Name: Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer celcelfusie van genoom-bewerkte cellijnen om celstructuur en -functie te verstoren. Fluorescentiemicroscopie volgt organellen terug naar hun oorspronkelijke celtype.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship naar R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Number 100090/12/Z). De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. We danken Ashok Venkitaraman en Paul French voor kritisch advies en begeleiding bij het project. We danken Chiara Cossetti en Gabriela Grondys-Kotarba in het Cambridge Institute for Medical Research flow Cytometry faciliteit voor uitstekende ondersteuning. We danken Liam Cassiday, Thomas Miller, en Gianmarco Contino voor het naleden van het manuscript.

1. differentiële fluorescerende Celetikettering
<ol><li>Gentagging met CRISPR Cas9<ol>
<li>Gebruik CRISPR Cas9 genoom Editing te labelen rootletin (of andere genen van belang) met de fluorescerende eiwitten meGFP of mScarlet-I in menselijke kanker cellijnen. Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor genoom bewerking worden elders behandeld24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluorescerende kleurstof etikettering<ol>
<li>Groeien Cal51 menselijke kankercellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine, en 100 μg/mL penicillaire/streptomycine bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde incubator. Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat cellen regelmatig worden gecontroleerd op de afwezigheid van mycoplasma besmetting, en voor de identiteit van de cellijn. Gebruik geen cellen die op grote schaal zijn doorgangen in de cultuur (> 15 passages). Cellen moeten gezond zijn en exponentieel groeien. Vermijd onderconfluentie of overconfluentie.</li>
		<li>Zaai elk celtype (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I en niet-gecodeerde Cal51 cellen van de ouders), zodat ~ 6 x 106 cellen de volgende dag voor elk monster aanwezig zijn, met een confluentie van 70 − 90%. Opmerking: Dit is ongeveer één T75 weefselkweek kolf of 1 10 cm schaal per celtype. De niet-gelabelde cellen van ouderlijk toezicht zijn vereist als negatieve controle verderop in het protocol. Dit protocol maakt de productie van ~ 20.000 gesmolten cellen mogelijk, maar dit aantal kan worden verhoogd door het uitbreiden van het protocol met een verhoogd aantal batches.</li>
		<li>De volgende dag, prewarme DMEM, trypsine en 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen.</li>
		<li>Was rootletin-meGFP en rootletin-mScarlet-I cellen 2x in PBS door het gieten of aspireren off medium en vervangen door 10 mL PBS.</li>
		<li>Label Cal51 rootletin-meGFP cellen door toevoeging van 500 nM Violet Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Label Cal51 rootletin-mScarlet-I cellen door toevoeging van 200 nM Far Red Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij RT. Opmerking: Houd voorbeelden afgeschermd van licht, waar mogelijk na fluorescerende kleuring, om foto bleken van fluorescentie te voorkomen.</li>
		<li>Stop de kleurstof etiketteringreacties door 10 mL DMEM gedurende 5 minuten toe te voegen.</li>
		<li>Verwijder niet-gelabelde ouderlijke Cal51 cellen uit de incubator (vanaf stap 1.2.2). Opmerking: Deze cellen zullen later worden gebruikt als niet-gelabelde negatieve besturingselementen (stap 3.3.2).</li>
		<li>Was alle cellen één keer door groeimedium te gieten en te vervangen door 10 mL PBS.</li>
		<li>Giet PBS af en inbroed gedurende 5 minuten bij kweek condities met 1 mL voorverwarmde 1x trypsine.</li>
		<li>Breng cellen over naar een plastic conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder en gooi trypsine voorzichtig uit de celpellet met een pipet.</li>
		<li>Breng de Violet en Far Red gelabelde celpellets voorzichtig in 1 mL PBS.</li>
		<li>Breng de ouder (niet-fluorescerende) celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM aan en keer terug naar de incubator. Opmerking: Dit voorbeeld zal geen celcelfusie ondergaan, maar zal later worden gebruikt tijdens de Flowcytometrie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celcelfusie
<ol><li>Meng 3 x 106 Violet gelabelde cellen met 3 x 106 ver rood gelabelde cellen in een buis van 15 ml door zachtjes met een pipet van 1 ml samen 0,5 ml van elk celtype te pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer de overgebleven niet-gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, giet vervolgens PBS af, hervat de pellet in 1 ml DMEM en keer terug naar de incubator. Opmerking: Deze overgebleven niet-gemengde enkelvoudige gelabelde monsters zullen later worden gebruikt als negatieve en compensatie controles in sectie 3 van het protocol.</li>
	<li>Centrifugeer de gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en zuig voorzichtig PBS op met een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Voeg 0,7 ml 50% 1450 Peg-oplossing op druppelsgewijs wijze toe aan de celpellet (stap 2,3) met behulp van een pipet van 1 ml over een periode van 30 sec.</li>
	<li>Laat 3,5 min bij RT. Opmerking: Incubatietijd met PEG kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype, hoewel merk op dat langere incubatietijd de celtoxiciteit verhoogt.</li>
	<li>Voeg 10 ml serum vrije DMEM druppelsgewijs toe voor 30 sec. en laat 10 minuten in de incubator staan.</li>
	<li>Spin naar beneden bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en regeer voorzichtig in 1 ml volledig medium (DMEM met FBS). Opmerking: Ga rechtstreeks naar sectie 3. Er is toxiciteit in verband met PEG blootstelling gevolgd door flow cytometrie en beeldvorming, dus houd cellen in cultuuromstandigheden zo veel mogelijk door snel te gaan tussen de stappen.</li>
</ol>3. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om gesmolten cellen te verrijken
<ol><li>Maak alle cellen klaar voor Flowcytometrie door elk monster voorzichtig afzonderlijk te pipetteren via een 70 μm filter in een FACS buis. Opmerking: Er zijn vier monsters nodig: gesmolten cellen, enkel gelabelde Far Red-cellen, enkelvoudig gelabelde Violette cellen, niet-gelabelde ouderlijke cellen. Eenmaal verwijderd uit de steriele weefselcultuur Hood, cellen hebben de capaciteit om besmet te raken, dus Minimaliseer de blootstellingsduur van monsters naar een niet-steriele omgeving vanaf hier. Cellen worden gesorteerd in volledig DMEM-medium.</li>
	<li>Gebruik een cytometer die geschikt is voor het sorteren van één cel.<ol>
<li>Stel de celsorteerder in voor een aseptische sortering. Voer de kwaliteitscontrole van het instrument uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
		<li>Teken een plot van forward Scatter versus side Scatter en een Doublet discriminatie plot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creëer poorten om gesmolten cellen te identificeren.<ol>
<li>Prikkelen de fluorescerende kleurstoffen bij golflengten van 405 nm en 635 nm. Detecteren op 450 nm en 660 nm (respectievelijk Violet en verre rode golflengten). Plot Far Red versus Violet golflengten.</li>
		<li>Voer ongegelabelde ouderlijke cellen uit via de cytometer en noteer de intensiteit van de fluorescentie. Opmerking: Waarden boven deze basislijn definiëren positiviteit voor kleurstof kleuring.</li>
		<li>Voer enkele gelabelde Violette cellen uit via de cytometer. Bevestig dat Violet niet in het verre rode kanaal is gemorst.</li>
		<li>Voer enkele gelabelde Far Red-cellen uit via de cytometer en bevestig dat er geen morsen van ver rood in het Violet kanaal zit. Opmerking: Voor de getoonde representatieve gegevens werden de cellen gesorteerd op 20 psi op een sorteerder uitgerust met een 100 μm nozzle.</li>
		<li>Voer kort het fusie monster uit om te bevestigen dat gesmolten cellen zichtbaar zijn met de poorten die in stap 3,3 zijn gemaakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lijn de sorteer stroom centraal uit in een 8-well Imaging Dish.</li>
	<li>FACS sorteren gesmolten cellen, presenteren als dubbele positieve Violet en ver rood gelabelde cellen rechtstreeks in een 8-well Imaging Dish met 100 μL groeimedium. Opmerking: Het maximaal aanbevolen aantal cellen is ~ 50.000 per 8-well Dish. Zorg voor celstatus tijdens het sorteren. Celconfluentie kan de celstatus beïnvloeden, dus houd cellen tussen 20 − 90% confluentie na sortering door een geschikt aantal cellen voor de beeldvormings schaal te sorteren. Elke gesorteerde druppel bevat ongeveer 3 nL van de mantel vloeistof. Zorg ervoor dat de mantel vloeistof het groeimedium tijdens het sorteren niet significant verdunnen.</li>
	<li>Direct na het sorteren, neem de cellen terug naar de incubator en laat > 2 uur of 's nachts. Opmerking: Aanhandende cellen zullen geleidelijk aan de dekslip in deze periode, vanaf het sorteren, en dus hun morfologie zal veranderen in de tijd als rechtstreeks naar de Microscoop.</li>
</ol>4. immunofluorescentie kleuring en beeldvorming van Celcelfusies
Opmerking: Gesmolten cellen kunnen live of na fixatie en verdere fluorescerende kleuring (of beide) worden afgebeeld, afhankelijk van de vereiste experimenten en metingen.
<ol><li>Live-celbeeldvorming<ol>
<li>Vervang het groeimedium door Imaging medium zonder fenolrood (tabel met materialen) en ga direct naar Imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixatie en kleuring<ol>
<li>Bereid verse 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS.</li>
		<li>Repareer cellen door ze in 100 μL van 4% PFA gedurende 15 minuten bij RT te inbroed. Verwijder PFA na 15 min. Let op: PFA is giftig bij inademing, dus deze stap moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Opmerking: Na fixatie kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart, indien nodig. Bewaar het monster bij 4 °C, indien nodig beschermd tegen licht.</li>
		<li>Was cellen 3x in 200 μL PBS bij RT.</li>
		<li>Permeabilize cellen gedurende 10 min bij RT in 200 μL van 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof (tabel met materialen) en 0,1% nonionisch reinigingsmiddel (tabel metmaterialen), verdund in PBS.</li>
		<li>In 200 μL van 3% boviene serumalbumine in PBS gedurende 30 min bij RT.</li>
		<li>Inbroed met antilichamen in 150 μL PBS met 3% boviene serumalbumine en 0,1% nonionisch oppervlakteactieve stof en 0,05% nonionisch reinigingsmiddel gedurende 1 uur bij RT. Opmerking: De primaire antilichamen die worden gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten zijn fluorescendig geconjugeerd anti-GFP nanobody (gebruikt bij 1:400 verdunning), en fluorescently geconjugeerde anti-mScarlet-I nanobody (gebruikt bij 1:500 verdunning). Deze versterken het signaal van de reeds fluorescerende eiwitten.</li>
		<li>Was 2x gedurende 5 minuten in 300 μL PBS en laat vervolgens in 200 μL PBS. Opmerking: Voorbeelden worden in PBS afgebeeld. Monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C beschermd tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Image Acquisition<ol>
<li>Verkrijg afbeeldingen met een geschikte fluorescentiemicroscoop die geschikt is voorbeeld vorming in vier kleuren (bijv. confocale, Widefield, gestructureerde belichting).</li>
		<li>Excite meGFP-en mScarlet-I-kanalen met respectievelijk 488 nm en 561 nm-golflengte lasers. Stel detectoren in om op ~ 505 − 550 nm en ~ 590 − 650 nm te detecteren. Excite Violet en Far Red Dye kanalen met 405 nm en 633 nm lasers, respectievelijk. Stel detectoren in op detectie bij ~ 430 − 500 nm en ~ 660 − 750 nm.</li>
		<li>Empirisch bepalen de laserintensiteit zodanig dat significante photobleaching niet optreedt en dat cellen gezond blijven (als Live-celbeeldvorming).</li>
		<li>Empirisch bepalen Gain zodanig dat signaal wordt verkregen zonder verzagende of kunstmatig knippen pixelwaarden.</li>
		<li>Verzamel Z-stack gegevens, zodat afbeeldingen driedimensionaal zijn, met een bereik van 20 − 60 μm met een stapgrootte van ~ 500 μm. Opmerking: De afbeeldingen getoond in representatieve gegevens werden verkregen door ofwel confocale(figuur 2B), airyscan (Figuur 2C) of gestructureerde verlichtings microscopie (Figuur 2D). Elke cel is een bonafide heterokaryon als het zowel Violet als veel rode kleurstoffen bevat die elkaar overlappen in het cytoplasma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+meaning+of+life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).</li>
<li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li>
<li>Köhler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Cell+Fusion%3A+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li>
<li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse%2C+Chinese+hamster%2C+and+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li>
<li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li>
<li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li>
<li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li>
<li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li>
<li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li>
<li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li>
<li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li>
<li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li>
<li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+glycol%29+%28PEG%29-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers%3A+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li>
<li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li>
<li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich%27s+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li>
<li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li>
<li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Trapping+and+Optical+Micromanipulation+XIII%22%5BJournal%5D)">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).</li>
<li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li>
<li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li>
<li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+centrosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).</li>
<li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li>
<li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+%28PEG%29-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+%28CAScT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li>
<li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).</li>
<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We demonstreren een faciele en kosteneffectieve protocol voor het fusing cellen en visualiseren van de daaropvolgende architectuur van celhybriden met microscopie, het nemen van ongeveer twee dagen van start tot finish. Kritieke delen van dit protocol zijn de verrijking van gesmolten cellen door celsortering (protocol sectie 3), en zorgvuldige validatie van gesmolten cellen door microscopie (protocol sectie 4). Deze secties zorgen ervoor dat gesmolten cellen gemakkelijk worden verkregen en bonafide heterokaryonen zijn. C...

Homeostatisch onderhoud van cellulaire structuur is essentieel voor het leven. Cellen hebben karakteristieke morfologieën, sub-cellulaire organel getallen, en interne biochemische samenstelling. Inzicht in hoe deze fundamentele eigenschappen worden gegenereerd en hoe ze gaan mis tijdens de ziekte vereist laboratorium gereedschap om hen te perturb.
Celfusie is het samenvoegen van twee of meer afzonderlijke cellen. Celfusie kan cruciaal zijn geweest voor de opkomst van eukaryotische leven1. In het menselijk lichaam is celfusie relatief zeldzaam, die optreedt tijdens beperkte ontwikkelingsomstandigheden en weefsel typen, zoals tijdens de bevruchting of de vorming van spieren, botten en de placenta2. Dit protocol beschrijft de inductie van celcelfusie in weefselkweek cellijnen met differentieel fluorescently gelabelde organellen, als een instrument om de mechanismen te begrijpen die de celstructuur en-functie beheersen.
In vitro geïnduceerde celcelfusie staat centraal in de productie van monoklonale antilichamen3, een belangrijk hulpmiddel voor biologisch onderzoek en ziekte behandeling. Cell Fusion is ook gebruikt om te vragen veel verschillende fundamentele cel biologische vragen over celcyclus dominantie4, aneuploïdie5,6, cellulaire herprogrammering7,8, de reparatie van beschadigde neuronen9, virale proliferatie10, apoptosis11, tumorvorming12, cytoskelet Dynamics13, en membraan fusie14,15. Laboratorium gebaseerde methoden voor het opwekken van celcelfusie16,17,18,19 induceren lipide membraan coalescentie door de fysieke samenvoeging van twee bilayers in één. Celfusie kan worden geïnduceerd door elektriciteit18, virale gebaseerdemethoden 17, thermsmonic verwarming20, transgen expressie19, en chemicaliën met inbegrip van polyethyleenglycol (PEG)16,21,22.
Centrosomes zijn microtubulus organiserende centra die cellulaire vorm, beweeglijkheid, polarisatie en divisie23beheersen. Centrosomale wortels zijn vezelachtige structuren die zich uitstrekken van nucleotiderende met het eiwit rootletin24 (gecodeerd door het gen crocc). We hebben onlangs gebruikt cel-cel fusie om te begrijpen hoe centrosoom positie en het aantal varieert binnen heterokaryons ten opzichte van ouderlijke cellen24. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om de cel van oorsprong van wortels binnen een heterokaryon te volgen na fusie van differentieel fluorescendig gelabelde ouderlijke cellen, en dus voorbeeld organel fusie en splijting. De fluorescently gelabelde eiwitten rootletin-meGFP of rootletin-mScarlet-ik zijn gemaakt door genoom Editing in afzonderlijke cellijnen die vervolgens worden gesmolten door PEG-gemedieerde celfusie. We beschrijven het gebruik van celkleurstoffen (tabel met materialen) om gesmolten cellen te identificeren door Flowcytometrie en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-identificatie van centroeen cel van oorsprong en morfologie (Figuur 1). Deze aanpak is een robuuste en unieke methode om te bestuderen hoe belangrijke veranderingen in cellulaire toestand, met inbegrip van organel nummer afbreuk aan op cel homeostase.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-well imaging dishes</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Influx Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell Filters (70 &mu;m)</td><td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 independent imaging medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free DMEM, high glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O tot 1 L</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>nonionogene oppervlakteactieve stof</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>nonionogene detergent</td></tr></tbody></table>

celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor perturbatie van cellulaire structuur en functie

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Het leven is ruimtelijk gepartitioneerd binnen lipide membranen om de geïsoleerde vorming van verschillende moleculaire toestanden binnen cellen en organellen mogelijk te maken. Celfusie is de fusie van twee of meer cellen om een enkele cel te vormen. Hier bieden we een protocol voor celfusie van twee verschillende celtypen. Gesmolten hybride cellen worden verrijkt door flow cytometrie-gebaseerde sortering, gevolgd door fluorescentiemicroscopie van hybride celstructuur en-functie. Fluorescerend gelabelde eiwitten gegenereerd door genoom bewerking worden in gesmolten cellen afgebeeld, waardoor cellulaire structuren kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie emissie en waarnaar wordt verwezen terug naar het celtype van oorsprong. Deze robuuste en algemene methode kan worden toegepast op verschillende celtypen of organellen van belang, om de cellulaire structuur en functie over een scala van fundamentele biologische vragen te begrijpen.

Correct gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens de stromings cytometrie door een fluorescentie signaal dat hoger is dan de niet-gelabelde controle cellen (Figuur 2A). Gates zijn ingesteld voor het sorteren van dubbele positieve cellen, die deze populatie rechtstreeks verrijken in beeldvormings gerechten voor verdere microscopische analyses. Gesmolten cellen zijn detecteerbaar als verschillende dubbele fluorescentienpositieve cellen en vormen ...

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Met deze methode kunnen cellulaire structuur en functie worden verstoord door de fusie van twee verschillende celtypen om vragen aan te pakken, zoals hoe cellen reageren op veranderingen in organellenummer. Door fluorescerende getagde eiwitten in gesmolten cellen te beelden, kunnen cellulaire structuren worden terugverwijzing naar hun celtype van oorsprong om de mechanismen van organelle homeostase en functie te bestuderen. Voor fluorescerende kleurstof etikettering, zie de menselijke kankercel populaties van belang zodanig dat elke cultuur zal zijn uitgebreid tot ten minste zes keer 10 tot de zesde cellen op een 70 tot 90%samenvloeiing door de volgende ochtend.Was op de dag van het etiketteren de rootletine eGFP- en rootletin-mScarletcellen twee keer met 10 milliliter PBS per wasbeurt. Verdun violette celkleurstof tot 500 nanomolar in PBS en Far Red cell dye tot 200 nanomolar in PBS. Label de rootletine eGFP-cellen met de verdunde Violet-celkleurstof en de rootletine-mScarletcellen met de verdunde Far Red-celkleurstof gedurende één minuut bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubaties, stop de reacties met 10 milliliter DMEM gedurende vijf minuten. Was beide gelabelde celculturen en een niet-gelabelde ouderlijke celcultuur met 10 milliliter verse PBS voordat alle culturen worden uitbroeden met één milliliter voorverwarmde trypsine. Breng aan het einde van de incubatie de losgemaakte celoplossingen over op afzonderlijke conische buizen van 15 milliliter voor centrifugatie en zet de kleurstof met het label pellets voorzichtig opnieuw op in één milliliter PBS en de niet-gelabelde cellen in één milliliter DMEM.Breng dan alle celmonsters terug naar de celkweek incubator. Voor celfusie experiment, meng 500 microliter van Violet kleurstof gelabeld cellen met 500 microliters van Far Red kleurstof gelabeld cellen in een nieuwe 15 milliliter buis en sediment de resterende ongemengde gelabelde cellen door centrifugatie. Resuspend de pellets in een milliliter verse DMEM en plaats de cellen terug in de couveuse.Verzamel de gemengde cellen door centrifugatie en voeg 700 microliters van 50%1450 PEG op een druppelwijze aan de pellet over een periode van 30 seconden. Voeg na 3,5 minuten bij kamertemperatuur 10 milliliter serumvrije DMEM drop-wise toe over een periode van 30 seconden en plaats de buizen gedurende 10 minuten in de couveuse. Aan het einde van de incubatie, sediment de gemengde cellen door centrifugatie en voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter van volledig medium.Om te verrijken voor de gesmolten celpopulatie door FACS, filter je voorzichtig alle cellen in individuele FACS-buizen door een 70 micrometerzeef en creëer je voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing en dubbeltdiscriminatiepercelen in de cytometersoftware. Voer de niet-gelabelde cellen uit om hun fluorescentieintensiteit op te nemen en poorten te maken om de gesmolten cellen te identificeren. Voer vervolgens de enkele positieve Violet kleurstof gelabeld cellen om te bevestigen dat er geen spillover van Violet signaal in de Far Red kanaal en de enkele positieve Far Red kleurstof gelabeld cellen om te bevestigen dat er geen Far Red signaal in het Violet kanaal.Voer vervolgens kort het fusiemonster uit om te bevestigen dat de gesmolten cellen zichtbaar zijn met deze poorten. Wanneer de sorteerparameters zijn ingesteld, lijnt u de sorteerstroom centraal uit in een acht-goed beeldvormingsschotel met 100 microliters groeimedium en sorteer de dubbele positieve gesmolten cellen rechtstreeks in de schotel. Wanneer alle cellen zijn gesorteerd, plaats het gerecht onmiddellijk in de celkweek incubator voor twee tot 16 uur.Voor immunofluorescente kleuring, eerst vervangen van de celcultuur supernatant met 200 microliters van 4%paraformaldehyde voor een 15-minuten incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de fixatie, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS per wasbeurt voordat u de cellen permeabiliseert in 200 microliters van 0,1% nonionische oppervlakteactieve stoffen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer vervolgens de niet-specifieke binding met 200 microliters van 3%bovine serum albumine in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door etikettering met de antilichamen van belang in 150 microliters van kleuringsbuffer.Na een uur bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in 300 microliter pbs gedurende vijf minuten per wasbeurt. Vervang na de laatste wasbeurt de was met 200 microliter verse PBS. Om beelden van de gesmolten cellen te verwerven, gebruik een geschikte fluorescentiemicroscoop die in staat is vier-kleur beeldvorming en het verzamelen van driedimensionale beelden.De aangewezen gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens stroomcytometrie door fluorescerend signaal op een hoger niveau dan niet-gelabelde controlecellen. De poorten kunnen worden ingesteld voor het sorteren te verrijken voor de dubbele positieve celpopulatie direct in beeldvorming schotels voor verdere microscopische analyse. Fusie induceert een grote herschikking van de cellulaire architectuur door het mengen van twee cellen in één.Heterokaryons worden geïdentificeerd als cellen die beide fluorescerende kleurstof signalen gemengd in een enkele cel zonder tussenliggende plasmamembranen. Bovendien kunnen twee kernen ook zichtbaar zijn in gesmolten cellen door Brightfield imaging. De celstructuur en functie kunnen verder worden onderzocht door het samenvoegen van cellen met meGFP en mScarlet gelabelde eiwitten.Fusie resulteert in een verdubbeling van het centrosome aantal binnen heterokaryons zichtbaar als ten minste vier pericentriolar materiaal foci wanneer de centrosome pericentriolar component NEDD1 fluorescerend wordt getagd. De fusie van cellen met endogene fluorescerend getagd rootletine maakt het mogelijk de cel van oorsprong van elk centrosome te identificeren in een heterokaryon. Dit protocol laat zien hoe differentieel gelabelde cellijnen kunnen worden samengefuseerd en hoe ze hun organellen kunnen beeld geven om hun structuur en functie te begrijpen.Dit robuuste protocol is zowel relatief eenvoudig als relatief goedkoop uit te voeren in vergelijking met vergelijkbare methoden. Deze techniek kan worden gebruikt om een reeks vragen te stellen, zoals hoe organelle fusie geregeld is en hoe de cellen reageren op veranderingen in subcellulair organellenummer.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates a technique of zinc-finger nuclease-based genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs can potentially be differentiated into various cell types, this technology is helpful for in vitro pathological and pharmacological studies in a patient-specific manner.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: A Technique for Modifying Genome in Human Pluripotent Stem Cells by Double-Stranded Homology Dependant Repair Mechanism

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Leer celcelfusie van genoom-bewerkte cellijnen om celstructuur en -functie te verstoren. Fluorescentiemicroscopie volgt organellen terug naar hun oorspronkelijke celtype.

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Meer video's verkennen