Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

GelMA hydrogel gebaseerde bionica worden erg populair in 3D bioprinting. De lage viscositeit beperkt echter de afdrukbaarheid. Hier delen we strategieën voor het printen van GelMA in ons lab met andere onderzoekers.

In deze video maken we volledig gebruik van de speciale eigenschappen van dit biomateriaal en stellen we verschillende printmethoden voor voor verschillende 3D-structuren die kunnen bijdragen aan verdere biomedische toepassingen. Om bijvoorbeeld orgaanschade op te nemen, kunnen implicaties in de overeenkomstige therapie worden gebruikt door het injecteren van inbedding of het traceren van de gedrukte GelMA-structuren. Het zou niet gemakkelijk zijn om de gevriesdroogde GelMA in korte tijd volledig op te lossen.

Om het oplosproces te versnellen kan een vortexmixer worden gebruikt. Elk biomateriaal zal gebruik maken van speciale eigenschappen intiem van GelMA. Ik stelde voor een nieuwe chemer moet goed een wandeling van wat is conditionering kritisch bij het afdrukken.

De bewerkingsdetails bepalen het succes van afdrukprocedures. Daarom kiezen we voor een visuele demonstratie om te delen met andere onderzoekers. Om microsferen te fabriceren beginnen met het aansluiten van de twee metalen ring elektroden met de grond en positieve polen.

Plaats de metalen plaat verbonden met de hoge spanning onder de ringelektrode en een petrischaal met siliciumolie op de metalen plaat als druppelontvanger. Bereid bio-inkt door het oplossen van gevriesdroogde GelMA en LAP en DPBS filteren het door 0,22 micrometer filter voor steriliteit dan verwarmen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten. Los MDA-MB-231 cellen met drie milliliter van 0,25 procent trypsine en 0,02 procent EDTA oplossing gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius.

Breng de cellen naar een 15 milliliter buis en centrifugeren ze op 100 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en meng de cellen met een milliliter bereide bio-inkt door langzaam pipetten op en neer om ervoor te zorgen dat luchtbellen te voorkomen. Aspirate een milliliter van de bio-inkt en cel mengsel in een drie milliliter steriele spuit.

Voer de bio-inkt door de kracht van perslucht en zet de spuit op de armatuur. Schakel het hoogspanningsvermogen in en stel de spanning in als nul tot vier kilovolt. Schakel tegelijkertijd het golflengtelampje van 405 nanometer aan om de GelMA-druppels in vijf milliliter siliciumolie te kruisen.

Decanteer de petrischaal om zich te ontdoen van het grootste deel van de siliciumolie en gebruik een lepel om de resterende olie en microsferen over te brengen in een 15 milliliter centrifuge buis. Voeg vijf milliliter DPBS toe en schud het mengsel centrifuge de buis op 100 keer G en verwijder de supernatant. Breng de microsferen in een petrischaaltje met DMEM en kweek ze op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide gedurende drie dagen.

Na drie dagen gooi het medium weg en was de microsferen met DPBS. Bevestig ze met twee milliliter van vier procent PFA gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en gooi de PFA weg en herhaal de was. Permeabiliseren van de cellen met twee milliliter van 0,5 procent niet-ionische oppervlakteactieve gedurende vijf minuten op kamertemperatuur gooi de oppervlakteactieve en was de microsferen met DPBS.

Volgende vlek de cellen met TRITC-phalloidin gedurende 30 minuten dan DAPI gedurende 10 minuten in het donker ontdoen van de kleurstoffen en het wassen van de bollen met DPBS na elke kleuring. Beeld de microsferen met een confocale fluorescentiemicroscoop. Los gesteriliseerd natriumalginaatpoeder op in gedeïsteerd water met een gewichts-volumeverhouding van twee procent.

Bereid steriele bio-inkt oplossing zoals eerder beschreven dan warmte de bio-inkt en natriumalginaat in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten. Trypsinize en centrifuge bMSCs volgens de eerder beschreven procedure voor MDA-MB 231 cellen verwijder vervolgens de supernatant vloeistof en resuspend de celpellet met 2 milliliter van de GelMA bio-inkt. Aspirate twee milliliter van de bio-inkt cel mengsel in een 10 milliliter spuit en twee milliliter van de natriumalginaat mengsel in een andere spuit.

Voer de oplossingen met twee spuitpompen bio-inkt op 50 micrometer per minuut en natriumalginaat op 350 micrometer per minuut. Zet het golflengtelicht van 405 nanometer aan om de transparante buis te bestralen en de GelMA-vezels te kruisen. Gebruik een petrischaaltje om de vezels te ontvangen en ze te verzamelen met een lepel.

Breng de vezels in een schotel met DMEM/F12 en cultuur ze voor drie dagen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Na het kweken volgen de cellen de eerder beschreven aanwijzingen voor het observeren van de vezels onder een confocale fluorescentiemicroscoop. Los gevriesdroogde GelMA en LAP en DPBS op en voeg magenta eetbaar pigment toe aan de oplossing om de afdruknauwkeurigheid te verbeteren.

Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 micrometer voor steriliteit en verwarm deze gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Bouw de 3D-modellen met CAD-software en importeer de modeldocumenten naar de bovenste software van de toegepaste DLP-bioprinter. Voeg tien milliliter van de bereide bio-inkt toe aan de trog van de bioprinter.

Stel de afdrukparameters in op basis van de manuscriptaanwijzingen en begin vervolgens met afdrukken. Wanneer volledig verwijder de gedrukte structuur van de bioprinter en dompel het in DPBS in een Petri schotel onder. Los en pellet MDA-MB 231 cellen zoals eerder beschreven.

Resuspend ze met twee milliliter DMEM en voeg de suspensie toe aan de geprinte structuur. Kweek de cellen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide gedurende drie dagen en bereid de structuren voor observatie met een confocale fluorescentiemicroscoop zoals eerder beschreven. Bereid een gewicht van 10 procent voor op het volume GelMA en 0,5 procent gewicht in volume LAP-oplossing en filtreer het vervolgens door een filter van 0,22 micrometer.

Steriliseer gelatinepoeder onder UV-licht gedurende 30 minuten en voeg het toe aan de GelMA LAP-oplossing met een gewichts-volumeverhouding van vijf procent. Verwarm het mengsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten. Vul de mallen met de bereide bio-inkt en leg ze in een vier graden Celsius koelkast gedurende 30 minuten.

Gebruik een mes om de gedeeltelijk met elkaar verbonden hydrogelplaten uit de mallen te verwijderen. Combineer 2D gegoten hydrogel vellen en bind ze met GelMA door te bestralen op 405 nanometer voor een minuut. Los en pellet HUVEC's mengen de cellen met twee milliliter DMEM en injecteren de suspensie in het microkanaal met het mondstuk en de spuit.

Voor de komende drie uur flip de chip ondersteboven elke 15 minuten om uniforme en volledige cel zitplaatsen te bereiken. Kweek de chips in een petrischaaltje drie dagen in DMEM bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide en bereid ze vervolgens voor op morfologische observatie. Toen de GelMA druppels in de ontvangende siliconenolie vielen, hielden ze een standaard sferoïde vorm zonder staarten.

De ingekapselde cellen ervaren de hoge spanning elektrische veldkracht handhaafde hun verspreiding vermogen dat de biocompatibiliteit van de elektro-ondersteunde fabricage methode geverifieerd. Een DLP bioprinter werd gekozen om GelMA structuren te fabriceren met complexere vormen zoals neusoor en multi chamber. Gezaaide HUVEC's aan de GelMA-materialen en verspreid over het oppervlak van de met elkaar verbonden GelMA-structuren waaruit blijkt dat deze toepassing potentieel heeft voor weefselmanipulatie.

Een tweemaal cross-linking strategie werd gebruikt om GelMA gebaseerde microfluïde chips fabriceren. Chips met verschillende microkanalen werden gebouwd door het ontwerpen van verschillende mallen op aanvraag en HUVECs werden gezaaid in de kanalen en bevestigd aan de kanaalwand vormen de macroscopische vat vorm. Bij het fabriceren van microsferen wordt een hoogspanningsbron toegepast.

Onderzoekers moeten onderzoeken circuit voor en niet aanraken blootgesteld millibars beschermen van operators of maakt de cellen van een schade door kortsluiting. De ultrasone waterbasis zou een andere keuze kunnen zijn om de verdienstelijke snelheid te versnellen. Zeker deze bijdrage samengevat de 3D bioprinting methoden van GelMA in ons lab.

Onderzoekers kunnen verwijzen naar de video en verbeteren of uit te breiden afdrukken strategieën om verdere biomedische eisen te dienen.