Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

Met het gebruik van dit protocol onderzoekers kunnen identificeren nieuwe exoom of extracellulaire vesicle gebaseerd en weefsel gebaseerd micro cellulair voor gevorderde prostaatkanker. Het isoleren van RNA uit zowel F-F-B-weefsels als extracellulaire vikjes is vaak een uitdaging, omdat het grootste deel ervan ofwel de created is of in beperkte hoeveelheid is Dit deeltje zal verschillende methoden uitwerken om de R-N-A-ingangen en C-D-N-A-bibliotheken te optimaliseren om de meest specifieke vrije en hoogwaardige gegevens voor de volgende generatie sequencing te gen. Next gen sequencing biedt de meest uitgebreide platform voor het begrijpen van molecuul wijziging in de tumor die ten grondslag liggen aan tumor progressie dit deeltje is geoptimaliseerd met prostaatkanker klinische steekproef, en kan nieuwe inzichten in de onderliggende biologie van geavanceerde agressieve prostaatkanker.

Het optimaliseren van de C-D-N-A bibliotheken van laag input materiaal is een cruciale stap voor een succesvolle sequencing run is het daarom erg belangrijk om hoogwaardige C-D-N-A bibliotheken te genereren om nauwkeurige resultaten te krijgen. Na het uitvoeren van micro dissectie van weefsels zoals eerder gedaan overgaan tot het isoleren van serum afgeleide E-V's Dooi rijen van de patiënt serum monsters op vier graden Celsius. Breng 110 micro liter ontdooid serummonster naar een buis en draai op tweeduizend keer G gedurende dertig minuten.

Kies de super naden voor de volgende E-V of exosoom isolatie en gooi de debree pellet. Bij 30 microleters van serum exosoom isolatie reagens aan de super natent. Een incubeer het vier graden celsius gedurende dertig minuten.

Draai tien keer G voor tien minuten. Kies de E-V super nadent zorgvuldig zonder de pellet te storen in een aparte 1,5 milliliter buis en bewaar min 80 graden Celsius voor toekomstige analyse. Hang vervolgens de E-V-pellet opnieuw op in 70 microliter P-B-S bereid in nucleasevrij water.

Na het isoleren van de totale R-N-A van micro ontleed weefsels, en gezuiverd E-V's met behulp van commerciële kits uit te voeren Bibliotheek Voorbereiding in vijf micro liter van een genormaliseerde veertig nanogram per micro liter R-N-A monster op een micro liter van drie prime adapter. Verwarm de thermische cycler voor op 70 graden Celsius en broed het monster gedurende twee minuten uit. Breng de monsters onmiddellijk over op ijs.

In een aparte buis mix twee micro liter ligatie buffer, een micro liter RNase remmer en een micro liter T4 RNA ligase twee, een schrapping mutant. Meng bye pie beddengoed op en neer. Voeg vervolgens vier microliter van het mengsel toe aan de buis met de R-N-A 3 prime adapter op ijs.

Verwarm de thermische cycler voor op 28 graden Celsius. En plaats de buis in de thermische cycler om een uur in te broeden. Voeg daarna een microliter stopoplossing toe aan de buis terwijl het monster op de thermische cycler blijft.

Incubeer op 28 graden Celsius voor nog eens 15 minuten. Verwijder vervolgens onmiddellijk de buis en houd op ijs. In een aparte buis voeg een microliter van vijf prime adapter.

Breng over op een thermische cycler die is voorverwarmd tot 70 graden Celsius. En twee minuten uitbroeden. Plaats de buis onmiddellijk op ijs om te voorkomen dat de adapters opnieuw worden geplaatst.

Voeg een micro liter tien millimole A-T-P toe aan de buis van D natured vijf prime adapter. Meng bye pie pedding en voeg een micro liter T4 R-N-A ligase aan de mix. Mix bye pie pedding.

Breng drie microliter van dit mengsel naar de buis met de drie prime adapter ligated R-N-A. Plaats de buis op de thermische cycler die is voorverwarmd tot 28 graden celsius en incubeer gedurende een uur. Breng daarna onmiddellijk de buis over op ijs en ga verder met de monsters of bewaar bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Voor het uitvoeren van R-T-P-C-R, gebruik maken van zes micro ligers van elke adapter ligated R-N-A en voeg een micro liger van R-N-A R-T primer aan. Breng de buis naar het thermische cycler voorverwarmd tot 70 graden Celsius en incubeer gedurende twee minuten. Breng de buis over op ijs.

In een aparte buis mix twee micro liter 5X, streng buffer, 5 micro liter 12,5 milimoler DNTP's, een micro liter 100 milimolar DTT, een micro liter R-N-A's remmer, en een micro liter reverse transcriptas. Voeg vijf microliter van dit mengsel toe aan de adapter ligated RNA en breng het over naar de thermische cycler die is voorverwarmd tot 50 graden Celsius om een uur in te broeden. Na een uur breng je de adapter met gratis DNA direct naar het ijs.

In een aparte buis, meng 25 microliter van PCR mix, twee micro liter RNA PCR primer, twee micro liter RNA PCR primer index, en 8,5 microliter van gratis water RNA's. Voeg 37,5 microliter van deze mix toe aan 12,5 microliter van de adapter ligated CDNA. Breng de buis over op de thermische cycler die is voorverwarmd tot 98 graden celsius.

Programmeer de thermische cycler zoals voorgesteld in het protocol van de fabrikant met het cyclusnummer gewijzigd tot 15. Na voltooiing, houd het monster op vier graden Celsius. Ga verder of bewaar bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Om het geligligeerde gratis DNA te zuiveren, voeg je tien microliters van de DNA-ladingskleurstof toe aan elk gratis DNA-monster. En aan tien microliters van de hoge resolutie laatstgenoemde en douane RNA laatstgenoemde. Voer 30 microliter van elk monster in twee afzonderlijke rijstroken naast elkaar in de zes procent TBE Polyacrylamide gel.

Met aangepaste RNA laatste en hoge resolutie laatste, de tussenliggende ruimte tussen de twee verschillende monsters. Voer de gel in een X TBE buffer op 145 volt gedurende ongeveer 30 tot 40 minuten. Houd de onderste blauwe voorkant van de ladingskleurstof in de gaten.

Stop de elektroforese wanneer het de onderkant van de gel nadert. Breng de gel in één X TBE-buffer met 5 microgram per millimeter ethidium bromide. Visualiseer de gel in een transilluminator en snijd de gel precies tussen het 145 basispaar en 160 base pair markers en iets boven de 145 base pair marker om besmetting met adapter dimer te voorkomen.

Een kritieke stap is zuivering ligated CDNA die wordt gedaan door het snijden van de gel precies als adapter dimers lopen zeer verliezen aan het gewenste merk. Breng de gel stukken naar DNA breken buizen bewaard in twee millimeter verzamelen buizen. Draai twee minuten op 20.000 g.

En voeg driehonderd micro liter RNase-vrij water toe en laat het 's nachts zachtjes draaien op een rocker bij kamertemperatuur. Om de DNA-neerslag uit te voeren op de volgende dag breng de inhoud van de buis naar 5 micron filterbuizen. Draai 600 keer G voor strikt tien seconden.

Voeg vervolgens twee microliters van glycogeen dertig microliters van drie molaire natriumacetaat, 1X pellet verf, en 975 microliters van 100 procent ethanol aan eluted DNA. Draai op 17.000 keer G bij 4 graden Celsius gedurende 20 minuten. Gooi de supernatant weg en voeg 75 procent ethanol toe om de pellet te wassen.

Na het spinnen op 17 duizend keer G op vier graden Celsius gedurende vijf minuten gooi de supernatant en incubeer de buizen op 37 graden celsius op een thermisch blok volledig verdampen de ethanol. Stel de pellet opnieuw op met 12 microliter van 10 millimolar triciderchloride bij PH 8.5. Voer vervolgens een bibliotheek kwaliteitscontrole door het verdunnen van de gezuiverde en gratis DNA tien keer en met behulp van een microliter van de verdunde CDNA te draaien op een bioanalyzer.

Zorg ervoor dat de gratis DNA-productgrootte overeenkomt met het bereik van het kleine RNA in het elektroferogram tussen 136 en 160 basisparen. Bereken de totale molariteit voor elk monster. Normaliseer elk monster tot 2 nanomolar met behulp van de tris hydrochloride op PH 8.5.

Houd de bibliotheken door het mengen van gelijke volumes van elk twee nanomolar monster in een enkele tweehonderd microliter PCR buis. Denature en volgorde volgens de stappen zoals beschreven in het manuscript. In deze studie werd de bibliotheek voorbereid na RNA isolatie en werd een kwaliteitscontrole uitgevoerd.

De productgrootte voor adapter ligated micro Rnase kwam overeen met ongeveer 136 tot 160 basisparen voor elk monster. De gemarkeerde secties toont het bereik van de gel die precies werd verwijderd voor kleine RNA bibliotheek van voorbereiding. Deze figuur toont de gel elektroforese en elektroferogrammen voor de gezuiverde gratis DNA bibliotheek.

Micro ontleed FFPE weefsel en serum afgeleide EV's. De representatieve statistieken van een kleine RNA-sequencing-run tonen de verwachte clusterdichtheid, Q-score, clusterdoorpassingsfilterpercentage en de geschatte opbrengst- en foutpercentages voor micro ontleed FFP-weefsel en serum afgeleide EV's. De Q-score in beide monsters toonde een waarde boven de drie die 99,9 procent van de nauwkeurigheid van de basisoproep aangeeft.

En de foutenpercentages waren allemaal onder de één. Elke stap in de voorbereiding van de bibliotheek moet zorgvuldig worden uitgevoerd en buizen moeten onmiddellijk na elke incubatie naar ijs worden overgebracht. Een belangrijke stap in het protocol is het snijden van de gel precies om ervoor te zorgen dat u een adapter dimer vrije en pure CDNA bibliotheek.

Het genereren van CDNA-bibliotheek vereist optimalisatie voor een sequencing-run van hoge kwaliteit. Inzicht in dit protocol zal de kijkers helpen bij het extrapoleren van deze minieme details naar andere sequencing bibliotheek prepration van beperkte bron monsters suggereren serum en extracellulaire vikjes. Deze techniek heeft ons geholpen bij het identificeren van nieuwe micronase die geassocieerd tumoraat agressiviteit en therapie resistentie bij uitgezaaide prostaatkanker patiënten.

Deze technieken kunnen geëxtrapoleerd naar andere soorten ziekten die kunnen helpen bij nieuwe biomarker ontdekking. Aangezien deze techniek gebruik maakt van biologische materialen zoals striation afgeleide serum en weefselmonsters, moet men passende voorzorgsmaatregelen nemen. Verder is ethidium bromide een bekende kankerverwekkende stof en moet zeer zorgvuldig worden behandeld met behulp van dit protocol.