Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform

Ons protocol is belangrijk omdat het zorgt voor zowel de kosteneffectieve en tijdige dereplicatie van bekende antibiotica zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is template customization. Dit betekent dat een individu kan aanpassen welke resistentie genen die ze willen opnemen in hun bibliotheek sjabloon op basis van hun gewenste niveau van brede of smalle substraat specificiteit.

Bijvoorbeeld, een bèta-lactam is het uitdrukken van E.coli sjabloon kan worden voorbereid om de zeer specifieke dereplicatie van beta-lactams en hun verschillende subklassen mogelijk te maken. Met behulp van een septische techniek, pipet 500 microliters van kation aangepast MHB van een steriel reservoir in elke put van een steriele, 96 diepe put plaat. Gebruik met de voorbereide ARP- of MARP-stamplaten een applicatorstick om de 96 diepe putplaat in te enten volgens de ARP- of MARP-kaart.

Plaats een ademend afdichtingsmembraan op het oppervlak van de diepe putplaat en broed het 's nachts uit bij 37 graden Celsius, 250 RPM. Zorg ervoor dat er geen verontreinigde putten zijn. Met behulp van een multi-channel pipet, breng 100 microliters van elke put van de diepe put plaat naar een steriele 96-goed ronde bodemplaat.

Voeg 100 microliter steriele 50%glycerol in elke put en meng door zachtjes pipetten op en neer. Bereid minstens vijf bibliotheekborden voor. Bedek de platen met steriele aluminium afdichtingen en zorg ervoor dat elke put individueel wordt verzegeld.

Plaats het deksel op de aluminium afdichting en bewaar op min 80 graden Celsius. Met behulp van een houten applicator stick, voorzichtig schrapen sporen van het oppervlak van een streptomyces kolonie en breng het in een reageerbuis met een steriele glazen kraal en drie milliliter streptomyces antibioticum medium. Sluit de reageerbuis losjes met een dop om beademing mogelijk te maken.

Met behulp van dezelfde houten applicator stick, streep een steriliteit controle op een petrischaal met Bennett's agar. Broed de buis met zaadcultuur bij 30 graden Celsius met besluiering gedurende zes dagen bij 250 RPM en de steriliteitscontroleplaat bij 30 graden Celsius gedurende zes dagen. Bereid vervolgens op een vlakke ondergrond de dereplicatieplaten voor.

Aspirate 23 milliliter warme Bennett's agar in een serologische pipet en 20 milliliter gelijkmatig over het oppervlak van een rechthoekige petrischaal, waardoor de rest van het medium in de pipet om luchtbel vorming te voorkomen. Bedek de plaat met een deksel. Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle delen van de plaat bedekt en verstoor deze niet totdat de agar volledig is ingesteld.

Bereid vervolgens de membraanplaten van nitrocellulose met behulp van een rechthoekig petrischaaldeksel als traceringssjabloon, zodat de vellen op het oppervlak van de dereplicatieplaat passen. Snijd de vellen en autoclave ze in een steriel zakje. Controleer nu de steriliteitscontroleplaat om ervoor te zorgen dat er na zes dagen incubatie geen verontreinigingen aanwezig zijn.

Als het besmettingsvrij is, verwijder dan het deksel van de rechthoekige petrischaal en pipet 200 microliter van de zaadkweek op het oppervlak van de agar van de Bennett in de rechthoekige schotel. Gebruik een steriel wattenstaafje om de cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de hele plaat te verspreiden. Om het geprepareerde nitrocellulosemembraan boven op de cultuur op het oppervlak van de petrischaal te plaatsen, lijnt u de onderrand van het membraan uit op de onderrand van de petrischaal en brengt u het membraan langzaam van de onderrand op de bovenrand van de plaat aan.

Gebruik een steriel wattenstaafje om eventuele luchtbellen glad te strijken die zich kunnen hebben gevormd tussen het membraan agar interface, ervoor te zorgen dat het membraan is spoelen naar de agar. Het membraan zorgt ervoor dat organismen op het oppervlak sporuleren, terwijl secundaire metabolieten kunnen worden uitgescheiden in het medium hieronder. Leg het deksel terug op de rechthoekige petrischaal en leg het ondersteboven in een verzegelde plastic zak.

Zes dagen lang incubeer bij 30 graden Celsius. Na zes dagen moet u de dereplicatieplaat uit de couveuse verwijderen. Verwijder met behulp van steriele pincetten voorzichtig het nitrocellulosemembraan van het oppervlak van de agar van de Bennett.

Zorg ervoor dat er slechts kleine sporengroei rond de randen van de plaat om de kans op besmetting van de te voegen overlay te verminderen. Zorg ervoor dat het werkoppervlak vlak is en gebruik een serologische pipet om 23 milliliter warme kationen aangepaste MHB agar aan te halen. Maak een overlay door het verstrekken van 20 milliliter gelijkmatig over het oppervlak van de dereplicatie plaat, waardoor de rest van de agar in de pipet om luchtbel vorming te voorkomen.

Leg het deksel op de plaat. Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle gebieden bedekt en verstoor deze niet totdat de agar volledig is ingesteld. Eenmaal afgekoeld en gestold, breng je de dereplicatieplaat terug naar de verzegelde plastic zak en bewaar je hem 's nachts ondersteboven bij vier graden Celsius, waardoor de verspreiding van secundaire metabolieten in de MHB-agar-overlay kan worden geplaatst.

Op dezelfde dag, inenten een verse ARP of MARP sjabloon door eerst pipetting 100 microliter van kation aangepaste MHB in elke put van een 96-put plaat. Haal de bevroren voorraad ARP of MARP bibliotheekplaat uit de min 80 graden Celsius vriezer. Verwijder de aluminium afdichting voordat condensatie begint te vormen aan de onderkant.

Met behulp van steriele 96-well pinning tools, voorzichtig pin uit de bevroren voorraad ARP of MARP bibliotheek plaat en inenten de verse MHB met 96-well platen. Om verontreiniging tijdens dereplicatie te minimaliseren, moet u zoveel mogelijk ARP- of MARP-bibliotheekplaten voorbereiden om slechts twee tot drie dereplicatieplaten per bibliotheekplaat te verwijderen. Eenmaal voltooid, zet een nieuwe steriele aluminium afdichting op de bevroren sjabloon en terug te keren naar de min 80 graden Celsius vriezer.

Plaats de ingeënte 96-put platen binnenkant van een los afgesloten plastic zak en uitbroeden op 37 graden Celsius met schudden op 250 RPM voor 18 uur. Verwijder de ARP- of MARP-sjabloon uit de incubator en zorg ervoor dat er geen verontreinigingen aanwezig zijn door de plaat te vergelijken met de ARP- of MARP-sjabloonkaart. Verwijder de dereplicatieplaten van vier graden Celsius en laat het gelijk op kamertemperatuur.

Als er condensatie is, open de deksels en laat drogen in een steriele omgeving. Met behulp van steriele pinning tools, pin van de ARP of MARP bibliotheek plaat op het oppervlak van de MHB agar overlay van de dereplicatie platen. Pas op dat u de agar niet doorboort.

Laat het sjabloonentmateriaal drie tot vijf minuten drogen. Plaats de ingeënte dereplicatieplaten ondersteboven in een verzegelde plastic zak en incubbate 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag analyseer je dereplicatieresultaten door de groei op de dereplicatieplaat te vergelijken met putten die overeenkomen met de ARP- of MARP-kaart.

In deze ARP- of MARP-dereplicatieworkflow is een positief dereplicatieresultaat bereikt. Waarin het voor de stam bereide extract WAC 8921 werd geïdentificeerd als een chlooramfenicolproducent. Het gebrek aan ARP-groei duidt op de aanwezigheid van een onbekend antibioticum of een minder vaak gevonden antibioticum dat niet werd verantwoord in de ARP- of MARP-bibliotheekplaat.

Een groeipatroon dat uniek is voor de MARP werd gevormd vanwege het gebruik van zowel wilde type E.coli BW25113 als een hyper-permeabel en e-flux deficiënte mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dit resultaat suggereert de aanwezigheid van een verbinding met antimicrobiële activiteit die niet in staat was om een intact buitenste membraan te overtreffen. Deze E.coli groeipatronen suggereert de onjuiste sterilisatie van pinning tools, wat resulteert in de overdracht van onbekende E.coli stammen over de overlay.

En een voorbeeld van ARP of MARP bevroren voorraad bibliotheek plaat besmetting wordt hier getoond met drie verschillende E.coli kolonies geteeld op de rechthoekige petrischaal oppervlak. Dit resultaat geeft aan dat de agar overlay werd doorboord tijdens dereplicatie. De MHB-overlay gerelateerde verontreiniging kan ook optreden tijdens het dereplicatieproces, met een onregelmatig groeipatroon op het oppervlak van de overlay.

Het belangrijkste om te onthouden bij het volgen van dit protocol is het gebruik van de juiste sterilisatie en aseptische technieken om ervoor te zorgen dat je niet wordt tegengehouden in een stap als gevolg van besmetting. Dit omvat het zo bereiden van het nitrocellulosemembraan zodat het zo dicht mogelijk op het oppervlak van de agarplaat van de Bennett past om de verspreiding van sporen bij het gieten van de MHB-overlay te minimaliseren. Daarnaast is het ook uiterst belangrijk om goed gesteriliseerde pinning apparatuur te gebruiken bij het inenten van de bibliotheekplaten en derepliceren om het schoonste resultaat te produceren.

Naast het derepliceren van bekende antibiotica, kan deze methode worden toegepast op het identificeren van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt in combinatie met bestaande antibiotica om hun activiteit te redden. Hoewel antibiotica dereplicatie is niet een nieuwe techniek, het is berucht voor zijn resource intensief en tijdrovend. Het ARP- en MARP-platform helpen om een licht te werpen op hoe antibioticadereplicatie geen grote productie hoeft te zijn, maar kan gedurende een periode van twee weken worden voltooid met minimale apparatuur.