Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Dit protocol maakt gebruik van thermische beeldvorming om nieuwe verbindingen te identificeren die de transpiratie van planten kunnen reguleren. Deze techniek is veelzijdig met betrekking tot de plantensoorten die kunnen worden getest, de aard van de verbinding, en het type beeldvorming. Om het opzetten van de planten voor de teelt, eerst een vier centimeter dikke laag fijn vermiculiet toe te voegen aan standaard 10 bij 20 inch plantenbakken zonder gaten en plaats zaadhouders twee centimeter uit elkaar in de trays.

Vul de zaadhouders met vermiculiet en plaats een zonnebloemzaad puntig uiteinde naar beneden in elke houder, zodat de helft van het zaad blijft blootgesteld. Wanneer alle zaden zijn verguld, bedek ze met een extra twee centimeter van fijne vermiculiet en mist met water van bovenaf. Bedek na een uur de trays met deksels en plaats de planten in een groeikamer in een kas.

Voor het opzetten van de hydrocultuur systeem, vul een op de juiste grootte container geschikt voor het kweken van planten hydroponically met gedestilleerd water en voeg algemene hydrocultuur meststof zoals aangegeven door de fabrikant. Gebruik vervolgens lucht- en waterpompen om de resulterende hydrocultuuroplossing te beluchten met constante beweging. Om de hydrocultuur drijvers voor te bereiden, snijd een vel van twee centimeter dik geëxpandeerd polystyreen schuim aan de afmetingen van de container en gebruik houtverbranding tool om een tot twee centimeter diameter gaten in het schuim te maken.

Plaats vervolgens de drijvers in het hydrocultuursysteem. Vijf dagen na het planten, trek voorzichtig de zaailingen uit de vermiculiet. Plaats de zaailingen onmiddellijk 30 minuten in een bak met water om overtollig vermiculiet te verwijderen en de resterende pericarps te verzachten.

Wanneer de opkomende primaire wortels zichtbaar zijn, verwijder de pericarps met de hand als dat nodig is. Breng de zaailingen in de zaadhouders over in de bereide polystyreenschuimdrijvers in het hydrocultuursysteem. Kweek de planten twee dagen in hydrocultuur.

Laat de chemicaliën uit de kleine samengestelde bibliotheek ontdooien bij kamertemperatuur. Label zes capless twee milliliter microtubes voor de negatieve controle behandeling, drie buizen voor de ABA behandeling, en de laatste 60 buizen voor analyse van de effecten van de 20 chemische stoffen van belang in drievoud. Voeg 10 microliter van elke chemische stof in elk van de reageerbuizen, 10 microliters van 10 millimolar ABA en dimethylsulfoxide in de drie ABA-buizen, en 10 microliters van dimethylsulfoxide in de zes controlebuizen.

Meng vervolgens voorzichtig 990 microliter van 10 millimolar MES-kaliumhydroxide in elke buis. Plaats de buizen in een buis rek met de positieve en negatieve controle en experimentele buizen gelijkmatig verdeeld in het rek om rekening te houden met de positie gerelateerde bias. Om de warmtebeeldcamera in te stellen, monteer je de camera eerst op een kopieerstandaard en sluit je alle kabels aan op een laptop.

Schakel de camera in voordat u de laptop inschakelt en open de warmtebeeldanalysesoftware. Als u de opnameparameters wilt aanpassen, rolt u de muis over de knop Opnemen om de selectie van het moersleutelpictogram onder Recordinstellingen mogelijk te maken en selecteert u de juiste recordmodus en -opties. Voor de behandeling van de zaailingen, voorzichtig til de zaadhouder en snel duik de wortel in de ondiepe schotel met water.

Snijd de primaire wortel van elke zaailing onder water 0,8 tot een centimeter onder het meest basale uiteinde van de zaadhouder om capitation te voorkomen en de vers gesneden plant in één buis met chemicaliën te plaatsen. Wanneer alle zaailingen zijn overgedragen, plaatst u de planten onder de warmtebeeldcamera en bevestigt u dat alle planten zich binnen het gezichtsveld van de camera bevinden. Als u de camera wilt richten op het oppervlak van de cotyledons, drukt u op Control Alt A en klikt u op Een film opnemen.

Er wordt een nieuw venster geopend waarin de opname wordt bevestigd. Na één tot twee uur, stop de opname. Open voor gegevensanalyse de juiste seq-bestanden en pauzeer de film.

Klik op het pictogram van de meetcursor van belang drie bij drie pixels en beweeg de muis over het midden van een cotyledon van de eerste plant. Klik links op de afbeelding om de cotyledon te labelen. Label de tweede cotyledon van de eerste plant op dezelfde manier.

Wanneer alle planten zijn gelabeld met twee cursors, klikt u op het pictogram Interessegebieden bewerken en klikt u met links en schuift u om alle interessegebieden te selecteren. Rol vervolgens de muis over het pictogram statistiekviewer en selecteer tijdelijke plot. Er gaat een nieuw venster open.

Voer de film uit, een grafiek vult zich met de gegevens. Klik vervolgens in het grafiekvenster op de dubbele pijl om een nieuw menu te openen en klik op het pictogram opslaan om de gegevens op te slaan. Het gebruik van de rode kleurstof erythrosine B toont het vermogen van chemische stoffen zichtbaar worden geabsorbeerd door middel van een snijwortel in de cotyledons van een zonnebloemzaailing binnen 10 minuten.

Wanneer planten worden behandeld met ABA, wordt een toename van de bladtemperatuur gedetecteerd in zonnebloemcotyledons binnen 30 minuten die wordt geassocieerd met de afname van de stomatale opening en de stomatale geleiding. Bovendien wordt een verhoogde bladtemperatuur 15 minuten na de behandeling waargenomen met 10 micromolar ABA en 20 minuten na behandeling met vijf micromolar ABA waaruit blijkt dat de meting van de bladtemperatuur door thermische beeldvorming een goede proxy is voor het meten van stomatataale diafragma en geleiding. In dit representatieve experiment, een standaard score-gebaseerde statistische behandeling mogelijk maken de identificatie van chemische stoffen die stomatale sluiting of opening te bevorderen.

Om de effecten van verbindingen op transpiratie te meten, is het belangrijk om planten te kweken onder optimale omstandigheden van licht, vochtigheid en temperatuur. Dit protocol kan worden toegepast op de meeste dicots. Het kan ook worden gebruikt om het effect van nieuwe verbindingen op fotosynthetische prestaties te evalueren, bijvoorbeeld door chlorofylfluorescentie te meten.