Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf
30 oktober 2019
De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.
DPP beïnvloedt cellot door receptoren te binden en een signaal intracellularly aan affect transcriptie te verzenden. Als DPP wordt geproduceerd, maar niet vrijgegeven, heeft het geen toegang tot receptoren en kan het daarom zijn rollen niet uitvoeren. Deze techniek maakt het mogelijk om DPP release te visualiseren waardoor onderzoekers kunnen onderzoeken welke genetische en omgevingsfactoren DPP release dynamics veranderen.
De BMP signaleringsroute wordt bewaard van vliegen naar mensen, dus we verwachten dat het mechanisme dat DPP-release dicteert ook relevant zal zijn voor menselijke ontwikkeling en regeneratie. Begin met het oversteken van 30 tot 40 maagdelijke vrouwelijke DPP GAL4 vliegt met 10 tot 15 mannelijke UAS DPP-GFP vliegen. Moedig het leggen van eieren aan door een kleine hoeveelheid gistpasta toe te voegen aan een verse flacon van voedsel.
Om de eieren te verzamelen, draai de gekruiste vliegen in de flacon en laat ze leggen voor drie tot vier uur voor het verwijderen van hen. Houd de eierfolen ongeveer 144 uur op 25 graden Celsius totdat de larven zich in het derde instar-stadium bevinden. Selecteer vervolgens de juiste larven voor dissectie.
Kies eerst larven die niet-tbc zijn, wat een normale lengte zal zijn in plaats van kort en vet. Als u de DPP-GFP-uitdrukkende larven wilt selecteren, bekijkt u ze onder een fluorescentiestereoscoop. Alle niet-tbc-larven zullen wat fluorescentie hebben, maar de GFP is beperkt tot de vleugelschijven en is minder helder op de DPP-GFP-larven.
Bereid gewijzigde HL3 media volgens manuscript richtingen die de vleugel schijven in leven zal houden voor beeldvorming. Pas de pH aan op 7.1 met HEPES en filter deze vervolgens door een filter van 0,22 micrometer. Plaats twee stukken van kleurloze dubbelzijdige tape breedte verstandig over een microscoop dia waardoor een ruimte van ongeveer vijf millimeter tussen hen en ervoor te zorgen dat de uiteinden van de tape liggen gespoeld met de randen van de dia.
Gebruik een platte rand om de tape stevig op de glijbaan te drukken. Voeg 25 microliter van de gemodificeerde HL3-media toe tussen de twee stukjes tape. Wanneer de vleugelschijf in de media wordt gemonteerd, zullen de stukken van band het van het verpletterd door coverslip verhinderen.
Om de larve te ontleden, plaats deze in de gemodificeerde HL3-media en scheur het voorzichtig doormidden met twee paar tangen. Gooi de achterste helft, dan pak het midden van de voorste helft met een paar tangen en gebruik het andere paar om de mondhaken terug te duwen in de larve totdat het volledig omgekeerd. Kijk voor de scherpe bochten in de twee donkerder gekleurde primaire takken van de luchtpijp die langs beide zijden van de larve lopen.
De vleugelschijven liggen direct eronder. Verwijder voorzichtig de schijven en zet ze in de HL3 media op de voorbereide dia ervoor te zorgen dat er geen stukken van luchtpijp zijn nog steeds bevestigd aan de schijven. Schik de vleugelschijven zo dat de peripodiale kant van het vleugelzakje naar boven wordt gericht met de schijf die plat ligt.
Bedek de vleugel met een coverslip en sluit af met nagellak. Zodra de polish droog is, onmiddellijk verder gaan met de beeldvorming. Beeld de gemonteerde vleugel schijf met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40X olie doelstelling en een 488 nanometer laser.
Verzamel beelden met een snelheid van twee hertz gedurende twee minuten. Voor de beste resultaten, stel de laser kracht net sterk genoeg om een duidelijk beeld van de DPP-vrijgevende cellen te krijgen om te voorkomen dat over bleken. Verzamel de afbeeldingen als een tijdreeks en exporteer ze als AVI-bestanden om een video van de DPP-release te verkrijgen.
Wanneer het protocol succesvol is, verschijnt DPP-GFP als een streep in het midden van de vleugelschijf met kernen die zichtbaar zijn als niet-fluorescerende cirkels. DPP-GFP release is zichtbaar als fluorescerende puncta die verschijnen en verdwijnen zowel in als ver weg van de cellichamen. De verschillende puncta zijn waarschijnlijk in cytonemes of bij cytonemes synapsen.
De vleugelschijven zijn zo gemonteerd dat de beeldvorming vanaf de peripodiale kant wordt uitgevoerd. Als de vleugel schijf is afgebeeld vanaf de keerzijde, de DPP-GFP fluorescentie zal verschijnen onscherp en resolutie zal slecht zijn. Wanneer GFP niet is gesmolten tot DPP, worden er geen puncta buiten de cellichamen waargenomen.
Deze controle toont aan dat DPP-GFP zich anders gedraagt dan alleen GFP. Bovendien verschijnt er geen fluorescerende puncta wanneer DPP-GFP niet wordt uitgedrukt. Tijdens deze procedure is het belangrijk dat de vleugelschijf peripodial side up is gemonteerd.
Als de vleugelschijf verkeerd georiënteerd is, zal DPP-GFP onscherp verschijnen. Deze methode kan worden gebruikt om de release van andere ontwikkelingssignalerende liganden zoals wingless of egel te bestuderen. We kunnen alle verschillende omgevings- en genetische factoren verkennen die de afgifte van DPP kunnen beïnvloeden.
Daarnaast kunnen we deze methode aanpassen om BMP-afgifte van andere celtypen te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de afgifte-dynamiek van het Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) Dpp, waarbij wordt belicht hoe de timing van de blootstelling de ontwikkelingsuitkomsten beïnvloedt. De ontwikkelde techniek maakt visualisatie van de Dpp-afgifte mogelijk, wat inzicht geeft in de genetische en omgevingsfactoren die dit proces beïnvloeden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Celsturing
Achtergrond
- Dpp beïnvloedt het cellot door zich aan receptoren te binden en intracellulaire signalering te triggeren.
- Zonder vrijgave kan Dpp zijn receptoren niet bereiken en zijn functies niet uitvoeren.
- Dit onderzoek maakt gebruik van beeldvormingstechnieken om de vrijgave van Dpp te visualiseren.
- De BMP-signaleringsroute is evolutionair geconserveerd, wat suggereert dat deze relevant is voor de menselijke biologie.
Doel van de studie
- Om de afgifte van Dpp uit vleugelschijfcellen te visualiseren.
- Om te onderzoeken hoe genetische en omgevingsfactoren de dynamiek van de Dpp-afgifte beïnvloeden.
- Om de implicaties van Dpp-afgifte voor ontwikkeling en regeneratie te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Kruisen van DPP GAL4-vliegen met UAS DPP-GFP-vliegen.
- Stimuleren van de eiafzetting met gistpasta.
- Beeldvormingstechnieken om de Dpp-afgifte te visualiseren.
- Analyse van genetische en omgevingsinvloeden op de afgifte-dynamiek.
Belangrijkste resultaten
- De studie visualiseert met succes de afgifte van Dpp vanuit cellen.
- Identificeert sleutelfactoren die de dynamiek van de Dpp-afgifte beïnvloeden.
- Demonstreert de conservering van BMP-signaleringspaden.
- Biedt inzichten die relevant zijn voor menselijke ontwikkeling en regeneratie.
Conclusies
- Inzicht in de afgifte van Dpp is cruciaal voor het begrijpen van ontwikkelingsprocessen.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor de regeneratieve geneeskunde.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze technieken om andere BMP's te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het visualiseren van de dynamiek van ligandvrijgave vult een cruciaal gat in de targetvalidatie door directe observatie van de beschikbaarheid van signalering mogelijk te maken, wat essentieel is voor het beoordelen van de sterkte van therapeutische hypothesen. Deze methode ondersteunt het mechanistische de-risking in de vroege ontdekkingsfase door te verduidelijken of een ligand zijn receptor kan binden in een biologisch relevante context. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in strategieën voor pathway-modulatie, in het bijzonder voor geconserveerde signaleringsnetwerken zoals BMP/TGF-β.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de afgifte van liganden te onderzoeken als voorwaarde voor receptorbinding en signaaltransductie.
- Operationele waarde: Biedt een directe readout van de beschikbaarheid van liganden, waardoor ambiguïteit over het doelmechanisme van actie wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door te bevestigen dat genetische of omgevingsperturbaties de toegankelijkheid van liganden beïnvloeden, en niet enkel de expressie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare fluorescente puncta als proxy voor afgiftegebeurtenissen, wat comparatieve screening van genetische of chemische modulatoren mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde dissectie- en montageprotocollen om reproduceerbare beeldvormingscondities over verschillende experimenten te waarborgen.
- Wetenschappelijke waarde: Levert tijdopgeloste gegevens op die gecorreleerd kunnen worden aan activatietoestanden van signaalpaden voor de verfijning van de assay.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van de evolutionaire conservering van BMP-signalering om hypothesen te onderbouwen over mechanismen voor ligandvrijgave bij mensen tijdens ontwikkeling en regeneratie.
- Operationele waarde: Aanpasbaar voor andere ontwikkelingsliganden (bijv. Wingless, Hedgehog), waardoor de bruikbaarheid over verschillende signaalrouteklassen wordt uitgebreid.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de ligandvrijgave in ziekte-relevante systemen te bestuderen door cellulaire dynamiek te koppelen aan fenotypische uitkomsten.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door vroege validatie van de ligandfunctionaliteit te bieden voordat er wordt geïnvesteerd in downstream-screening of inspanningen voor lead-optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Toetst de hypothese dat een ligand niet alleen tot expressie komt, maar ook wordt afgegeven en beschikbaar is voor receptorbinding.
- Screening: Levert kwantitatieve time-lapse imaging-gegevens op die geschikt zijn voor high-content analyse van afgiftekinetiek onder verschillende omstandigheden.
- Analytiek: Genereert meetbare resultaten (frequentie, distributie en duur van fluorescerende puncta) die een statistische vergelijking tussen experimentele groepen ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de dynamiek van ligandafgifte met ontwikkelingsfenotypen, wat extrapolatie naar de menselijke biologie via pathway-conservatie ondersteunt.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform voor het bestuderen van afgifte-mechanismen van meerdere signaleringsliganden over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de toegankelijkheid van liganden te bevestigen, een cruciale stap die vaak wordt afgeleid in plaats van gemeten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde monsterpreparatie en oriëntatiecontroles (met de peripodiale zijde naar boven).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targets te filteren op basis van functionele ligandbeschikbaarheid, en niet enkel op expressieniveaus.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van targets waarvan de liganden een gereguleerde afgifte vertonen in relevante weefsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, dissectie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van confocale laserscanmicroscopie met een 40X olie-objectief en 488 nm laser voor optimale signaaldetectie.
- Vereist gestandaardiseerde mediabereiding (gemodificeerd HL3, pH 7.1, HEPES-gebufferd, gefilterd) om de levensvatbaarheid van het weefsel tijdens de beeldvorming te behouden.
- Vereist een consistente monsteroriëntatie (vleugelschijf met de peripodiale zijde naar boven) om artefacten in het brandvlak te voorkomen en reproduceerbare resultaten te garanderen.
- Beperkt tot ex vivo weefselbeeldvorming; niet toepasbaar op intacte organismen of high-throughput screening van levende dieren.
