Kwantificering van tumorcelhechting in cryosecties lymfeklieren

De meest voorkomende sites voor metastase zijn de oorspronkelijke lymfeklieren. Somatids kunnen worden gebruikt om de kleefaffiniteit tussen de lymfekliersecties van tumorcellen in vitro te detecteren. Een voordeel van deze techniek is dat verse lymfekliersecties een natuurlijke complexiteit van het oorspronkelijke weefsel bieden, wat niet mogelijk zou zijn om te recreëren met behulp van gezuiverde eiwitten.

Deze methode kan nuttig zijn voor moleculaire oncologiestudies die genen of therapieën proberen te identificeren die de hechting van tumorcellen verstoren bij uitgezaaide doelorganen, zoals lymfeklieren. Om de lymfeklieren binnen dertig minuten na het offer te oogsten, plaatst u de volwassen Wistar-rat in rugprecumencytie op een schone dissectieplaat bij kamertemperatuur en spuit de vacht met 70% isopropylalcohol. Met behulp van gesteriliseerde instrumenten, til de buikhuid en maak een mediale huid incisie om de buikwandcera bloot te stellen.

Haal de darm eruit totdat de thoracale en abdominale lymfeklieren zichtbaar worden. Met behulp van stompe-tip schaar, zorgvuldig accijns van de lymfeklieren zonder letsel van de onderliggende superieure mesenterische slagader, en plaats de lymfeklier in een 15 mL buis met 5 mL steriele PBS. Wanneer alle lymfeklieren zijn geoogst, plaats een lymfeklier per cryomold gezicht naar beneden op de basis van elke mal en voeg net genoeg optimale snijtemperatuur medium om de weefsels te dekken.

Gebruik na het invriezen een cryostat om 5 tot 8 micrometer dikke secties bij 22 graden Celsius te verwerven en de secties op glazen microscoopdia's te verzamelen. Goede kwaliteit cryosections van opeenvolgende plakjes van dezelfde lymfeklier zijn van cruciaal belang voor het minimaliseren van verschillen tussen plakjes, en het vergemakkelijken van consistente celhechting tarieven. Voor tumorceletikettering, oogst de cellen van belang van een aangewezen gefaseerde celkweek en schort de cellen opnieuw op met een 1 x 10 tot de 6 cellen per mL-concentratie en serumvrij medium.

Breng 1 mL cellen over in een nieuwe 15 mL conische buis en label de cellen met 2 microgram per mL DiI(C18)gedurende tien minuten bij 37 graden Celsius, met zachte agitatie op vijf minuten om celsedimentatie te voorkomen. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie en was de gelabelde cellen twee keer met 10 mL vers serum-vrij medium om overtollige kleurstof te verwijderen. Na de tweede wasbeurt worden de cellen opnieuw opgehangen met een 1 x 10 tot 6 cellen per mL serumvrij medium, aangevuld met een albumconcentratie van 0,1%runderserum.

Doorgaan van de gelabelde tumorcellen op de geoogste lymfeklieren weefselsecties, voorzichtig wassen de secties twee keer in PBS, gevolgd door re-hydratatie in verse PBS gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer aan het einde van de incubatie elke niet-specifieke binding met 2,5% boviene serumalbumine gedurende dertig minuten bij 37 graden Celsius, voordat u een wattenstaafje gebruikt om de glijbanen te drogen. Gebruik een hydrofobe pen om een barrière rond elke sectie te trekken en voeg 100 microliter van gelabelde cellen toe aan elke omcirkelde lymfeklier.

Na één tot twee uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer, verwijder alle niet-hechtingscellen met vier zachte wasbeurten in PBS en bevestig de resterende aanhangende fluorescentiecellen met 3,7% formaldehyde in PBS gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur. Voor de kwantificering van de kleefindex gebruikt u de 10x-doelstelling op een fluorescentiemicroscoop om individuele TIFF-beelden van elke sectie in de heldere en rode fluorescerende velden te verkrijgen. Geef de afbeeldingen vervolgens systematisch een naam en sla ze op voordat ze de afbeeldingen in Fiji openen.

Nadat u de schaal hebt ingesteld, gebruikt u het veelhoekige gereedschap om het gebied van belang te selecteren dat moet worden gekwantificeerd. Selecteer om het lymfekliergebied te kwantificeren. De gegevens worden uitgedrukt in vierkante millimeters.

Selecteer vervolgens Plug-ins, Analyseren, Celteller en klik op de foto die moet worden gekwantificeerd. Klik op Initialiseren en selecteer Tellertype. Klik vervolgens op de cellen in de foto.

De lymfeklieradhesie-index wordt uitgedrukt als het aantal aanhangende tumorcellen per lymfeklier bedekt gebied. Als u de volgende foto wilt initialiseren, opent u de volgende foto en herhaalt u de kwantificering zoals aangetoond. Zoals waargenomen, is de morfologie van de aanhangende cellen afgerond in vorm, en de cellen zijn heterogeen verspreid over de lymfeklier van belang.

De lymfeklieradhesie-index is twee tot drie keer hoger in NDRG4-negatieve borstkankercellijnen, vergeleken met die gemeten voor overeenkomstige NDRG4-positieve cellen. Deze procedure kan worden aangepast om hechtingspercentages in andere gemetastaseerde doelweefsels, zoals hersenen of longen, te helpen bij het evalueren van de secundaire preferentiële plaatsen van hechting voor geïnsemineerde tumorcellen. Vergeet niet dat zowel verse als bevroren weefsels als biogevaarlijk moeten worden beschouwd en moeten worden behandeld met behulp van passende bioveiligheidsmaatregelen.