Name: Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer celcyclusanalyse met massacytometrie en IdU-markering voor kankeronderzoek bij acute myeloïde leukemie. Deze eenvoudige methode helpt onderzoekers celproliferatie op enkelcellig niveau te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de inspanningen van Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang en Justin Lyeberger bedanken voor hun experimentele steun. Dit werk werd ondersteund door het Pelotonia Fellowship Program. Alle meningen, bevindingen en conclusies die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteur (s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs die van het Pelotonia Fellowship-programma. "

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Dr. Behbehani ontvangt reisondersteuning van Fluidigm. Fluidigm heeft ook reagentia en materialen gekocht voor laboratoriumgebruik.

De hier gepresenteerde voorbeelden laten zien hoe u een MCM-platform kunt gebruiken om de distributie van de celcyclus te analyseren. Het is ook aangetoond dat celcyclusanalyse gevoelig is voor experimentele omstandigheden zoals tijd en temperatuur, wat een belangrijke overweging is die onderzoekers moeten nemen bij het overwegen van MCM voor hun celcyclusanalyse14. Monsters die gedurende een korte periode in opslag worden achtergelaten, niet langer dan een uur, hebben een IdU-opname die vergelijk...

Massacytometrie maakt detectie van ongeveer 40 parameters mogelijk door gebruik te maken van de hoge resolutie en kwantitatieve aard van massaspectroscopie. Metaalgelabelde antilichamen worden gebruikt in plaats van fluorofoor geconjugeerde antilichamen die een groter aantal kanalen mogelijk maken en minimale spillover produceren 1,2. MCM heeft voor- en nadelen met betrekking tot celcyclusanalyse in vergelijking met flowcytometrie. Een groot voordeel van MCM is dat het grote aantal parameters de gelijktijdige meting van de celcyclustoestand mogelijk maakt over een groot aantal immunofenotypisch verschillende T-celtypen in zeer heterogene monsters. MCM is met succes gebruikt om de celcyclustoestand te meten tijdens normale hematopoëse in humaan beenmerg3 en transgene muizenmodellen van telomerasedeficiëntie4. Analyse van de celcyclustoestand bij acute myeloïde leukemie (AML) toonde aan dat de celcyclus correleerde met bekende reacties op klinische therapieën, wat een in vivo inzicht gaf in functionele kenmerken die therapieselecties kunnen informeren5. Een tweede voordeel van massacytometrische celcyclusanalyse is de mogelijkheid om een groot aantal andere functionele markers te meten die kunnen worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. Recent werk is in staat geweest om eiwit- en RNA-synthese te correleren met de celcyclustoestand door het gebruik van IdU en metaalgelabelde antilichamen tegen BRU en rRNA6. Dit soort zeer parametrische analyse die de celcyclustoestand meet over talrijke populaties in een continuüm van differentiatie zou bijna onmogelijk zijn met de huidige flowcytometrietechnologie. Het grote nadeel van MCM is het ontbreken van vergelijkbare DNA- of RNA-vlekken als die worden gebruikt in fluorescerende flowcytometrie (bijv. DAPI, Hoechst, Pyronine Y, enz.). Fluorescerende kleurstoffen kunnen relatief nauwkeurige metingen van DNA- en RNA-gehalte geven, maar deze precisie is alleen mogelijk vanwege de veranderingen in de fluorescerende eigenschappen van deze kleurstoffen die optreden bij intercalatie tussen nucleotidebasen. MCM-analyse is dus niet in staat om DNA- of RNA-inhoud met vergelijkbare precisie te meten. In plaats daarvan is massacytometrische celcyclusanalyse gebaseerd op metingen van eiwitten die verband houden met de celcyclustoestand, zoals cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3) in combinatie met directe meting van het jodiumatoom van IdU-opname in S-fasecellen. Deze twee meetbenaderingen leveren zeer vergelijkbare resultaten op tijdens normale cellulaire proliferatie, maar kunnen mogelijk dissonant zijn wanneer de progressie van de celcyclus wordt verstoord.
Meting van het aantal cellen in elke celcyclusfase is belangrijk voor het begrijpen van de normale ontwikkeling van de celcyclus en de verstoring van de celcyclus, die vaak wordt waargenomen bij kankers en immunologische ziekten. MCM biedt betrouwbare meting van extracellulaire en intracellulaire factoren met behulp van metaalgelabelde antilichamen; de meting van de S-fase was echter beperkt omdat de op iridium gebaseerde DNA-intercalator geen onderscheid kon maken tussen 2N- en 4N-DNA. Om celcyclusfasen te definiëren, ontwikkelde Behbehani een methode die IdU gebruikt met een massa van 127, die binnen het bereik van de massacytometer valt en directe meting van cellen in S-fase3 mogelijk maakt. Deze directe meting omzeilt de noodzaak van secundaire antilichamen of het gebruik van DNA-denatureringsmiddelen zoals zuur of DNase. In combinatie met intracellulaire cyclusmarkers maakt het een hoge resolutie van celcyclusverdeling in experimentele modellen mogelijk.
Dit protocol past celcyclusmetingen aan van gangbare flowcytometrieprotocollen voor MCM. Onze methoden bieden een handige en eenvoudige manier om celcyclusparameters op te nemen. IdU-opname van in vitro monsters vereist slechts 10 tot 15 minuten incubatie bij 37 °C, wat korter is dan de meeste BrdU-kleuringsprotocollen die incubatietijden van enkele uren aanbevelen 3,7. IdU- en BrdU-geïncorporeerde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van een proteomische stabilisator en vervolgens enige tijd worden bewaard in een vriezer van -80 °C. Hierdoor kunnen grote aantallen IdU-gekleurde monsters worden gearchiveerd voor batchanalyse zonder dat de monsterkwaliteit wordt verminderd.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Component van CSM</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Samplen centrifugeren</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identificatie van apoptotische cellen</td></tr><tr><td>Cyclin B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Resolutie</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Cryopreservatief</td></tr><tr><td>EQ Four Element Calibration Beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Interne metaalstandaard voor CyTOF-prestaties</td></tr><tr><td>FACS Tube met gaas zeef</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Celzeef om klonten/debris te verwijderen voor CyTOF-run</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Celcultuur groeisupplement</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF Systeem/Platform</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Kleuradditief om niet-specifieke kleuring te voorkomen</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2’-deoxyuridine)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Incorporeert in S-fase</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Bevestiging van G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Metaallabeling kit, bevestigt metalen aan antilichamen</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Mengen van monsters tijdens kleuring</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>Fixeermiddel</td></tr><tr><td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Celidentificatie tijdens CyTOF-acquisitie</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Detectie van DNA-schade</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M-fase Resolutie</td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferde Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Wasoplossing voor celcultuur en component van fixeeroplossing</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 Resolutie</td></tr><tr><td>Proteomic Stabilizer</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Stabilisator voor monsters</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Celcultuur groeimedium</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>Component van CSM/Antilichaam buffer, biocide</td></tr></tbody></table>

gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (idu) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

De regulatie van de celcyclusfase is een belangrijk aspect van cellulaire proliferatie en homeostase. Verstoring van de regulerende mechanismen die de celcyclus regelen, is een kenmerk van een aantal ziekten, waaronder kanker. Studie van de celcyclus vereist het vermogen om het aantal cellen in elk deel van de celcyclusprogressie te definiëren en om duidelijk af te bakenen tussen elke celcyclusfase. De komst van massacytometrie (MCM) biedt een enorm potentieel voor single cell-analyse met hoge doorvoer door directe metingen van elementaire isotopen, en de ontwikkeling van een methode om de celcyclustoestand door MCM te meten, breidt het nut van MCM verder uit. Hier beschrijven we een methode die direct 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) meet, vergelijkbaar met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), in een MCM-systeem. Het gebruik van deze op IdU gebaseerde MCM biedt verschillende voordelen. Ten eerste wordt IdU snel opgenomen in DNA tijdens de synthese, waardoor betrouwbare metingen van cellen in de S-fase mogelijk zijn met incubaties zo kort als 10-15 minuten. Ten tweede wordt IdU gemeten zonder de noodzaak van secundaire antilichamen of de noodzaak van DNA-afbraak. Ten derde kan IdU-kleuring gemakkelijk worden gecombineerd met meting van cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3), dat gezamenlijk een duidelijke afbakening van de vijf celcyclusfasen biedt. De combinatie van deze celcyclusmarkers met het grote aantal parameters dat mogelijk is met MCM maakt combinatie met tal van andere statistieken mogelijk.

Met behulp van HL-60-cellen en een menselijk beenmergaspiraat is het mogelijk om te laten zien hoe experimentele omstandigheden de distributie en analyse van de celcyclus kunnen beïnvloeden. Ten eerste moet de gating-strategie worden vastgesteld om aan te tonen hoe de celcyclusfasen worden afgeleid. In figuur 1 tonen we de oprichting van de singletpoort, die belangrijk is bij het scheiden van cellulair puin en doubletten, waardoor een enkele celpopulatie ontstaat. Voor cellijnen is de single...

Dit protocol past celcyclusmetingen aan voor gebruik in een massacytometrieplatform. Met de multiparametermogelijkheden van massacytometrie maakt directe meting van jodiumopname identificatie van cellen in S-fase mogelijk, terwijl intracellulaire cyclusmarkers karakterisering van elke celcyclustoestand in een reeks experimentele omstandigheden mogelijk maken.

Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Dit protocol stelt ons in staat om de celcyclus op het niveau van één cel te onderzoeken met behulp van de massacytometer, en dit maakt het mogelijk om verschillende nieuwe onderzoeken en klinische studies uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud. IdU wordt direct aan de cellen toegevoegd en er is geen verdere behandeling of antilichamen nodig.We hebben deze techniek gebruikt om de celcyclustoestand te onderzoeken bij patiënten met acute myeloïde leukemie in de stam- en voorlopercelcompartimenten. En dit toonde aan dat de celcycluseigenschappen van deze specifieke celtypen kunnen correleren met de klinische uitkomst van patiënten met deze ziekten. Deze techniek kan nuttig zijn voor het begrijpen van groei-eigenschappen van zeldzame kankercellen en het begrijpen van de proliferatie van immuuncelsubsets.Voor en na het toevoegen van IdU aan de celmonsters, houdt u de cellen in de groeiomstandigheden van belang. In dit geval, een bevochtigde 37 graden Celsius incubator bij 5% CO2 om de cellen te labelen met IdU, verdun de geconcentreerde IdU-stamoplossing één tot 50 in de groeimedia van de cellen. Breng vervolgens de monsters over in een bioveiligheidskap en voeg 10 microliter van één millimolar IdU toe aan elke milliliter cellen.Breng de cellen gedurende 10 tot 15 minuten terug naar de incubator voordat u de monsters overbrengt naar afzonderlijke conische buizen. Verzamel de cellen door centrifugeren in conische buizen van 15 milliliter en resuspensie van de pellets in 200 microliter PBS per buis. Label indien nodig de cellen met een geschikte levende / dode kleuring om de dode cellen te markeren.Na levende / dode kleur, doofde de cellen met media gewassen met CSM voordat de cellen werden gefixeerd met 25 microliter 16% paraformaldehyde. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur verzamelt u de cellen door centrifugeren. Voeg vijf tot 15 milliliter CSM toe en centrifugeer opnieuw.Resuspendeer de pellets in 500 microliter celkleuringsmedium aangevuld met 10% dimethylsulfoxide. Breng de cellen vervolgens over in kleinere buisjes om ze op te slaan in negatieve 80 graden Celsius. Om de voor hun celcyclusanalyse te normaliseren, importeert u de bestanden in een geschikt softwareprogramma voor flowcytometrie-analyse en maakt u een biaxiale plot van de gebeurtenislengte versus 191 iridium.De cellen zullen een duidelijke heldere iridium hoge populatie vormen. Wijzig de lengteschaal van de gebeurtenis om de cellen prominenter weer te geven. Maak vervolgens een singletpoort om 50 tot 60% van de doubletten en puin uit te sluiten en stel de resterende en offset Gaussische parameters in om eventuele resterende doubletten en puin te verwijderen.Om de S-fase gate in te stellen, maakt u een biaxiale plot van IdU versus een proliferatiemarker. De S-fase IdU-positieve cellen zullen een aparte populatie vormen. Voor G0/G1 en G2/M gating zet je de poorten op een IdU versus Cyclin B1 plot.De G0/G1-fase is cycline B1 laag, IdU negatief en de G2/M-fase is cycline B1 hoog, IdU negatief. Om voor specifieke celtypen te gaan, plot u alleen de S-fasecellen op de Cycline B1 versus IdU-grafiek om de scheiding tussen G0/G1-fase en G2/M-fasecellen vast te stellen. Teken een poort rond de Cyclin B1 hoge populatie.In sommige gevallen kan dit moeilijk te onderscheiden zijn, maar het niveau van cycline B1 van ongeveer de top 5% van de S-fase populatie is meestal het breekpunt tussen de G0 / G1 en G2 / M fase poorten. De cellen die zich binnen de vorige poort bevinden, zullen de G2 / M-fasepopulatie zijn, terwijl de rest de G0 / G1-fasepopulatie zal zijn. Om de G0-fasepopulatie vast te stellen, maakt u een gefosforyleerd retinoblastoomeiwit versus IdU-plot.De G0-fase zal worden vertegenwoordigd door een gefosforyleerd retinoblastoomeiwit met een laag, IdU-negatieve populatie. Aangezien de actieve fietsende populatie een hoog gefosforyleerd retinoblastoomeiwit en IdU-opname zal vertonen, kan de G0-fasepoort op deze grens worden getrokken, omdat deze zich meestal uitdrukt bij twee verschillende populaties. Als de G0-poort moeilijk te definiëren is, maak dan van de S-fase populatie de actieve populatie en teken een poort met de top 90 tot 100% van de gefosforyleerde retinoblastoom eiwit hoge populatie.De gefosforyleerde retinoblastoomeiwit lage populatie buiten de poort is meestal de G0-populatie, terwijl de G0 / G1-cellen met pRb-niveaus die in deze poort vallen G1-cellen zijn. Voor M-fase gating, maak een IdU versus gefosforyleerde histon H3 door axiale plot. De M-fase fase zal worden waargenomen als de zeer kleine fractie van cellen binnen de gefosforyleerde histon H3-populatie.De cellen in de G2/M-populatie met lagere niveaus van pHH3 zijn de G2-cellen. Als IdU-opname mislukte of niet mogelijk was, definieer dan de cyclische en niet-fietsende celfracties met behulp van Ki67 en gefosforyleerd retinoblastoomeiwit. De dubbel positieve populatie vertegenwoordigt de actieve fietspopulatie die correleert met de G1-, S-, G2- en M-fasen.De dubbele lage populatie zal de niet-fietsende populatie vertegenwoordigen die correleert met de G0-fase. Zodra alle poorten zijn ingesteld, exporteert u de numerieke waarden van de poorten. De percentages in elke cyclus kunnen worden bereikt door de afzonderlijke populaties af te trekken van de gecombineerde populaties om numerieke waarden voor elke individuele celcyclusfase te genereren voor latere grafieken en statistische analyse.De oprichting van de singletpoort is belangrijk voor het scheiden van het cellulaire puin en doubletten om isolatie van de eencellige populatie mogelijk te maken. Vervolgens kan celcyclusanalyse van de afzonderlijke cellen worden uitgevoerd. IdU-etikettering en dus downstream celcyclusanalyse kunnen aanzienlijk worden beïnvloed door tijd en temperatuur.Cellen die bijvoorbeeld te lang in gesloten vaten of in transport tussen locaties blijven, zullen verminderde S-fasefracties hebben en dat zal niet nauwkeurig zijn voor celcyclusanalyse. Celmonsters die gedurende korte perioden van een uur of minder worden vastgehouden, vertonen nog steeds een normale celcyclusverdeling, wat aangeeft dat een snel transport de analyse mogelijk niet negatief beïnvloedt. Gecryopreserveerde cellen kunnen een lange evenwichtsperiode vereisen voordat de cellen terugkeren naar actieve celcycli, wat mogelijk nog steeds niet de toestand van de pre-cryopreservatiecelcyclus weerspiegelt.Verschillende celtypen kunnen ook differentieel worden beïnvloed door onderhoudsomstandigheden. In dit menselijke beenmergmonster vertoonden de T-cellen bijvoorbeeld een vermindering van het aantal cellen in vergelijking met monoblasten uit hetzelfde monster. Een ander voordeel van massacytometrie is het vermogen om cellen te onderscheiden in celcyclusstilstand of die een abnormale celcyclusverdeling hebben.Een groot voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk compatibel is met andere massacytometriemetingen zoals oppervlaktefenotypering, chromatinestructuur, intracellulair cytokinestimmeren, wat kan worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. We hebben deze techniek gebruikt om uitputting van immuuncellen en senescentie te bestuderen en om aan te tonen dat de respons op chemotherapie bij patiënten met acute leukemie kan correleren met de celcycluseigenschappen van de leukemiecellen.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We hebben afgeleid van een strategie om sequentiële opname van thymidine-analogen (CldU en IDU) op te sporen in de weefsels van volwassen muizen om twee opeenvolgende rondes van celdeling te kwantificeren. Deze strategie is nuttig om de celvernieuwing van de langlevende weefsels, oncogene transformatie, of transit-amplificerende cellen te detecteren.

Immunofluorescentie detectie van twee thymidine-analogen (CldU en IDU) in het jeugdwerk Tissue

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

This video describes the protocol for BrdU immunofluorescence staining. The technique allows the identification of cells in different phases of cell cycle. Addition of DNA dyes and antibody labeling allows the detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

BrdU Immunofluorescence Staining: A Technique to Identify Cells in Different Phases of Cell Cycle

The video demonstrates an immunofluorescence-based approach for quantifying replication stress in cancer cells. Hydroxyurea-treated cells produce single-stranded DNA, detected through immunofluorescence. The count of green fluorescence foci indicates the level of replication stress in cancer cells.

An Immunofluorescence-Based Method to Quantify Replication Stress in Cancer Cells

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

Leer celcyclusanalyse met massacytometrie en IdU-markering voor kankeronderzoek bij acute myeloïde leukemie. Deze eenvoudige methode helpt onderzoekers celproliferatie op enkelcellig niveau te bestuderen.

Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform (Video) | JoVE Journal

Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

Meer video's verkennen