Name: Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Leer de dynamiek van Dpp-afgifte visualiseren in Drosophila-vleugelschijven met behulp van fluorescentiebeeldvorming. Deze methode onthult genetische en omgevingsfactoren die de ontwikkeling beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Sarala Pradhan bedanken voor het werken aan een eerdere versie van dit protocol. We willen NSF-IOS 1354282 bedanken voor de financiering terwijl we dit protocol ontwikkelden. We willen NIH-NIDCR RO1DE025311 bedanken voor het financieren van ons lab op dit moment.

1. eieren verzamelen om larven voor dissectie te genereren
<ol><li>Cross 30-40 Maagd vrouwelijke DPP-GAL4/TM6 TB hu vliegt naar 10-15 mannelijke SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB hu. Opmerking: Elke twee genotypen die DPP-GAL4 en UAS-DPP-GFP bevatten, mogen worden gebruikt zolang de load balancers larvale markers hebben die de geschikte nakomelingen tijdens de larvale fase kunnen selecteren.</li>
	<li>Om eieren te verzamelen, draai de gekruiste vliegen in een frisse flacon met voedsel en laat ze 3 – 4 uur leggen voordat ze uit de injectieflacon worden gehaald. Om het leggen van eieren aan te moedigen, kan een kleine hoeveelheid gist pasta gemaakt van gegranuleerde gist vermengd met een kleine hoeveelheid water aan de bovenkant van het voedsel worden toegevoegd voordat de vliegen worden geïntroduceerd in de injectieflacon. Dezelfde reeks gekruiste vliegen kan worden gehouden en gebruikt voor maximaal 7 dagen van ei collecties. Opmerking: Elk standaard Drosophila maïsmeel voedsel recept moet aanvaardbaar zijn. Hier wordt het voedsel recept beschreven door Hazegh en reis20.</li>
	<li>Bewaar de Eier collectie flesjes bij 25 °C gedurende ongeveer 144 uur totdat larven zich in het derde INSTAR (zwervende) stadium bevinden.</li>
	<li>Om de geschikte larven voor dissectie te selecteren (die zowel DPP-GAL4 als UAS-DPP-GFP uitdrukken) Kies eerst larven die niet-TB zijn. Deze larven zijn normale lengte in plaats van kort en vet.</li>
	<li>Onder de niet-TB larven zijn er larven die CyO-GFP uitdrukken en larven die DPP-GFP uitdrukken. Om de DPP-GFP uit te kiezen die larven uitdrukt, Bekijk ze onder een fluorescentie stereomicroscoop. Hoewel zowel DPP-GFP als CyO-GFP die larve uitdrukt een zekere GFP-fluorescentie zal hebben, kan de DPP-GFP die larven uitdrukt, worden onderscheiden doordat de GFP beperkt is tot de vleugel schijven en de fluorescentie veel minder helder is dan de CyO-GFP die larven uitdrukt. Selecteer deze minder heldere larven voor dissectie.</li>
</ol>2. oplossing voorbereiden voor larvale beeldvorming en dissectie
<ol><li>Voor Live beeldvorming van vleugel schijven, bereid gemodificeerde HL3 media21 (70 mm NaCl, 5 mm kcl, 1,5 mm CACL2 Dyhydraat, 4 mm MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose DYHYDRAAT, 115 mm sucrose, 5 mm Hepes). Met deze media kan de vleugel schijf in leven worden gehouden voor Imaging21.</li>
	<li>Pas de pH op 7,1 met behulp van HEPES en filter met een 0,22 μm filter. Gebruik deze media voor zowel de dissecties van de vleugel schijf als de montage media voor Live Imaging.</li>
</ol>3. Dia's voorbereiden voorvleugel schijf montage
<ol><li>Plaats twee stukjes kleurloze dubbelzijdige tape in de breedte van een Microscoop-dia, waardoor er een ruimte van ongeveer 5 mm tussen zit. De stukken tape moet lang genoeg zijn dat de uiteinden van de tape liggen vlak met de randen van de Microscoop-dia.</li>
	<li>Gebruik een platte rand (zoals het handvat-uiteinde van een paar ontleden Tang) om de tape stevig op de dia te drukken, zodat er geen media eronder kunnen sijpelen.</li>
	<li>Plaats 25 μL gemodificeerde HL3 media tussen de twee stukken tape. De vleugel schijf wordt in deze druppel media tussen stukjes tape gemonteerd, zodat de tape voorkomt dat de afdekplaat de schijf verpletterd (Figuur 1a).</li>
</ol>4. ontleden en monteren van vleugel schijven voorbeeld vorming
<ol><li>Dissect larven in de voorbereide gemodificeerde HL3 media26.</li>
	<li>Voorzichtig scheuren larven in tweeën met behulp van twee paren van de Tang en gooi de achterste helft van de larve.</li>
	<li>Pak het midden van de voorste helft van de larve met één paar tang en gebruik een ander paar gesloten tang om de mond haken terug in de larve te duwen totdat de larve volledig is omgekeerd.</li>
	<li>De vleugel schijven kunnen gemakkelijk worden gevonden door te zoeken naar de scherpe bochten in de twee donkerdere gekleurde primaire takken van de tracheae die langs beide zijden van de larven lopen. De vleugel schijven liggen direct onder deze bochten in de tracheae in een omgekeerde larve.</li>
	<li>Verwijder de vleugel schijven voorzichtig en breng ze over naar de 25 μL van HL3 media op de voorbereide Microscoop-dia. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen stukjes luchtpijp aan de ontleed vleugel schijven worden bevestigd, omdat dit de schijven kan laten zweven, waardoor beeldvorming moeilijk wordt.</li>
	<li>Plaats de vleugel schijf zodanig dat de peripodial zijde van het vleugel zakje naar boven is gericht, weg van de Microscoop glijbaan met de schijf plat (Zie Figuur 1A, B).</li>
	<li>Bedek de vleugel schijf en tape met een dekslip en sluit de afdekplaat af met nagellak. Zodra de Polish droog is, gaat u onmiddellijk verder met de onderstaande beeldvormings stappen.</li>
</ol>5. Imaging DPP release
<ol><li>Beeld de gemonteerde vleugel schijf met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40x olie doelstelling en 488 nm laser. De DPP-GFP moet verschijnen als een streep van GFP fluorescentie in het midden van de vleugel schijf met kleine puncta van DPP-GFP wordt vrijgelaten uit deze middelste streep van cellen.</li>
	<li>Verzamel beelden met een snelheid van 2 Hz gedurende 2 minuten om de DPP-release te visualiseren. Voor de beste resultaten stelt u de laser in op een instelling die alleen sterk genoeg is om een duidelijk beeld te krijgen van de DPP-Releasing cellen om te voorkomen dat ze overbleken tijdens de beeld verzameling. De beelden kunnen worden verzameld als een tijdreeks die vervolgens kan worden geëxporteerd als AVI-bestanden (geen compressie, 3 frames/s) om videobestanden van de DPP-release te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li>
<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member%2C+decapentaplegic%2C+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li>
<li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li>
<li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li>
<li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks%3A+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li>
<li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li>
<li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product%3A+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li>
<li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+serine%2Fthreonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li>
<li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development%3A+from+Mad+to+Smads%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inwardly+rectifying+K%2B+channel+is+required+for+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li>
<li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li>
<li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

BMPs zoals DPP maken hun aanzienlijke impact wanneer ze een complex van membraan gebonden receptoren binden aan een cascade van intracellulaire signalering in naburige of schijnbaar verre cellen veroorzaken. Het lab van Dr. Thomas Kornberg heeft aangetoond dat cellen die de DPP-signaal contact cellen produceren die het signaal ontvangen met behulp van actine-gebaseerde dunne filapodia-achtige structuren genaamd cytonemes15,24,25...

Botmorfogenetische eiwitten (BMPs) zijn essentieel voor de vroege embryogenese en het patroon van volwassen structuren. Bmp's worden geproduceerd en uitgescheiden om de transcriptie te beïnvloeden van doel genen die nodig zijn voor groei en celdifferentiatie in reagerende cellen. Decapentaplegic (DPP) is een Drosophila homo van BMP4 dat belangrijk is voor de ontwikkeling van embryonale en volwassen structuren zoals de vleugel1,2,3,4. Verschillende groepen hebben zich geconcentreerd op de rol van DPP in patronen Adult Fly Wings omdat 1) de vleugels bestaan uit twee transparante epitheelia vellen met een consistent venatie patroon dat gemakkelijk kan worden beoordeeld; 2) de vleugel schijven zijn ook redelijk plat, kunnen worden gekweekt buiten de larve, en zijn eenvoudig te beeld en kwantificeren verschillen in patroon; en 3) de vleugel patroon ontwikkeling is gevoelig voor DPP zodanig dat kleine verstoringen in het traject van invloed zijn op het vleugel nerven patroon.
DPP wordt geproduceerd in cellen die zich in de voorste/achterste grens van de vleugel schijf5,6,7,8bevinden. DPP bindt aan een complex van type 1 en type 2 serine/Threonine kinase receptoren9,10. Bij DPP binding, de type 2-receptor fosforyleert de type 1-receptor die vervolgens fosforyleert moeders tegen DPP (MAD), een smad 1/5/8 homolog. Gefosforyleerd SMAD rekruteert een extra co-smad (Medea), die het mogelijk maakt om naar de Nucleus te gaan waar het doel genen reguleert, wat leidt tot downstream effecten zoals proliferatie of differentiatie4,11.
Onlangs heeft het Bates-laboratorium aangetoond dat de onjuiste afgifte van DPP binnen de vleugel schijf kan leiden tot een afname van de Mad fosforylering, vermindering van de doel-genexpressie en vleugel patronen van defecten12,13. Verschillende ionenkanalen beïnvloeden de ontwikkeling van de Drosophila vleugel en bijbehorende structuren14,15. Deze ionenkanalen kunnen ook worden betrokken bij de DPP-release. Bij het bepalen van het mechanisme van de morfogen release is het belangrijk dat er een methode is om vrijgave gebeurtenissen te visualiseren.
Drs. Aurelio Teleman en Stephen Cohen creëerde een DPP-GFP fusie-eiwit dat in staat is om verlies van DPP te redden, wat betekent dat het biologisch actief is en wordt vrijgegeven op een biologisch relevante manier16. Hier beschrijven we hoe we DPP release Events visualiseren met behulp van deze DPP-GFP. Dit fusie-eiwit is vooral nuttig omdat GFP pH-gevoelig is, zodat wanneer het in zure blaasjes is, de fluorescentie17wordt geblust. Daarom, wanneer een eiwit gelabeld met GFP is vrijgelaten uit een blaasje in de meer neutrale extracellulaire omgeving, GFP fluorescentie intensiteit stijgt17. We maakten gebruik van de pH-gevoeligheid van GFP om te bepalen of DPP-GFP zich in zure blaasjes bevindt. We afbeelding gemaakt vleugel schijven uitdrukken DPP-GFP voor en na de toevoeging van ammoniumchloride, die neutraliseert intracellulaire compartimenten blaasjes18. We vonden een significante toename van de fluorescentie van puncta na de toevoeging van ammoniumchloride, wat suggereert dat intracellulaire DPP-GFP wordt opge-blust vóór de toevoeging van ammoniumchloride18. We concluderen dat intracellulaire DPP-GFP zich in zure membraan-gebonden compartimenten bevindt, zoals blaasjes, en wordt ongeblust bij toevoeging van ammoniumchloride om de pH van intracellulaire compartimenten18te neutraliseren. Dit maakt live beeldvorming van DPP-GFP een bruikbare techniek om de dynamiek van DPP in de Drosophila-vleugel schijf te visualiseren, omdat deze uit zure compartimenten in de extracellulaire omgeving wordt vrijgegeven.
Hier beschrijven we de methode die we gebruiken om DPP-release-gebeurtenissen te visualiseren met behulp van DPP-GFP. DPP-GFP kan worden uitgedrukt in het oorspronkelijke patroon in Drosophila vleugel schijven met behulp van het UAS-GAL4 systeem19. Dit is de methode die werd gebruikt om te bepalen dat IRK kanalen invloed DPP release18. We hebben de methode gevalideerd door Live-Imaging z-stacks. We zien niet DPP-GFP puncta verplaatsen binnen het vlak van focus in time series als we in één vlak van focus verworven. We zien ook geen beweging van DPP-GFP puncta als we in een z-stack hebben gefotografeerd. We concluderen dat de DPP-GFP puncta gezien met behulp van deze methode release-gebeurtenissen in plaats van beweging van blaasjes intracellularly. Deze methode van Live-Imaging van DPP-GFP kan mogelijk worden gebruikt voor het testen van andere putatieve modifiers van DPP vrijlating voor hun impact op DPP dynamiek of kan worden aangepast om te kijken naar de dynamiek van andere liganden

<table><tbody><tr><td>Baker's yeast</td><td>Red Star</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2 dyhydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>484-457</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>Deze voorraad zal binnenkort beschikbaar zijn bij Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>Deze voorraad zal binnenkort beschikbaar zijn bij Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>Forceps voor dissectie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC193780010</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>Breiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223210010</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8400</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>RPI</td><td>S22060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Electron Micsroscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour</td><td>ADM Specialty Ingredients</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose dyhydrate</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00766</td><td></td></tr><tr><td>Yellow Corn Meal</td><td>Quaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscoop voor live imaging</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscoop voor dissecties</td></tr></tbody></table>

imaging dpp-release van een drosophila -vleugel schijf

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

De transformerende groei factor-Beta (TGF-β) superfamilie is essentieel voor het vroege embryonale patroon en de ontwikkeling van volwassen structuren in multicellulaire organismen. De TGF-β superfamilie omvat TGF-β, Bone morphogenetische proteïne (BMPs), Activins, groei-en differentiatie factoren, en Nodals. Het is al lang bekend dat de hoeveelheid ligand blootgesteld aan cellen is belangrijk voor de gevolgen ervan. Er werd gedacht dat lange-afstand concentratie gradiënten embryonale patroon instellen. Onlangs is echter duidelijk geworden dat de timing van blootstelling aan deze liganden ook belangrijk is voor hun stroomafwaartse transcriptionele gevolgen. Een TGF-β superfamilie ligand kan geen ontwikkelings consequentie hebben totdat het vrijkomt uit de cel waarin het werd geproduceerd. Tot voor kort was het moeilijk om te bepalen wanneer deze liganden uit cellen werden vrijgelaten. Hier laten we zien hoe de afgifte van een Drosophila BMP met de naam Decapentaplegic (DPP) uit de cellen van de Wing primordium of Wing disc te meten. Deze methode kan worden gewijzigd voor andere systemen of de signalering van liganden.

Afbeelding 2 toont representatieve Live-Imaging resultaten van dit protocol. Wanneer het protocol succesvol is, kan DPP-GFP worden gezien als een streep in het midden van de vleugel schijf met kernen die zichtbaar zijn als niet-fluorescerende cirkels binnen de DPP-GFP-regio (Figuur 2). DPP-GFP-release is zichtbaar als fluorescerende puncta die verschijnen en verdwijnen. We hebben waargenomen DPP-GFP fluorescentie verschijnen en verdwijnende in de cellichamen en ...

De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.

Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP beïnvloedt cellot door receptoren te binden en een signaal intracellularly aan affect transcriptie te verzenden. Als DPP wordt geproduceerd, maar niet vrijgegeven, heeft het geen toegang tot receptoren en kan het daarom zijn rollen niet uitvoeren. Deze techniek maakt het mogelijk om DPP release te visualiseren waardoor onderzoekers kunnen onderzoeken welke genetische en omgevingsfactoren DPP release dynamics veranderen.De BMP signaleringsroute wordt bewaard van vliegen naar mensen, dus we verwachten dat het mechanisme dat DPP-release dicteert ook relevant zal zijn voor menselijke ontwikkeling en regeneratie. Begin met het oversteken van 30 tot 40 maagdelijke vrouwelijke DPP GAL4 vliegt met 10 tot 15 mannelijke UAS DPP-GFP vliegen. Moedig het leggen van eieren aan door een kleine hoeveelheid gistpasta toe te voegen aan een verse flacon van voedsel.Om de eieren te verzamelen, draai de gekruiste vliegen in de flacon en laat ze leggen voor drie tot vier uur voor het verwijderen van hen. Houd de eierfolen ongeveer 144 uur op 25 graden Celsius totdat de larven zich in het derde instar-stadium bevinden. Selecteer vervolgens de juiste larven voor dissectie.Kies eerst larven die niet-tbc zijn, wat een normale lengte zal zijn in plaats van kort en vet. Als u de DPP-GFP-uitdrukkende larven wilt selecteren, bekijkt u ze onder een fluorescentiestereoscoop. Alle niet-tbc-larven zullen wat fluorescentie hebben, maar de GFP is beperkt tot de vleugelschijven en is minder helder op de DPP-GFP-larven.Bereid gewijzigde HL3 media volgens manuscript richtingen die de vleugel schijven in leven zal houden voor beeldvorming. Pas de pH aan op 7.1 met HEPES en filter deze vervolgens door een filter van 0,22 micrometer. Plaats twee stukken van kleurloze dubbelzijdige tape breedte verstandig over een microscoop dia waardoor een ruimte van ongeveer vijf millimeter tussen hen en ervoor te zorgen dat de uiteinden van de tape liggen gespoeld met de randen van de dia.Gebruik een platte rand om de tape stevig op de glijbaan te drukken. Voeg 25 microliter van de gemodificeerde HL3-media toe tussen de twee stukjes tape. Wanneer de vleugelschijf in de media wordt gemonteerd, zullen de stukken van band het van het verpletterd door coverslip verhinderen.Om de larve te ontleden, plaats deze in de gemodificeerde HL3-media en scheur het voorzichtig doormidden met twee paar tangen. Gooi de achterste helft, dan pak het midden van de voorste helft met een paar tangen en gebruik het andere paar om de mondhaken terug te duwen in de larve totdat het volledig omgekeerd. Kijk voor de scherpe bochten in de twee donkerder gekleurde primaire takken van de luchtpijp die langs beide zijden van de larve lopen.De vleugelschijven liggen direct eronder. Verwijder voorzichtig de schijven en zet ze in de HL3 media op de voorbereide dia ervoor te zorgen dat er geen stukken van luchtpijp zijn nog steeds bevestigd aan de schijven. Schik de vleugelschijven zo dat de peripodiale kant van het vleugelzakje naar boven wordt gericht met de schijf die plat ligt.Bedek de vleugel met een coverslip en sluit af met nagellak. Zodra de polish droog is, onmiddellijk verder gaan met de beeldvorming. Beeld de gemonteerde vleugel schijf met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40X olie doelstelling en een 488 nanometer laser.Verzamel beelden met een snelheid van twee hertz gedurende twee minuten. Voor de beste resultaten, stel de laser kracht net sterk genoeg om een duidelijk beeld van de DPP-vrijgevende cellen te krijgen om te voorkomen dat over bleken. Verzamel de afbeeldingen als een tijdreeks en exporteer ze als AVI-bestanden om een video van de DPP-release te verkrijgen.Wanneer het protocol succesvol is, verschijnt DPP-GFP als een streep in het midden van de vleugelschijf met kernen die zichtbaar zijn als niet-fluorescerende cirkels. DPP-GFP release is zichtbaar als fluorescerende puncta die verschijnen en verdwijnen zowel in als ver weg van de cellichamen. De verschillende puncta zijn waarschijnlijk in cytonemes of bij cytonemes synapsen.De vleugelschijven zijn zo gemonteerd dat de beeldvorming vanaf de peripodiale kant wordt uitgevoerd. Als de vleugel schijf is afgebeeld vanaf de keerzijde, de DPP-GFP fluorescentie zal verschijnen onscherp en resolutie zal slecht zijn. Wanneer GFP niet is gesmolten tot DPP, worden er geen puncta buiten de cellichamen waargenomen.Deze controle toont aan dat DPP-GFP zich anders gedraagt dan alleen GFP. Bovendien verschijnt er geen fluorescerende puncta wanneer DPP-GFP niet wordt uitgedrukt. Tijdens deze procedure is het belangrijk dat de vleugelschijf peripodial side up is gemonteerd.Als de vleugelschijf verkeerd georiënteerd is, zal DPP-GFP onscherp verschijnen. Deze methode kan worden gebruikt om de release van andere ontwikkelingssignalerende liganden zoals wingless of egel te bestuderen. We kunnen alle verschillende omgevings- en genetische factoren verkennen die de afgifte van DPP kunnen beïnvloeden.Daarnaast kunnen we deze methode aanpassen om BMP-afgifte van andere celtypen te bestuderen.

imaging-dpp-release-from-a-drosophila-wing-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Beschrijven we een nieuw rood fluorescerend eiwit (RFP) reporter dat specifiek wordt uitgedrukt in...

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer de dynamiek van Dpp-afgifte visualiseren in Drosophila-vleugelschijven met behulp van fluorescentiebeeldvorming. Deze methode onthult genetische en omgevingsfactoren die de ontwikkeling beïnvloeden.

Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

Meer video's verkennen