Name: Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Leer biopartikel-microarrays maken voor chemotactische analyse van humane neutrofiele zwermen in vitro. Deze methode biedt kwantitatieve beeldvorming van migratie en toegang tot secreted cytokines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door financiering van de William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering en het Comprehensive Cancer Center aan de Ohio State University. De gegevens die in dit rapport werden gepresenteerd, kwamen van beelden die zijn verwerkt met Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) die beschikbaar zijn op de Campus Microscopy and Imaging Facility, the Ohio State University. Deze faciliteit wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidie P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

De auteurs erkennen de gezonde vrijwilligers die vriendelijk hun bloed schonken. Bloedspecimens werden verkregen na geïnformeerde vrijwillige toestemming volgens institutionele review board (IRB) protocol #2018H0268 beoordeeld door de Biomedical Sciences Committee aan de Ohio State University.
1. Microfabricage van microarray van biodeeltjes
<ol><li>Met behulp van standaard fotolithografie procedures, het genereren van de master silicium wafer.<ol>
<li>Genereer een bewijs van het gewenste ontwerp met behulp van een computer-aided design (CAD) software, dan sturen naar een fotomasker fabrikant om een chromen fotomasker te produceren. Het ontwerp dat hier wordt gebruikt is 4 mm x 4 mm rechthoekige arrays met een diameter van 30 μm gevuld in cirkels met een afstand van 150 μm van centrum tot midden. Dit ontwerp kan naar wens worden aangepast voor verschillende toepassingen.</li>
		<li>Spincoat een 40 μm dikke laag van een negatieve fotoresist op een silicium wafer. Bak wafer op 65 °C gedurende 5 min en 95 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Stel wafer bloot aan UV-licht door middel van een chromen fotomasker met 150-160 mJ/cm2 (Figuur 1A).</li>
		<li>Bak wafer op 65 °C gedurende 5 min en 95 °C gedurende 10 min. Dompel wafer onder in fotoresist ontwikkelaar gedurende 10 min en spoel af met isopropylalcohol. In dit stadium moet het patroon zichtbaar zijn op de wafer (figuur 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Meng een 10:1-verhouding van polydimethylsiloxaanprepolymeer en het uithardingsmiddel (d.w.z. 20 g prepolymeer en 2 g uithardingsmiddel) grondig en giet het niet-genezende polydimethylsiloxanemengsel (PDMS) over de hoofdwafer in een petrischaaltje(figuur 1C).</li>
	<li>Vacuüm behandelen de onuitgeharde PDMS mengsel totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn over de master wafer. Kuur 's nachts bij 65 °C.</li>
	<li>Gebruik een scalpel om te snijden rond de buitenkant van de patroon sectie van de wafer, en langzaam verwijderen van de genezen PDMS plaat. Plaats de PDMS-plaat op een schone snijplank met de naar boven gerichte patroonzijde(figuur 1D).</li>
	<li>Punch uit individuele stempels van de PDMS plaat met een 8 mm biopsie punch(Figuur 1E). Voor één glazen glijbaan zijn acht stempels nodig.</li>
	<li>Plaats elke stempel naar beneden op de plakband om vuil te verwijderen.</li>
	<li>Bereid vooraf een 1,6 mg/mL oplossing van CP in water.<ol>
<li>Voeg de juiste hoeveelheid van het CP-poeder toe aan water (bijvoorbeeld 0,8 g tot 500 mL).</li>
		<li>Meng op een roerplaat op kamertemperatuur 's nachts, of totdat alle vaste stof is opgelost in het water. De CP-oplossing kan 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.</li>
		<li>Maak deCP-oplossing indien gewenst fluorescerend door poly-L-lysine toe te voegen met fluoresceine isothiocyanaat (PLL-FITC).<ol>
<li>Aliquot ongeveer 10 mL van de CP-oplossing. Voeg een kleine hoeveelheid PLL-FITC (0,05 mg) toe aan het aliquoted volume. De hoeveelheid kan worden gewijzigd om de helderheid van fluorescentie naar wens aan te passen.</li>
			<li>Vortex de CP-oplossing gelabeld met FITC voor 20 s, of totdat de oplossing is een uniforme, lichtgele kleur. Bescherm tegen licht en bewaar tot 1 maand bij 4 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Met de stempels face-up, priem elke stempel met 100 μL van 1,6 mg/mL oplossing van CP, ervoor te zorgen geen luchtbellen vormen tussen de CP-oplossing en de stempel (Figuur 1F).</li>
	<li>Keer de stempels om op een laag CP-oplossing(figuur 1G).</li>
	<li>Verwijder de stempels na 1 uur uit de CP-oplossing.</li>
	<li>Dep elke natte stempel naar beneden op een schone glazen schuif 6-8x om overtollige vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Vacuüm behandel de postzegels gedurende 1-2 min.</li>
	<li>Hecht een acht put, 9 mm diameter imaging spacer op de top van een schone glazen glijbaan als een gids voor stempel plaatsing. Met deze spacer kan elke glazen schuif acht microarrays hebben.</li>
	<li>Plaats een stempel naar beneden op de glazen glijbaan in het midden van elke put van de imaging spacer (dat wil zeggen, gebruik acht stempels in totaal).</li>
	<li>Leg een evenwichtig gewicht van 5,6 ± 0,1 g op elke stempel en laat 10 min toe voor het stempelen (figuur 1H). Een evenwichtig gewicht is nodig om ervoor te zorgen dat de stempel gelijkmatig op de glazen schuif wordt gedrukt en zelfs de overdracht van de CP naar de glazen schuif bevordert.</li>
	<li>Verwijder de gewichten en stempels van de glazen plaat(figuur 1I). Laat de CP-laag 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat u de biodeeltjes toevoegt, zoals beschreven in stap 1.17. Als de CP is gelabeld met FITC, kan de effectiviteit van het stempelen op dit punt worden gecontroleerd met een fluorescerende microscoop op 488 nm voordat u verdergaat naar stap 1.17 (figuur 1M).</li>
	<li>Snijd een lege PDMS-plaat op de grootte van de beeldafstandsruimter en gebruik de 8 mm biopsiepunch om putten te maken in de PDMS die aansluiten bij de putten van een beeldafstandsruimte. Plak de PDMS-plaat aan de glazen schuif met de beeldafstandsruimte (figuur 1J).</li>
	<li>Ontdooi een oplossing van biodeeltjes (bijvoorbeeld E. coli of zymosan) en verdun tot 500 μg/mL in water voor injectie (WFI). OPMERKING: De biodeeltjes hoeven niet te worden geopsoniseerd. Neutrofiele oppervlaktereceptoren herkennen moleculen op deze biodeeltjes19,20,21.</li>
	<li>Voeg 100 μL biodeeltjesoplossing toe aan elke PDMS goed op de glasplaat(figuur 1K).</li>
	<li>Rock de glazen glijbaan voor 30 min.</li>
	<li>Spoel de putten grondig af met water. De microarray van het biodeeltjes kan maximaal 3 maanden in een stofvrije omgeving bij 4 °C worden opgeslagen. Op dit punt moet het patroon worden gecontroleerd met een fluorescerende microscoop op 594 nm voordat het overgaat tot stap 2.1 (figuur 1N).</li>
</ol>2. Monstervoorbereiding
<ol><li>Verzamel ten minste 2 mL vers bloed in K2-EDTA buizen van de gewenste donor. De verwachte opbrengst van neutrofielen is 1-2 x 106 cellen/1 mL volbloed. De beeldtest vereist ongeveer 1,5 x 105 neutrofielen, en de analyse van de supernatant vereist 1 x 106 neutrofielen. Gebruik het bloed binnen 4 uur.</li>
	<li>Scheid rode bloedcellen (RBC's) door het toevoegen van een erythrocyte aggregatie middel in een 1:5 verhouding aan het hele bloed. Wacht 45 min op een doorschijnende laag (buffy coat) om te scheiden van de laag RBC's.</li>
	<li>Verwijder de buffy jas en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van 1 mL buffy jas: 9 mL PBS.</li>
	<li>Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.</li>
	<li>Aanzuigen van de supernatant en resuspend de pellet op 5 x 107 cellen / mL.</li>
	<li>Gebruik een negatieve immunomagnetische selectiekit om neutrofielen te isoleren.<ol>
<li>Voeg 50 μL antilichaamcocktail/1 mL celvering toe. Wacht 10 min.</li>
		<li>Voeg 100 μL magnetische kralen/1 mL celvering toe. Wacht 10 min.</li>
		<li>Voeg celvering toe aan een ronde bodembuis en plaats in een cilindrische magneet. Wacht 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet supernatant in een centrifugebuis. Voeg tot 10 mL PBS toe. Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.</li>
	<li>Aspirate supernatant. Resuspend witte pellet in IMDM met 0,4% menselijk serum albumine.</li>
	<li>Vlekkernen met 20 μg/mL Hoechst 33342 gedurende 10 min bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 5 mL IMDM toe met 0,4% menselijk serumalbumine om te spoelen. Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.</li>
	<li>Cellen opnieuw opteschorten op 7,5 x 105 cellen/mL in IMDM met 0,4% menselijk serumalbumine.</li>
	<li>Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan een PDMS-put die een biodeeltjesmicroarray bevat. Zorg ervoor dat de celvering goed over de bovenkant van de PDMS zit en geen bellen bevat.</li>
	<li>Sluit af met een afdekslip met een diameter van 12 mm. Bedek de opening van de PDMS goed met een coverslip met een diameter van 12 mm. Druk voorzichtig op de coverslip met een pincet, zodat de overtollige celvering ontsnapt naar de rand van de put. Gebruik een weefsel om de overtollige celsuspensie te verwijderen.</li>
</ol>3. Het uitvoeren van de test- en beeldanalyse
<ol><li>Laad microdeeltjes array met cellen op de levende cel imaging station met een microscoop uitgerust met een kooi incubator ingesteld op 37 °C, 5% CO2,en 90% relatieve vochtigheid.</li>
	<li>Gebruik time-lapse fluorescerende en brightfield microscopie om beelden op te nemen bij 10x vergroting om de 10 s op 405 nm, 594 nm en brightfield. In een typisch experiment worden beelden verzameld tot 2 uur.</li>
	<li>Gebruik een geautomatiseerde celtrackingsoftware om de migratie van individuele neutrofielen naar de biodeeltjescluster bij te houden.<ol>
<li>Gebruik de automatische regressiemodus van een software voor het bijhouden van spotdetectiecellen. Stel de straal van de spot in op 5 μm (de geschatte grootte van een neutrofiele kern). Stel de minimale spoorlengte in op 120 s en een maximale tussenruimtegrootte van één frame.</li>
		<li>Uit de gegevens gegenereerd door de cel tracking software, extraheren van de bestanden die de neutrofiele positie en snelheid bevatten. Deze bestanden kunnen worden gebruikt met een grafieksoftware om respectievelijk neutrofiele migratiesporen(figuur 2C)en een warmtekaart van snelheid versus tijd(figuur 2D)te genereren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de 405 nm fluorescerende beelden om zwermgrootte na verloop van tijd bij te houden op een beeldanalysesoftware van uw keuze.<ol>
<li>Definieer gebieden van belang (ROI's) rond elke biodeeltjescluster waar neutrofielen zullen zwermen. Houd de ROI van dezelfde grootte om elke biodeeltjescluster te analyseren.</li>
		<li>Analyseer de gemiddelde fluorescerende intensiteit van de 405 nm beelden binnen elke ROI in de tijd.</li>
		<li>Genereer een kalibratiecurve van gemiddelde fluorescerende intensiteit tot zwermgrootte door handmatige metingen te doen bij verschillende zwermmaten van 0 μm2 tot de maximale zwermgrootte. Gebruik deze kalibratie om de zwermgrootte in de loop van de tijd te berekenen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Supernatant inzameling en eiwitdetectie
<ol><li>Incubeer de neutrofielen in de putten die de biodeeltjesmicroarray bevatten bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 uur. Neem monsters op de gewenste tijdspunten. Meestal worden monsters genomen op 0, 0,5, 1 en 3 uur. Om de detectiegrens van de test van de eiwitarray te overwinnen, werd het volledige volume van supernatant van één enkele put (200 μL) gebruikt voor elk tijdspunt. Elk tijdpunt werd geanalyseerd in drievoud.</li>
	<li>Controleer met behulp van een brightfield microscoop of zwermen worden gevormd op de microarray.</li>
	<li>Aanzuigen van de supernatant met een 200 μL pipet en belasting in een 0,45 μm centrifuge filterbuis.</li>
	<li>Centrifugeer de supernatant bij 190 x g en 20 °C gedurende 5 min en verzamel het gefiltreerd volume.</li>
	<li>Bewaar monsters bij -80 °C tot de verwerkingstijd.</li>
	<li>Gebruik een microarray kit die een reeks menselijke eiwitten detecteert om monsters te verwerken.<ol>
<li>Voeg 200 μL van elk monster toe aan een aparte dialysebuis die bij de kit is voorzien.</li>
		<li>Plaats de dialysebuizen in een beker met ten minste 500 mL PBS (pH = 8,0). Roer voorzichtig op een roerplaat gedurende ten minste 3 uur bij 4 °C. Verander de PBS in de beker en herhaal deze stap.</li>
		<li>Breng elk monster over op een schone centrifugebuis en centrifuge met 9.000 x g gedurende 5 min om eventuele neerslag te verwijderen. Breng elke supernatant over op een schone buis.</li>
		<li>Biotinylaat elk monster door toevoeging van 36 μL 1x etikettering reagens uit de kit per 1 mg van het totale eiwit in het gedialyseerde monster aan 180 μL van dialyzed monster. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min. Meng voorzichtig om de 5 min.</li>
		<li>Voeg 3 μL stopoplossing toe die met de kit in elke monsterbuis wordt geleverd. Breng elk monster over naar een verse dialysebuis en herhaal de stappen 4.6.2–4.6.3. In dit stadium kan het monster worden opgeslagen bij -20 °C of -80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan.</li>
		<li>De glazen schuif die bij de kit is voorzien, wordt opgeslagen bij -20 °C. Laat het op kamertemperatuur komen. Plaats de geassembleerde glazen schuif in een laminaire stroomkap voor 1-2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 400 μL van de blokkeerbuffer bij de kit toe aan elke put van de geassembleerde glazen schuif. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.</li>
		<li>Centrifugeer de bereide monsters gedurende 5 min bij 9.000 x g om neerslag of deeltjes te verwijderen. Verdun 5x met het blokkeren van buffer.</li>
		<li>Verwijder de blokkeringsbuffer uit elke put. Voeg 400 μL van de verdunde monsters toe aan de juiste putten. Incubeer voor 2 uur op kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
		<li>Decanteer de monsters van elke put. Was 3x met 800 μL van de 1x wasbuffer die ik bij kamertemperatuur heb voorzien gedurende 5 min tijdens het schommelen.</li>
		<li>Dompel in een schone container de geassembleerde glazen schuif onder in 1x wasbuffer I. Was 2x op kamertemperatuur gedurende 5 min tijdens het schommelen.</li>
		<li>Voeg 400 μL 1x Cy3-geconjugeerde streptavidin toe aan elke subarray. Dek af met plastic plakstrips. Bescherm tegen licht voor de rest van het protocol.</li>
		<li>Incubeer voor 2 uur op kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
		<li>Decanteer de oplossing en demonteer de glasplaat uit de monsterkamers.</li>
		<li>In de centrifugebuis van 30 mL die bij de kit is voorzien, moet u voorzichtig de glazen schuif en voldoende 1x wasbuffer I toevoegen om de glazen schuif te bedekken. Was 3x voor 10 min elk op kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
		<li>In de centrifugebuis van 30 mL was je 2x met 1x wasbuffer II gedurende 5 min bij kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
		<li>Was de glazen schuif met 30 mL ddH2O gedurende 5 min. Verwijder de glazen schuif uit de centrifugebuis en laat 20 min drogen in een laminaire stroomkap. De voorbereide glazen schuif mag bij -20 °C worden bewaard tot ze klaar zijn om te scannen.</li>
		<li>Scan de glazen schuif met een microarray scanner bij een fluorescentieemissie van 555 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li>
<li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li>
<li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Gout%3A+Observations+over+a+Half-Century%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li>
<li>Reátegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li>
<li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li>
<li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li>
<li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Bench%3A+Neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair%3A+going+forward+in+reverse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Arraying+neutrophils+in+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li>
<li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li>
<li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Cancer%3A+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+Key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li>
<li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+of+Fungal+Infections%22%5BJournal%5D)">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li>
<li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li>
<li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li>
<li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+inflammation%3A+intercellular+signal+relay+and+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li>
<li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li>
<li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li>
<li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li>
<li>Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%3A+An+open-ended+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li>
<li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

We ontwikkelden een microstempelplatform om uniforme arrays van biodeeltjes te genereren om in vitro neutrofiele zwermen te stimuleren. De in vitro aard van ons platform stelt ons in staat om de complicaties die zich voordoen met in vivo zwermen experimenten te omzeilen, namelijk de slechte mogelijkheid om bemiddelaars vrijgegeven door zwermenneutrofielen te analyseren5. Bovendien worden in vivo modellen meestal uitgevoerd bij knaagdieren11,12</...

Neutrofielen, de meest voorkomende witte bloedcellen in de bloedbaan1, krijgen aandacht als potentiële diagnostische en therapeutische doelen2,3 omdat ze betrokken kunnen zijn bij een verscheidenheid van medische aandoeningen, waaronder jicht4, sepsis3, trauma5,6, kanker1,7,8, en diverse auto-immuunziekten5,9. Neutrofiele zwermen is een meertraps, strak gereguleerd proces met een complexiteit die het een bijzonder interessante focus van studie5,10,11maakt. Tijdens zwermen isoleren neutrofielen een ontstekingsplaats van het omringende gezonde weefsel5,10,11. Een goede regulering van neutrofiele zwermen is essentieel om wondgenezing en uiteindelijk ontstekingsresolutie5,12te bevorderen. Neutrofiele zwermen is voornamelijk onderzocht in vivo in knaagdier12,13,14,15 en zebravissen10,11,12,15 modellen. De aard van deze in vivo diermodellen leidt echter tot beperkingen5. Bijvoorbeeld, de bemiddelaars vrijgegeven door neutrofielen tijdens zwermen zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor analyse5. Daarnaast zijn er veel potentiële bronnen voor een bepaalde bemiddelaar in vivo, dus een in vivo experiment moet een genetisch tekort introduceren om cellulaire productie en/of interactie te remmen om de rol van die bemiddelaar in een bepaald proces te onderzoeken13. Een in vitro experiment omzeilt deze complicatie door neutrofiele observatie mogelijk te maken zonder de context van extra cellen. Bovendien is het onderzoek naar menselijke neutrofiele gecoördineerde migratie beperkt16. Op een in vitro zwermen platform, kunnen menselijke neutrofielen direct worden geanalyseerd. Een in vitro zwermen platform zou kunnen uitbreiden op de kennis opgedaan uit in vivo studies door het verstrekken van mogelijkheden om de lacunes achtergelaten door de beperkingen van in vivo studies op te vullen.
Om tegemoet te komen aan de behoefte aan een in vitro platform dat in vivo neutrofiele zwermen nabootst, ontwikkelden we een microstempelplatform dat ons in staat stelt om biodeeltjesmicroarrays te patronen die neutrofiele zwermen op een ruimtelijk gecontroleerde manier stimuleren. We genereren biodeeltjesmicroarrays op glasplaten in een proces in twee stappen. Ten eerste gebruiken we microstempeling om een microarray van kationische polyelektrolyt (CP) vlekken te genereren. Ten tweede voegen we een oplossing toe van biodeeltjes die zich via elektrostatische interactie aan de CP-vlekken hechten. Door eerst de CP-laag te patroon, kunnen we selectief negatief geladen biodeeltjes patroon om het gewenste neutrofiele zwermpatroon te genereren. De positief geladen laag houdt de negatief geladen biodeeltjes vast door de krachtige wasstap die de biodeeltjes verwijdert uit de gebieden op de glasplaat die de CP niet hebben. Bovendien is de HIER gebruikte CP, een copolymeer van acrylamide en quaternized cationic monomeer, biocompatibel, dus het induceert geen reactie van de neutrofielen. Het heeft een zeer hoge oppervlaktelading die de micron-sized biodeeltjes aan de glasdia immobiliseert, waarbij neutrophils worden geremd van het verwijderen van de deeltjes uit de patroonpositie op de glasdia. Dit resulteert in biodeeltjesclusters die in een microarray worden gerangschikt. Toen we neutrofielen aan de microarray toevoegden, vormden ze stabiele zwermen rond de biodeeltjesclusters. Door het volgen van neutrofiele migratie, vonden we dat zwermen neutrofielen actief migreren naar de biodeeltjes clusters. Bovendien gebruikten we dit platform om bepaalde bemiddelaars te analyseren die neutrofielen loslaten tijdens zwermen. We vonden 16 bemiddelaars die differentieel worden uitgedrukt tijdens zwermen. Hun concentraties volgen drie algemene trends in de tijd: verhogen, dalen of pieken. Ons in vitro neutrofiele zwermplatform faciliteert de analyse van ruimtelijk gecontroleerde menselijke neutrofiele zwermen, evenals de verzameling en analyse van bemiddelaars die vrijkomen door neutrofiele zwermen. In een eerdere publicatie toonden we aan dat patiënten met bepaalde medische aandoeningen (trauma, auto-immuunziekte en sepsis) neutrofielen hadden die anders functioneerden dan die van gezonde donoren5. In toekomstige onderzoeken kan ons platform worden gebruikt om de neutrofiele functie bij verschillende patiëntenpopulaties te analyseren. Dit platform kan kwantitatief analyseren van de complexe coördinatie die betrokken zijn bij neutrofiele zwermen. Aanvullende studies kunnen worden gedaan om inzicht te geven in de neutrofiele functie van een specifieke patiëntenpopulatie of neutrofiele reactie op een ziekteverwekker van belang.

<table><tbody><tr><td>"The Big Easy" EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>Magneet te gebruiken met neutrofielen isolatiekit</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>Okolab kooi incubator voor temperatuur en CO2 controle</td></tr><tr><td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17957</td><td>Kit voor immunomagnetische negatieve selectie van menselijke neutrofielen</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>Omgekeerde onderzoek microscoop</td></tr><tr><td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Bioparticle poeder, oplossen in water voorafgaand aan toevoeging aan Zetag&reg; array</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>Om PDMS stempels te snijden</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7906</td><td>Erythrocyten aggregatie middel voor het scheiden van buffy coat van rode bloedcellen in vers menselijk bloed</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Fluorescente kleuring van nucleair</td></tr><tr><td>Human L1000 Array</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4</td><td>Hoge dichtheid array om 1000 menselijke eiwitten te detecteren</td></tr><tr><td>Human Serum Albumin (HSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5843</td><td>Laag endotoxin HSA, om 2 % oplossingen in IMDM voor geïsoleerde neutrofielen te bereiden</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>Om geïsoleerde neutrofielen te resuspenderen</td></tr><tr><td>K2-EDTA tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-657-32</td><td>Buizen voor bloedafname</td></tr><tr><td>Low Reflective Chrome Photomask</td><td>Front Range Photomask</td><td>N/A</td><td>Afmetingen 5" x 5" x 0,09" (L x B x D)</td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td>ASCNGX00</td><td>Fluorescentie lezer van eiwit gepattered microdomeinen</td></tr><tr><td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>Software voor automatische cel tracking analyse</td></tr><tr><td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td>Software voor automatische live cel beeldvorming en zwerm grootte berekening</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30.000 - 70.000 MW PLL gelabeld met FITC, gebruikt om CP oplossing fluorescent te labelen</td></tr><tr><td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8-well, 9-mm diameter, zelfklevende beeldvorming spacer</td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>590</td><td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &mu;m SSP test</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td>Gebruikt om een 40-&micro;m laag fotoresist op siliciumwafer te draaien</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>Negatieve fotoresist om silicon master wafer te maken</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Fotoresist developer. Verwijder niet-overkruisde SU-8 2025 van siliciumwafer</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td><td>Dow</td><td>1673921</td><td>2-delige siliconen elastomeer kit voor het maken van microstamps en PDMS wells</td></tr><tr><td>UV Exposure Masking System</td><td>Klo&eacute;</td><td>UV-KUB 2</td><td>Gebruikt om fotoresist op siliciumwafer door chrome masker met UV licht te overkruisslinken</td></tr><tr><td>Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1287303</td><td>Hoge kwaliteit water om bioparticles te verdunnen</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>Kationische polyelektrolyt (CP), poeder, Copolymeer van acrylamide en gekwantiseerde kationische monomeer, vormt "inking solution" voor microstamping wanneer opgelost in water</td></tr><tr><td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Bioparticle poeder, oplossen in water voorafgaand aan toevoeging aan Zetag array</td></tr></tbody></table>

bioparticle microarrays voor chemotactic en moleculaire analyse van menselijke neutrofiele zwermen in vitro

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrofiele zwermen is een coöperatief proces waarbij neutrofielen verzegelen van een site van infectie en het bevorderen van weefsel reorganisatie. Zwermen is klassiek in vivo bestudeerd in diermodellen die karakteristieke patronen van celmigratie vertonen. Echter, in vivo modellen hebben verschillende beperkingen, waaronder intercellulaire bemiddelaars die moeilijk toegankelijk en te analyseren, evenals het onvermogen om direct te analyseren menselijke neutrofielen. Vanwege deze beperkingen is er behoefte aan een in vitro platform dat zwermen met menselijke neutrofielen bestudeert en gemakkelijke toegang biedt tot de moleculaire signalen die tijdens zwermen worden gegenereerd. Hier wordt een multistep microstempelingsproces gebruikt om een biodeeltjesmicroarray te genereren die zwermen stimuleert door een in vivo infectie na te bootsen. De biodeeltjesmicroarray veroorzaakt neutrofielen om op een gecontroleerde en stabiele manier te zwermen. Op de microarray nemen neutrofielen toe in snelheid en vormen stabiele zwermen rond biodeeltjesclusters. Bovendien werd supernatant gegenereerd door de neutrofielen geanalyseerd en 16 eiwitten werden ontdekt te zijn differentieel uitgedrukt in de loop van zwermen. Dit in vitro zwermplatform faciliteert directe analyse van neutrofiele migratie en eiwitafgifte op een reproduceerbare, ruimtelijk gecontroleerde manier.

Wanneer neutrofielen worden toegevoegd aan de biodeeltjesmicroarray, worden neutrofielen die contact opnemen met de biodeeltjesclusters geactiveerd en initiëren ze de zwermende respons. De biodeeltjesmicroarray werd gevalideerd met behulp van time-lapse fluorescerende microscopie om neutrofiele migratie naar de biodeeltjesclusters te volgen(Video S1). De migratie van individuele neutrofiele kernen wordt bijgehouden wanneer ze migreren naar de biodeeltjescluster. Wanneer neutrofielen de biodeeltjescluster...

Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een in vitro analyse van neutrofiele zwermen mogelijk maakt, die vele beperkingen van ons huidige onvermogen om te experimenteren overwint. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijke toegang biedt tot de uitgescheiden cytokines en lipide bemiddelaars die neutrofielen vrijlaten tijdens het zwermen en kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk maakt. Terwijl we deze techniek toepasten op neutrofielen, kon het worden uitgebreid om de migratie van andere witte bloedcellen zoals monocyten en T-cellen te analyseren.Begin met de voorbereiding van een 1,6 milligram per milliliter cationic polyelectroliet, of CP oplossing, door het toevoegen van de juiste hoeveelheid CP poeder aan water en mengen op de roerplaat 's nachts of totdat alle vaste stoffen zijn opgelost. Indien gewenst kan de oplossing fluorescerend worden gemaakt door poly-L-lysine met FITC toe te voegen. Genereer de master silicium wafer met behulp van standaard fotolithografie procedures.Het ontwerp dat hier wordt gebruikt is een vier bij vier milliliter rechthoekige array van 30 micrometer diameter gevulde cirkels, met een 150 micrometer centrum naar het centrum afstand, maar het kan worden gewijzigd zoals gewenst voor verschillende toepassingen. Spin-coat een 40 micrometer dikke laag negatieve fotoresist op een silicium wafer. Bak vervolgens de wafer op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten.En 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Stel de wafer bloot aan UV-licht door middel van een chroom fotomasker met 150 tot 160 millijoule per vierkante centimeter. Bak de wafer opnieuw op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en 95 graden Celsius gedurende 10 minuten.Dan onderdompelen in fotoresistische ontwikkelaar voor 10 minuten. En spoel het af met isopropylalcohol. Het patroon moet nu zichtbaar zijn op de wafer.Meng vervolgens grondig een verhouding van 10 tegen één van polydimethylsiloxaan, of PDMS, prepolymeer en zijn uithardingsmiddel. En giet het ongezuite mengsel over de meester wafer in een petrischaaltje. Vacuüm behandel het ongezcureerde PDMS mengsel totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Dan genezen 's nachts op 65 graden Celsius. Gebruik de volgende dag een scalpel om rond de buitenkant van het patroongedeelte van de wafer te snijden. En verwijder langzaam de uitgeharde PDMS plaat, het plaatsen van het op een schone snijplank met de patroon kant naar boven.Punch uit individuele stempels uit de PDMS plaat met een acht millimeter biopsie punch en plaats elke stempel face-down op de plakband om puin te verwijderen. Met deze stempels naar boven gericht, prime elke stempel met 100 microliters van de vooraf voorbereide CP-oplossing, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen vormen tussen de oplossing en de stempel. Keer vervolgens de stempels om op een laag CP-oplossing en verwijder ze na een uur.Dep elke natte stempel met het gezicht naar beneden op een schone glazen glijbaan zes tot acht keer om overtollige vloeistof te verwijderen. Dan vacuüm behandelen de stempels voor een tot twee minuten. Plaats een acht goed, acht millimeter diameter imaging spacer op de top van een schone glazen glijbaan als een gids voor postzegel plaatsing.Plaats een stempel met het gezicht naar beneden op de glazen glijbaan in het midden van elke put van de imaging spacer. Plaats vervolgens een evenwichtig gewicht van 5,6 gram op elke stempel en laat 10 minuten stempelen. Verwijder de gewichten en de stempels van de glijbaan en laat de CP-laag 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat biodeeltjes worden toegevoegd.Als de CP is getagd met FITC, controleer dan de effectiviteit van het stempelen met een fluorescerende microscoop. Snijd een lege PDMS plaat ter grootte van de imaging spacer en gebruik de acht millimeter biopsie punch om putten te maken in de PDMS die uitlijnen met de putten van de afstandsman. Plak vervolgens de PDMS-plaat aan de glazen schuif.Ontdooi een oplossing van biodeeltjes en verdun deze tot 500 microgram per milliliter in water voor injectie. Voeg 100 microliter biodeeltjesoplossing toe aan elke PDMS goed op de glazen glijbaan en rock de glijbaan gedurende 30 minuten. Spoel de putten grondig met water en controleer het patroon op de glijbaan met een fluorescerende microscoop.De biodeeltjesmicroarray kan maximaal drie maanden in een stofvrije omgeving worden bewaard bij vier graden Celsius. Bereid de cellen door ze opnieuw in te stellen op 7,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in IMDM met 0,4% menselijk serum albumen. Voeg 100 microliter van de suspensie toe aan een PDMS-put die de biodeeltjesmicroarray bevat, zodat de celsuspensie over de bovenkant van de PDMS goed is en geen bubbels bevat.Verzegel de put met een dekselslip met een diameter van 12 millimeter en druk zachtjes met een pincet naar beneden, zodat de overtollige celsuspensie naar de rand van de put ontsnapt en gebruik vervolgens een weefsel om het overtollige te verwijderen. Om de cellen in beeld te brengen, laadt u de microdeeltjesarray met cellen op het live celbeeldvormingsstation van een microscoop die is uitgerust met een kooiincubator die is ingesteld op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 90% relatieve vochtigheid. Gebruik time lapse, fluorescerende en heldere veldmicroscopie om beelden op te nemen bij 10X vergroting om de 10 seconden op 405 nanometer, 594 nanometer en helder veld.Broed de neutrofielen in de putten met biodeeltjes op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende drie uur, waarbij monsters worden genomen op de gewenste tijdstippen. Gebruik een heldere veldmicroscoop om te controleren of zwermen worden gevormd op de microarray. Verzamel het volledige volume van supernatant van een enkele put, en laad het in een 0,45 micrometer centrifuge filter buis, ervoor te zorgen om elk keer punt in drievoud te analyseren.Centrifugeren de buizen op 190 keer G en 20 graden Celsius gedurende vijf minuten, en het verzamelen van de gefilterde volume. Bewaar vervolgens de monsters op min 80 graden Celsius tot de verwerkingstijd. Bij een poging dit protocol, werken met fotoresist en ontwikkelaar in de rookkap.Laat een door de IRB goedgekeurd protocol opstellen voordat u bloed van menselijke donoren neemt. Vergeet niet dat materialen afkomstig van menselijk bloed zijn BSL2. Wanneer neutrofielen worden toegevoegd aan de biodeeltjesmicroarray, worden neutrofielen die contact maken met de biodeeltjesclusters geactiveerd en de zwermende reactie geïnitieerd.De biodeeltjesmicroarray werd gevalideerd met behulp van time lapse fluorescerende microscopie om neutrofiele migraties naar de biodeeltjesclusters te volgen. Stabiele neutrofiele zwermen worden gevormd rond elke cluster na 30 tot 60 minuten van blootstelling. Neutrofielen daarentegen vertonen geen collectieve migratie bij afwezigheid van biodeeltjesclusters.Fluorescentie intensiteit van gekleurde neutrophil kernen werd gebruikt om te bepalen dat de gemiddelde zwerm grootte rond de biodeeltjes clusters was ongeveer 1490 micrometer kwadraat. Bij afwezigheid van clusters bleef de fluorescentie van een bepaald gebied van belang na verloop van tijd constant. Sporen van neutrofiele migratie tonen aan dat neutrofielen samenkwamen op een biodeeltjescluster toen er een aanwezig was, maar er werd geen convergentie waargenomen in het controlesysteem.De snelheid van zwermen en niet-geactiveerde neutrofielen werd gemeten, en een statistisch significant verschil in de snelheidsverdelingen werd gevonden. De gemiddelde snelheid voor zwermende neutrofielen was 20,6 micrometer per minuut, terwijl de gemiddelde snelheid voor controle neutrofielen was twee micrometer per minuut. De concentraties van 16 eiwitten die neutrofielen afgeven tijdens het zwermen werden in de loop van de tijd geanalyseerd.10 eiwitten verhoogd in concentratie. Twee afgenomen. En de overige vier namen toe tijdens het eerste uur van zwermen, maar daalden daarna.Zorg er tijdens het uitvoeren van deze procedure voor dat alles schoon is en dat uw stempels goed worden gedroogd, omdat deze essentieel zijn voor een succesvolle patronen van de bacteriële deeltjes. De ontwikkeling van deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om nieuwe vragen op het gebied van neutrofiele zwermen te verkennen, waaronder hoe vrije bemiddelaars en extracellulaire vikjes betrokken zijn bij neutrofiele intercellulaire communicatie.

bioparticle-microarrays-for-chemotactic-molecular-analysis-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Hier presenteren we een protocol om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten in muizen modellen te kwantificeren, om de effecten van nutritionele, farmacologische en genetische interventies op bloed monocyten te beoordelen en om de in het bloed geafgeleide macrofagen te karakteriseren in Muismodellen met behulp van monocyte-chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1)-geladen in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers.

Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Tonen we de montage en de toepassing van een moleculaire schaal apparaat aangedreven door een topoisomerase eiwit. Het construct is een bio-moleculaire sensor die twee belangrijke soorten van DNA breuken in weefselcoupes labels door het aanbrengen van twee verschillende fluoroforen om hun doel.

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Leer biopartikel-microarrays maken voor chemotactische analyse van humane neutrofiele zwermen in vitro. Deze methode biedt kwantitatieve beeldvorming van migratie en toegang tot secreted cytokines.

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Meer video's verkennen