialiseert differentiatie van T-folliculaire helpercellen op dag vijf en bereikt het een piek op dag 10 na infectie met robuuste aantallen van T-folliculaire helpercellen geïnduceerd bij influenzavirus geïnfecteerde muizen vergeleken met controledieren. Verder, in zowel mediastinale lymfeknopen als milten, worden influenza-antigeenspecifieke CD4-positieve T-cel aantallen significant geïnduceerd vergeleken met die waargenomen bij controlemuizen met verhoogde populaties van PD-1 positieve CXCR5-positieve cellen in PR8-dieren.Bovendien onthult intracellulaire kleuring voor IL-21 dat PR8-infectie significant hogere productie van deze cytokine induceert als reactie op virusinfectie. Immunofluorescente kleuring geeft de aanwezigheid van een geïnduceerde germinale centrumreactie in PR8-geïnfecteerde muizen aan, en ELISA toont de generatie van influenzavirus-specifieke antilichamen in virus-geïnfecteerde dieren. Het is belangrijk om de CXCR5-kleuring een uur op ijs uit te voeren, omdat de kwaliteit van de kleuring wordt beïnvloed door de kleuringstemperatuur en de tijd.Hoewel we CXR5 en IL-21-kleuring hebben gedemonstreerd, kunnen andere oppervlaktemarkers, transcriptiefactoren en cytokinen worden beoordeeld met deze methode om veel informatie te verstrekken over Tfh-differentiatie en functie.

evaluation-t-follicular-helper-cells-germinal-center-response-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Twee op flowcytometrie gebaseerde methoden – een in vitro T-cel priming test en intracellulaire cytokine kleuring werden gebruikt om de antigeenpresenterende capaciteit van dendritische cellen en antigeenspecifieke T-celreacties op een West Nile-virus mutant infectie bij muizen te meten.

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel voor de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om polymicrobiële en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen tijdens de verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen verschillende gastheren.

Een muismodel voor de overgang van Streptococcus pneumoniae van kolonisator naar pathogeen bij virale co-infectie vat leeftijdsverergerde ziekte samen

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

Leer protocollen voor evaluatie van T-folliculaire helpercellen en kiemcentrum B-cellen tijdens influenza A virusinfectie bij muizen. Deze methode helpt immunologen immunresponsen bestuderen.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Meer video's verkennen