Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Dit protocol is belangrijk omdat het een in vitro analyse van neutrofiele zwermen mogelijk maakt, die vele beperkingen van ons huidige onvermogen om te experimenteren overwint. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijke toegang biedt tot de uitgescheiden cytokines en lipide bemiddelaars die neutrofielen vrijlaten tijdens het zwermen en kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk maakt. Terwijl we deze techniek toepasten op neutrofielen, kon het worden uitgebreid om de migratie van andere witte bloedcellen zoals monocyten en T-cellen te analyseren.

Begin met de voorbereiding van een 1,6 milligram per milliliter cationic polyelectroliet, of CP oplossing, door het toevoegen van de juiste hoeveelheid CP poeder aan water en mengen op de roerplaat 's nachts of totdat alle vaste stoffen zijn opgelost. Indien gewenst kan de oplossing fluorescerend worden gemaakt door poly-L-lysine met FITC toe te voegen. Genereer de master silicium wafer met behulp van standaard fotolithografie procedures.

Het ontwerp dat hier wordt gebruikt is een vier bij vier milliliter rechthoekige array van 30 micrometer diameter gevulde cirkels, met een 150 micrometer centrum naar het centrum afstand, maar het kan worden gewijzigd zoals gewenst voor verschillende toepassingen. Spin-coat een 40 micrometer dikke laag negatieve fotoresist op een silicium wafer. Bak vervolgens de wafer op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten.

En 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Stel de wafer bloot aan UV-licht door middel van een chroom fotomasker met 150 tot 160 millijoule per vierkante centimeter. Bak de wafer opnieuw op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en 95 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Dan onderdompelen in fotoresistische ontwikkelaar voor 10 minuten. En spoel het af met isopropylalcohol. Het patroon moet nu zichtbaar zijn op de wafer.

Meng vervolgens grondig een verhouding van 10 tegen één van polydimethylsiloxaan, of PDMS, prepolymeer en zijn uithardingsmiddel. En giet het ongezuite mengsel over de meester wafer in een petrischaaltje. Vacuüm behandel het ongezcureerde PDMS mengsel totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Dan genezen 's nachts op 65 graden Celsius. Gebruik de volgende dag een scalpel om rond de buitenkant van het patroongedeelte van de wafer te snijden. En verwijder langzaam de uitgeharde PDMS plaat, het plaatsen van het op een schone snijplank met de patroon kant naar boven.

Punch uit individuele stempels uit de PDMS plaat met een acht millimeter biopsie punch en plaats elke stempel face-down op de plakband om puin te verwijderen. Met deze stempels naar boven gericht, prime elke stempel met 100 microliters van de vooraf voorbereide CP-oplossing, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen vormen tussen de oplossing en de stempel. Keer vervolgens de stempels om op een laag CP-oplossing en verwijder ze na een uur.

Dep elke natte stempel met het gezicht naar beneden op een schone glazen glijbaan zes tot acht keer om overtollige vloeistof te verwijderen. Dan vacuüm behandelen de stempels voor een tot twee minuten. Plaats een acht goed, acht millimeter diameter imaging spacer op de top van een schone glazen glijbaan als een gids voor postzegel plaatsing.

Plaats een stempel met het gezicht naar beneden op de glazen glijbaan in het midden van elke put van de imaging spacer. Plaats vervolgens een evenwichtig gewicht van 5,6 gram op elke stempel en laat 10 minuten stempelen. Verwijder de gewichten en de stempels van de glijbaan en laat de CP-laag 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat biodeeltjes worden toegevoegd.

Als de CP is getagd met FITC, controleer dan de effectiviteit van het stempelen met een fluorescerende microscoop. Snijd een lege PDMS plaat ter grootte van de imaging spacer en gebruik de acht millimeter biopsie punch om putten te maken in de PDMS die uitlijnen met de putten van de afstandsman. Plak vervolgens de PDMS-plaat aan de glazen schuif.

Ontdooi een oplossing van biodeeltjes en verdun deze tot 500 microgram per milliliter in water voor injectie. Voeg 100 microliter biodeeltjesoplossing toe aan elke PDMS goed op de glazen glijbaan en rock de glijbaan gedurende 30 minuten. Spoel de putten grondig met water en controleer het patroon op de glijbaan met een fluorescerende microscoop.

De biodeeltjesmicroarray kan maximaal drie maanden in een stofvrije omgeving worden bewaard bij vier graden Celsius. Bereid de cellen door ze opnieuw in te stellen op 7,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in IMDM met 0,4% menselijk serum albumen. Voeg 100 microliter van de suspensie toe aan een PDMS-put die de biodeeltjesmicroarray bevat, zodat de celsuspensie over de bovenkant van de PDMS goed is en geen bubbels bevat.

Verzegel de put met een dekselslip met een diameter van 12 millimeter en druk zachtjes met een pincet naar beneden, zodat de overtollige celsuspensie naar de rand van de put ontsnapt en gebruik vervolgens een weefsel om het overtollige te verwijderen. Om de cellen in beeld te brengen, laadt u de microdeeltjesarray met cellen op het live celbeeldvormingsstation van een microscoop die is uitgerust met een kooiincubator die is ingesteld op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 90% relatieve vochtigheid. Gebruik time lapse, fluorescerende en heldere veldmicroscopie om beelden op te nemen bij 10X vergroting om de 10 seconden op 405 nanometer, 594 nanometer en helder veld.

Broed de neutrofielen in de putten met biodeeltjes op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende drie uur, waarbij monsters worden genomen op de gewenste tijdstippen. Gebruik een heldere veldmicroscoop om te controleren of zwermen worden gevormd op de microarray. Verzamel het volledige volume van supernatant van een enkele put, en laad het in een 0,45 micrometer centrifuge filter buis, ervoor te zorgen om elk keer punt in drievoud te analyseren.

Centrifugeren de buizen op 190 keer G en 20 graden Celsius gedurende vijf minuten, en het verzamelen van de gefilterde volume. Bewaar vervolgens de monsters op min 80 graden Celsius tot de verwerkingstijd. Bij een poging dit protocol, werken met fotoresist en ontwikkelaar in de rookkap.

Laat een door de IRB goedgekeurd protocol opstellen voordat u bloed van menselijke donoren neemt. Vergeet niet dat materialen afkomstig van menselijk bloed zijn BSL2. Wanneer neutrofielen worden toegevoegd aan de biodeeltjesmicroarray, worden neutrofielen die contact maken met de biodeeltjesclusters geactiveerd en de zwermende reactie geïnitieerd.

De biodeeltjesmicroarray werd gevalideerd met behulp van time lapse fluorescerende microscopie om neutrofiele migraties naar de biodeeltjesclusters te volgen. Stabiele neutrofiele zwermen worden gevormd rond elke cluster na 30 tot 60 minuten van blootstelling. Neutrofielen daarentegen vertonen geen collectieve migratie bij afwezigheid van biodeeltjesclusters.

Fluorescentie intensiteit van gekleurde neutrophil kernen werd gebruikt om te bepalen dat de gemiddelde zwerm grootte rond de biodeeltjes clusters was ongeveer 1490 micrometer kwadraat. Bij afwezigheid van clusters bleef de fluorescentie van een bepaald gebied van belang na verloop van tijd constant. Sporen van neutrofiele migratie tonen aan dat neutrofielen samenkwamen op een biodeeltjescluster toen er een aanwezig was, maar er werd geen convergentie waargenomen in het controlesysteem.

De snelheid van zwermen en niet-geactiveerde neutrofielen werd gemeten, en een statistisch significant verschil in de snelheidsverdelingen werd gevonden. De gemiddelde snelheid voor zwermende neutrofielen was 20,6 micrometer per minuut, terwijl de gemiddelde snelheid voor controle neutrofielen was twee micrometer per minuut. De concentraties van 16 eiwitten die neutrofielen afgeven tijdens het zwermen werden in de loop van de tijd geanalyseerd.

10 eiwitten verhoogd in concentratie. Twee afgenomen. En de overige vier namen toe tijdens het eerste uur van zwermen, maar daalden daarna.

Zorg er tijdens het uitvoeren van deze procedure voor dat alles schoon is en dat uw stempels goed worden gedroogd, omdat deze essentieel zijn voor een succesvolle patronen van de bacteriële deeltjes. De ontwikkeling van deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om nieuwe vragen op het gebied van neutrofiele zwermen te verkennen, waaronder hoe vrije bemiddelaars en extracellulaire vikjes betrokken zijn bij neutrofiele intercellulaire communicatie.