Name: Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het zuiveren van prominin-1+ stamcellen uit het postnatale muis cerebellum. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling en ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de Opal lab leden voor hun suggesties. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies 1RO1 NS062051 en 1RO1NS08251 (Opal P)

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) en werden goedgekeurd door de Northwestern University IACUC (Protocol IS00011368).
1. Voorbereiding van oplossingen
<ol><li>Bereid weefseldissociatieoplossing gemaakt van steriele fenolroodbevattende Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met papaïne (100 U/ml), cysteïne (0,2 mg/ml) en DNase (250 U/ml).</li>
	<li>Ter bereiding DNase oplossing verdun 100 mg van het gelyofiliseerde poeder van DNase I (een fles) in 50 mL van H2O. Meng goed en filtreer de voorraadoplossing. Bereid 10 mL stock aliquots. Verdeel een stockbuis in 0,5 mL eenmalig gebruik aliquots. Bewaar deze aliquots voor eenmalig gebruik op -80 °C.</li>
	<li>Bereid magnetische scheidingsreagentia voor door magnetische kolombuffer X voor te bereiden: 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA-oplossing.</li>
	<li>Ter voorbereiding van neurosfeer media, gebruik neurobasal medium met penicilline / streptomycine met L-glutamine en supplement met 2% B27, 20 ng / mL menselijke recombinant epidermale groeifactor (EGF), en 20 ng / mL menselijke recombinant basisfibroblast groeifactor (bFGF).</li>
	<li>Ter voorbereiding van differentiatie media, gebruik neurobasaal medium en supplement met 10 ng/mL gedifferentieerde factor platelet-afgeleide groeifactor (PDGF-AA) of 10 ng/mL leukemie remmende factor (LIF) en 2% B27.</li>
	<li>Gebruik ultra-lage bevestiging 12 goed (3,5 cm2) en 6 goed (9,6 cm2)cultuurplaten.</li>
</ol>2. Dissectie van Cerebellum
<ol><li>Verdoven muispups (P3-P7) met isofluraan en onthoofden met behulp van een chirurgische schaar.</li>
	<li>Spuit de gescheiden kop van de pups met 70% ethanol.</li>
	<li>Breng elk hoofd over in een lege steriele 10 cm kweekschaal. Scheid de huid met behulp van de microdissectie schaar, verwijder dan de schedel door het uitvoeren van de schaar sagittal langs de middellijn.</li>
	<li>Met behulp van #7 tangen, schil de schedel botten beginnen caudally van de hersenstam. Til de hersenen voorzichtig op met behulp van een spatel, houd het cerebellum intact en breng de hersenen over naar een verse steriele schotel van 10,0 cm met 15 mL ijskoude Hanks' Balanced Salt-oplossing (HBSS)-oplossing.</li>
	<li>Plaats de schotel met de hersenen onder een dissectie microscoop. Met behulp van fijne #5 tangen, verwijder de hersenvliezen en grote bloedvaten uit het cerebellum en scheid het cerebellum van de hersenstam met behulp van de spatel.</li>
	<li>Breng het cerebellum over in een centrifugebuis van 15 mL met 5,0 mL ijskoude HBSS-oplossing. Was het cerebellum door 3x te spoelen en te decanteren met 5,0 mL HBSS. LET OP: Elk cerebellum moet in zijn eigen buis worden geplaatst voor verdere verwerking.</li>
</ol>3. Voorbereiding van de celvering
<ol><li>Voeg na de laatste spoeling 5 mL op op papaïne gebaseerde weefseldissociatieoplossing toe (op basis van eerder werk13,18)die is voorverwarmd tot 37 °C. Incubeer het weefsel gedurende 15 min bij 37 °C in een waterbad. Meng de inhoud langzaam door de buis 3x-5x per 3 min om te keren met behulp van een nootmixer of met de hand.</li>
	<li>Bereid een brede diameter (gewone glazen pipet) en smalle diameter Pasteur pipet (brand-gepolijst door verwarming over een Bunsen brander) zoals eerder beschreven19.</li>
	<li>Was het weefsel 3x met 5 mL HBSS-oplossing, waardoor verlies van het weefsel wordt voorkomen terwijl het met de hand decanteren.</li>
	<li>Verwijder de laatste HBSS-wasen en voeg 5 mL DPBS-oplossing met 250 μL DNase-oplossing toe aan het weefsel. Dissocieren het weefsel door 10x-15x te trituratingmet behulp van de brede diameter Pasteur pipet. Voer deze stap voorzichtig uit om de vorming van bellen te voorkomen.</li>
	<li>Incubeer vervolgens de drijfmest gedurende 10 min bij 37 °C in het waterbad, mengen door de buis te omkeren en recht te trekken.</li>
	<li>Gebruik de verminderde diameter Pasteur pipet om de weefselslurry 10x verder te triturate. Als er grote stukken weefsel overblijven, druk dan de weefselstukken voorzichtig tegen de onderkant van de buis met de punt van de pipet en blijf pipetteren totdat de cellen een fijne suspensie bereiken.</li>
	<li>Incubeer het weefsel bij 37 °C gedurende nog eens 10 minuten, waarbij de vorige mengstappen worden herhaald.</li>
</ol>4. Immunolabeling van stamcellen
<ol><li>Plaats de centrifugebuizen op ijs en gebruik ijskoude oplossingen voor de volgende stappen. Zeef de gescheiden cellen door een 40 μm celzeef in een centrifugebuis van 50 mL. Top het filter met 10,0 mL HBSS-oplossing om ervoor te zorgen dat cellen door het gaas in deze extra oplossing.</li>
	<li>Breng de gefilterde cellen over in een verse centrifugebuis van 15 mL en centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aanzuigen en gooi de supernatant volledig weg door voorzichtig een vacuümaspirator te gebruiken.</li>
	<li>De pellet opnieuw opschorten in 160 μL magnetische kolombuffer. Om de eencellige suspensie te verkrijgen voor magnetische etikettering, passeren cellen door een 30 μm nylon gaas om celklonten te verwijderen, die anders kan verstoppen de kolom.</li>
	<li>Voeg 40 μL anti-prominin-1 microbeads toe aan elke 15 mL-buis, meng en broed in een koelkast gedurende 15 min, zodat het antilichaam zich kan binden aan prominin-1-uitdrukkende cellen.</li>
	<li>Was de cellen door 1,0–2,0 mL kolombuffer X toe te voegen en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 min. De supernatant volledig aantezuigen.</li>
	<li>De pellet opnieuw opschorten in kolombuffer X van 1,0 mL. LET OP: Als kleine klonten worden gezien na de resuspensie van pellet met 1,0 mL kolombuffer X, moeten ze zorgvuldig worden verwijderd met behulp van een punt van de Pasteur pipet, anders kunnen deze klonten de magnetische kolom blokkeren tijdens het sorteren van de cel.</li>
</ol>5. Magnetische kolom voorbereiding, celsortering en plating
LET OP: De magnetische scheiding van verschillende genotypevoorwaarden (ziekte versus controle) moet tegelijkertijd worden uitgevoerd, aangezien elke vertraging de neurosfeermorfologie kan beïnvloeden.
<ol><li>Bereid de magnetische kolommen voor door ze op de magnetische standaard te plaatsen die aan het magnetisch veld wordt blootgesteld. Spoel de kolom eenmaal met 500 μL buffer X door buffer aan te brengen die in een te verwijderen centrifugebuis druppelt. LET OP: Bereid voor elk experiment nieuwe magnetische kolombuffer X voor; zo niet, dan zal de stamcelopbrengst laag zijn.</li>
	<li>Breng de gelabelde celsuspensie toe op de kolom. Verzamel de flowthrough met niet-gelabelde cellen die voornamelijk bestaan uit cerebellar neuronale/gliale gemengde cellen in verse 15 mL buizen(figuur 1A).</li>
	<li>Was de kolom 3x met 500 μL buffer X (elke wasbeurt duurt ongeveer 2-4 min). LET OP: Cerebellar neuronale / gliale gemengde cultuur verrijkt met cerebellar korrelige neuronen kan dienen als een nuttig bijproduct van deze zuivering stap.</li>
	<li>Verwijder de kolom uit het magnetisch veld en plaats in een buis van 1,5 mL. Voeg 1,0 mL van cultuur medium (neurosfeer medium) aan de kolom en duw de zuiger in de kolom te spoelen van de cellen gelabeld met prominin-1 kralen in een verse 1,5 mL valk buis.</li>
	<li>Als u de zuiverheid van prominin-1-gelabelde cellen wilt verbeteren, geeft u de geëlute cellen door een tweede kolom volgens stappen 5.1–5.4.</li>
	<li>Tel de cellen met een hemocytometer. De typische opbrengst is 107 cellen per cerebellum. Plaat de cellen op ultra-lage bevestigingsplaten (6 of 12 goed, op basis van de dichtheid die nodig is voor downstream experimenten).</li>
</ol>6. Doorgeven van neurosferen en differentiatie
<ol><li>Plaat de prominin-1-gelabelde stamcellen op ultra-lage gehechtheid 12 goed platen in neurosfeer medium (5.000 cellen / goed).</li>
	<li>Na 7-10 dagen delen de cellen zich om balvormige zwevende neurosferen (primaire neurosferen) op te leveren. LET OP: In dit experiment worden secundaire neurosferen die zich in aantallen uitbreiden gegenereerd voor verder gebruik. Primaire neurosfeer populaties worden niet gebruikt voor deze experimenten, omdat ze kunnen bevatten vervuilende cellen die geen stamceleigenschappen hebben en kunnen samenklonteren met neurosferen.</li>
	<li>Voor het doorgeven, breng de primaire neurosferen samen met de cultuurmedia met behulp van 1,0 mL pipet tips naar een 15 mL steriele centrifuge buis. Pellet de neurosferen door centrifugering op 300 x g voor 5 min en gooi de supernatant.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 5 mL van weefsel dissociatie media die papaïne of 0,05% trypsine oplossing bevat. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min. Resuspendde de cellen in 5 mL van neurosfeermedium en los de cellen mechanisch met behulp van een plastic Pasteur pipet en snuif langzaam op en neer 10x.</li>
	<li>Plaat de cellen (opnieuw) in neurosfeer media zoals eerder beschreven. Na 7-10 dagen in cultuur moet de plaat worden verrijkt met secundaire neurosferen. LET OP: Deze culturen kunnen tot 8x met een goede efficiëntie worden doorgestoid, waarna de neurosfeergrootte kleiner is en wijst op een afname van de proliferatie.</li>
	<li>Tel de cellen op de hemocytometer en plaat het optimale aantal voor toekomstige experimenten op poly-D-lysine gecoate platen (6 of 12 putten).</li>
	<li>Om de stamcellen te onderscheiden, verzamelt neurosferen van de tweede naar de achtste passage door centrifugatie zoals eerder beschreven, behalve differentiatie medium toe te voegen aan de pellet. LET OP: Na 7 dagen in vitro onderscheiden de stamcellen zich in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten, zoals aangetoond door vlekken met de neuronale marker β-III tubulin, astrocytische marker GFAP en oligodendrocytemaker O4.</li>
</ol>

<ol><li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+connections+between+cerebellar+development%2C+behaviour+and+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li>
<li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li>
<li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li>
<li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337(2014).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450(2014).</li>
<li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+paper%3A+the+cerebellum%27s+role+in+movement+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+%22stemness%22+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li>
<li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li>
<li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li>
<li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133%2C+CD15%2C+and+CD24%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li>
<li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li>
<li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li>
<li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li>
<li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li>
<li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin%28%2B%29+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li>
<li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207(2019).</li>
<li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebellum%2C+sensitive+periods%2C+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li>
<li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+down+and+one+to+go%3A+modeling+medulloblastoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li>
</ol>

Er worden geen belangenconflicten gedeclareerd.

Prominin-1-uitdrukkende cerebellar stamcellen wonen in de toekomstige witte stof tijdens de eerste 3 weken van het postnatale leven. Hun proliferatie wordt strak gecontroleerd door de sonische egelroute die door cellen Purkinje wordt gesteund17. Deze stamcellen/voorlopers dragen bij aan later geboren GABAergic interneurons genaamd basket cells en stellate cells. Deze interneurons bevinden zich in de moleculaire laag, waar ze synaps op Purkinje cellen en beeldhouwen PC topografie en functie via GAB...

De cerebellum is al lang erkend als een grote neuronale circuit coördinatie van vrijwillige beweging1. Het ontvangt input van de brede delen van de neuroas, die proprioceptieve informatie van de periferie omvat, om motoroutput te finetunen en beweging te coördineren. Meer recent, het is ook betrokken bij het reguleren van cognitie en emoties door potentieel gebruik van soortgelijke informatie verwerking netwerken2,3,4.
Het volwassen cerebellum bestaat uit een buitenste cerebellar cortex en innerlijke witte stof. Gestrooid binnen deze structuren zijn diepe intracerebellar kernen. Net als bij de rest van het zenuwstelsel, wordt de ontwikkeling van het cerebellum gedreven door de proliferatie van multipotente voorlopercellen (stamcellen) die migreren en differentiëren om deze goed georganiseerde structuur op te leveren. In de vroege ontwikkeling (E10.5–E13.5), een ventriculaire stam niche rond de zich ontwikkelende vierde ventrikel genereert GABAergic neuronen (dat wil zeggen, Purkinje cellen, Lugaro cellen, Golgi cellen) samen met Bergmann glia5,6,7,8.
Later in ontwikkeling (postnatale week één), genereert een tweede stamcelniche in de rhombic lip MATH1- en Nestin-expressing progenitors die aanleiding geven tot excitatory granulaatneuronen9,10,11,12. Onlangs een derde stamcel niche is beschreven13. Deze cellen express prominin-1 (ook bekend als CD133), een membraan-spanning glycoproteïne dat een subset van stamcellen in de darm en hematopoietische systemen14,,15,16definieert . In vivo fate mapping toont aan dat deze stamcellen genereren belangrijke moleculaire laag interneurons (dat wil zeggen, mandcellen en stellate cellen), samen met astrocyten, tijdens de eerste drie postnatale weken. In het verleden was het moeilijk om deze cellen in vitro te bestuderen, omdat eerdere methoden dure en tijdrovende technieken (d.w.z. fluorescentie-geactiveerde celsortering [FACS]) nodig hebben die afhankelijk zijn van prominine-1-kleuring12,13,17. Dit protocol beschrijft een immunomagnetische methode voor de isolatie van deze stamcellen die vervolgens gemakkelijk kan worden gekweekt en gedifferentieerd.

<table><tbody><tr><td>0.05%Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>2 mM EDTA solution</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Anti- Prominin-1 microbeads</td><td>Miltenyi Biote</td><td>130-092-333</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Column MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates ultra - low attachment</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D4513-1VL</td><td>250 U/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040141</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution-HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Promega</td><td>G507A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td><td>Promega</td><td>G502A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Prominin-1</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-1331</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab27952</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>O4</td><td>Millopore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>Platelet- Derived Growth Factor</td><td>Sigma</td><td>H8291</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin, b-III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Rabit anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Separation columns-MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &mu;m</td></tr></tbody></table>

zuivering van prominin-1+ stamcellen van postnatale muis cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

De meeste cerebellar neuronen ontstaan uit twee embryonale stam niches: een rhombic lip niche, die alle cerebellar excitatory glutamatergic neuronen genereert, en een ventriculaire zone niche, die de remmende GABAergic Purkinje cellen genereert, die neuronen die de diepe cerebellar kernen en Bergman glia vormen genereert. Onlangs is een derde stamcelniche beschreven die ontstaat als een secundaire kiemzone uit de ventriculaire zone niche. De cellen van deze niche worden gedefinieerd door de celoppervlak marker prominin-1 en zijn gelokaliseerd op de zich ontwikkelende witte stof van de postnatale cerebellum. Deze niche is goed voor de laat geboren moleculaire laag GABAergic interneurons samen met postnataal gegenereerde cerebellar astrocyten. Naast hun ontwikkelingsrol wint deze niche translationeel belang met betrekking tot zijn betrokkenheid bij neurodegeneratie en tumorigenese. De biologie van deze cellen is moeilijk te ontcijferen vanwege een gebrek aan efficiënte technieken voor hun zuivering. Hier gedemonstreerd zijn efficiënte methoden om te zuiveren, cultuur, en onderscheiden van deze postnatale cerebellar stamcellen.

Prominin-1-positieve postnatale cerebellar stamcellen gevormd neurosferen in neurosfeer medium rijk aan groeifactoren (EGF en bFGF). Deze neurosferen waren positief voor prominin-1-kleuring, de marker gebruikt voor isolatie, en ook als een vlek voor andere stamcelmarkers zoals Nestin en GFAP13 (Figuur 1). De stamcel marker expressie werd gehandhaafd in de hele cultuur en voor maximaal acht passages20. Bij intrekking van groeifactoren en in aanw...

Hier gedemonstreerd is een efficiënte en kosteneffectieve methode om witte stof stamcellen te zuiveren, te kweken en te onderscheiden van postnatale muiscerebellum.

Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om stamcellen uit het postnatale cerebellum te zuiveren. Deze stamcellen zijn verantwoordelijk voor de laatgeboren moleculair onleesbaar gemaakte geïnterneerde onderwijzers, maar ze zijn ook verantwoordelijk voor postnatally-afgeleide cerebellar astrocyten. Het bestuderen van deze cellen is dus duidelijk belangrijk voor het begrijpen van de ontwikkeling van het cerebellum.Met behulp van dit protocol is de opbrengst van stamcel vergelijkbaar met die van facs-gebaseerde strategie die meestal 10 keer duurder is. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd om prominine-1 uitdrukken stamcellen uit andere weefsels zoals darm en beenmerg te extraheren. Begin met het plaatsen van de schotel met de hersenen onder een dissectie microscoop.Gebruik fijne nummer vijf tangen om de hersenvliezen en grote bloedvaten uit het cerebellum te verwijderen en vervolgens het cerebellum van de hersenstam te scheiden met behulp van de spatel. Breng het cerebellum over in een 15 milliliter centrifugebuis met vijf milliliter ijskoude HBSS-oplossing. Spoel het af en decanteer de HBSS.Herhaal de was nog twee keer. Voeg na de laatste spoeling vijf mi

purification-of-prominin-1-stem-cells-from-postnatal-mouse-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.

Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

This video demonstrates the isolation and cultivation of cerebellar neural progenitor cells from a mouse pup's cerebellum. Cerebellar granule neuron progenitors are isolated and purified through differential adhesion, effectively removing astrocytes. These cultured progenitors subsequently differentiate into cerebellar granule neurons.

Isolating and Culturing Murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors

This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.

Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Leer een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het zuiveren van prominin-1+ stamcellen uit het postnatale muis cerebellum. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling en ziekten.

Zuivering van Prominin-1⁺ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum

Meer video's verkennen