Name: Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer een eenvoudige primaire celcultuurmethode voor darmcellen van Apostichopus japonicus. Dit protocol ondersteunt langdurige kweek van mariene ongewervelden voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Prof. Naiming Zhou van de Zhejiang University bedanken voor zijn technisch advies en voor het beschikbaar stellen van de apparatuur van zijn laboratorium voor gebruik. Dit werk werd financieel gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummers 41876154, 41606150 en 41406137) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de Zhejiang provinciale universiteiten en onderzoeksinstituten [subsidie nummer 2019JZ00007 ].

1. medium bereiding voor celkweek
<ol><li>
Coelomic vloeistof voorbereiding
	<ol>
<li>
Coelomic Fluid collectie: Onder steriele omstandigheden, ontleden een gezonde zeekomkommer (nat gewicht van 85-105 g), verzamel coelomic vloeistof, en bewaar het in een steriele glazen kolf.</li>
		<li>
Coelomic celverwijdering: Centrifugeer de coelomic vloeistof in 50 mL centrifugebuizen bij 1.700 x g gedurende 5 minuten en breng het supernatant over in een nieuwe steriele glazen kolf; vervolgens, het verzamelen van de cel-vrije coelomic vloeistof van de zee komkommer.</li>
		<li>
Complement componenten inactivatie: Inbroed de steriele glazen kolf, die de zeekomkommer coelomic vloeistof bevat, in een waterbad van 40 – 50 °C gedurende 20 – 40 minuten om complement componenten te verkrijgen-geïnactiveerde coelomic vloeistof.</li>
		<li>
Microbe verwijdering: Verwijder bacteriën en Chlamydia door filtratie door middel van 0,22 μm membraanfilters. Verwijder vervolgens mycoplasma en andere fijne deeltjes door filtratie met behulp van 0,1 μm membraanfilters om coelomic vloeistof voorbehandelings oplossing te verkrijgen.</li>
		<li>
Aanpassing zoutgehalte: Pas het zoutgehalte van de coelomic vloeistof voorbehandelings oplossing aan op 30‰ (gemeten met Salinometer) door toevoeging van 20% hoge concentratie voorgesteriliseerde en gefilterde NaCl-oplossing (verdund met voorbehandelde coelomic vloeistof) of DDW (dubbel gedestilleerd water). Breng de zeekomkommer coelomic Fluid over in een steriele fles, sluit de fles af en bewaar de vloeistof bij 4 °C voor verdere experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leibovita's L-15 celcultuur medium optimalisatie
	<ol>
<li>Weeg 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g CaCl2, 0,25 g van na2, dus4, 0,975 g mgCl2, 0,25 g glucose, en 6,25 mg taurine en Verdun ze in 40 ml leibovito's L-15 medium in een 50 ml steriele centrifugebuis. Agitate de buis op een shaker voor 1 h om ervoor te zorgen dat de zouten volledig zijn opgelost.</li>
		<li>Voeg 2,5 mL L-glutamine (100 mg/mL) en 500 μL VE oplossing (1,75 mg/L) toe aan eerder voorbereide Leibovita's L-15 medium en filtreer het medium verder door middel van 0,22 μm membraanfilters.</li>
		<li>Stel het totale medium volume in op 500 mL met verse Leibovita's L-15 medium en met 100 mL eerder bereide coelomic vloeistof; Stel vervolgens de pH in op 7,6 met NaOH-oplossing. Houd het bedrijfsproces in een steriele omgeving. De compounding ratio van coelomic vloeistof kan 10% – 50% zijn, en 20% is voldoende voor een. japonicus darmcellen cultuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de intestinale cel
<ol><li>
Zee komkommer darm verwerking
	<ol>
<li>Verdoving gezonde zeekomkommers in een ijsbak. Dissect en verzamelen van de voorste darmen, vervolgens sectie de weefselmonsters verticaal en verwijder de binnenste inhoud.</li>
		<li>Was de weefselmonsters tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en desinfecteer ze door onderdompeling in een waterige ethanol vloeistof (75% van het volume) voor niet meer dan 2 sec.</li>
		<li>Was de weefselmonsters in PBS driemaal om ethanol te verwijderen en breng ongeveer 100 mg weefselmonster over in een steriele micro centrifugebuis van 2,0 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cell Collection
	<ol>
<li>Voeg 1,5 mL van het voorgeoptimaliseerde kweekmedium toe aan de zee komkommer darmweefsel blok en gehakt het blok met gesteriliseerde chirurgische schaar totdat de oplossing troebel is. Opmerking: voor optioneel vereenvoudigd protocol, Voeg 0,5 mL vooraf geoptimaliseerde kweekmedium toe aan de zee komkommer intestinale weefsel blok en snijd het blok met gesteriliseerde chirurgische schaar in 1 mm3. Breng de monsters rechtstreeks over naar kweek gerechten gevolgd door daaropvolgende incuberende stappen.</li>
		<li>Voeg 400 μL trypsine (0,25%), meng de oplossing door inversie, en incuberen het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur; vervolgens filtert u de oplossing met een celzeef van 100 μm. Opmerking: het is optioneel om trypsine toe te voegen voor celdispersie bij de behandeling van verschillende weefselmonsters. Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) moet in trypsine-oplossing worden opgenomen om de remmende werking van CA2 + en mg2 + in kweekmedium te verminderen.</li>
		<li>Vang het filtraat op in een nieuwe steriele 2,0 mL micro centrifugebuis, centrifugeer bij 1.700 x g gedurende 3 minuten, gooi het supernatant weg, laat de pellet in kweekmedium (aangevuld met antibiotica) en was het tweemaal. Opmerking: bereid vers voorgeoptimaliseerd kweekmedium, aangevuld met 2% penicillaire-streptomycine oplossing (10.000 U/mL penicillaire en 10 mg/mL streptomycine) en 1% gentamicine (4 mg/mL) vóór het begin van het experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. celcultuur
<ol><li>
Presetting van de incubator: PRESET de incubator voor celkweek en voer deze op voorhand uit gedurende ten minste 24 uur met een temperatuur van 18 °C en een verzadigde luchtvochtigheid. Opmerking: Voer CO2 in de incubator afhankelijk van de celkweekmedium eigenschappen; Er moet geen CO2 worden geleverd bij gebruik van het basismedium van Leibovito's L-15.</li>
	<li>
Eerste fase celcultuur
	<ol>
<li>Voor de remming van de groei van microben en ter bevordering van de proliferatie tijdens de eerste fase van de celcultuur, voeg 10 mL penicillaire-streptomycine oplossing (10.000 U/mL penicillaire en 10 mg/mL streptomycine) en 0,5 mL gentamicine (40 mg/mL) in elke 500 mL vooraf geoptimaliseerde kweekmedium. Bovendien wordt elke kweekmedium van 500 mL aangevuld met 0,6 mL insuline (10 mg/mL), 100 μL insuline-achtige groeifactor (0,1 μg/μL) en 25 μL fibroblast-groeifactor (0,1 μg/μL).</li>
		<li>Verzamel de cellen in buizen van 1,5 mL, hervat ze met 200 μL aangegeven medium en pipet ze in φ 4 cm gerechten.</li>
		<li>Kweek de cellen in een incubator en voeg 2,0 mL aangegeven medium toe aan de celkweek gerechten na 6 h. Verander de helft van het medium om de 12 uur totdat de volgende fase is bereikt. Opmerking: Behandel de medium verandering zachtjes, omdat de cellen niet strak aan de gerechten zijn bevestigd. Poly-D-Lysine-gecoate gerechten kunnen worden gebruikt voor losjes te hechten aan de schotel cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tweede fase celcultuur
	<ol>
<li>Om de nadelige effecten van antibiotica op de gekweekte cellen te verminderen, verminderen van de concentratie van geïndiceerd antibiotica (penicillair, streptomycine, en gentamicin) in het cultuurmedium door de helft. Opmerking: het gebruik van insuline en groeifactoren is afhankelijk van de celkweek omstandigheden en is optioneel.</li>
		<li>Het celkweekmedium vervangen; Voer middelgrote veranderingen elke twee tot drie dagen, afhankelijk van de celdichtheid. Opmerking: observeer de gekweekte cellen dagelijks onder een microscoop en noteer de groeiomstandigheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celpassaging Opmerking: doorgang en subcultuur de cellen, wanneer de primaire celdichtheid 60% bereikt.<ol>
<li>Was de gekweekte cellen tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Voeg 200 μL trypsine-oplossing (0,25%) aan elk gerecht en handmatig schudden het gerecht ervoor te zorgen dat de hele bodem is bedekt. Gooi de trypsine-oplossing weg en inbroed de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de cellen met 1,0 mL vers kweekmedium door pipetten en de cellen opnieuw op te schorten. Breng 0,5 mL celsuspensie over naar een nieuw schaaltje, voeg 1,5 mL vers medium toe en inincuberen de cellen bij 18 °C. Opmerking: celscrapers kunnen worden gebruikt voor celverzameling wanneer de trypsine-oplossing niet in staat is om cellen te verteren en los te maken van de gerechten (sommige cellijnen zijn te lijm). Voer beide methoden echter niet tegelijkertijd uit.</li>
		<li>Verander het medium na 12 uur en observeer de cellen onder een microscoop om de omstandigheden te evalueren. Kweek de cellen voor verdere experimentele testen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inductie en detectie van Apoptosis in een. japonicus darmcellen
<ol><li>
Celkweek en behandeling met dexamethason
	<ol>
<li>Maak de intestinale cellen na het eerder geïntroduceerde protocol en voeg de cellen druppelsgewijs toe aan een 12-put plaat bij een celvolume van 2 x 106 per put.</li>
		<li>Na drie dagen in cultuur, na de stappen van de "eerste fase celcultuur", was de cellen drie keer met PBS en vervang het medium door een geoptimaliseerd medium (zonder antibiotica en groeifactoren).</li>
		<li>Verdun dexamethason (DXMS) in kweekmedium om verse 2 μM en 200 μM DXMS-oplossingen te bereiden voordat u begint met de experimenten.</li>
		<li>Voeg dxms-oplossingen in verschillende concentraties toe aan gekweekte cellen die zijn geteeld met hetzelfde volume van het kweekmedium; Stel drie experimentele groepen in, waaronder Control (CTL), 1 μM en 100 μM DXMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hoechst kleuring 
	<ol>
<li>Was de cellen driemaal na incubatie met/zonder DXMS voor de aangegeven tijdsperioden (0 uur, 24 uur en 48 uur).</li>
		<li>Voeg 300 μL Hoechst 33258 oplossing per put toe aan een 12-put plaat en inincuberen bij 18 °C gedurende 30 min. schud de plaat zachtjes om alle cellen te bedekken die hun kleuring garanderen.</li>
		<li>Verwijder de Hoechst-kleurings oplossing en bevestig de cellen door aan elk goed 300 μL van een 4% Paraformaldehyde-oplossing (in PBS) toe te voegen. Zachtjes te agiteren gedurende 15 minuten. Let op: Paraformaldehyde is matig toxisch bij aanraking van de huid of inademing, en is aangewezen als een waarschijnlijke carcinogene stof voor de mens. Bij het wegen en hanteren van Paraformaldehyde moeten chemische rook afzuigkappen, behuizingen voor geventileerde balans of andere beschermende maatregelen worden gebruikt.</li>
		<li>Was de vaste cellen drie keer in PBS. Gooi de PBS na het wassen niet weg om de cellen bedekt te houden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluorescerende microscopie analyse
	<ol>
<li>Schakel de fluorescerende Microscoop hardware in, inclusief de Mercury Lamp Power, fluorescentielicht stroom en PC. Meld u aan bij de account van het besturingssysteem, start de software en controleer de configuratie.</li>
		<li>Plaats de bereide plaat op de Microscoop. Plaats het monster op de objectief lens met behulp van de stage-controller.</li>
		<li>Vind de cellen van belang onder de lichtmicroscoop, overschakelen naar fluorescerende microscopie, en leg de beelden door het afstemmen van de parameters. Opmerking: om de Hoechst 33258 fluorescerende signaal gebonden aan kernen DNA te observeren, moet fluorescentiemicroscopie worden uitgevoerd met excitatie en emissie bij ongeveer 352 nm en 461 nm, respectievelijk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn uitgebreide onderzoeksinspanningen gewijd aan het tot stand brengen van cellijnen in de afgelopen decennia, maar het is nog steeds moeilijk om een vooruitgang te maken op lange termijn cultuur van cellen van mariene ongewervelde14,22. Er is gemeld dat gekweekte cellen van het regenereren van holothurian weefsels levensvatbaar voor een lange periode van tijd zijn en hoge activiteit van proliferatie kan worden gedetecteerd in specifieke cellen<sup class="xr...

Het kweken van cellen onder kunstmatig gecontroleerde omstandigheden, en niet in hun natuurlijke omgeving, biedt uniforme experimentele materialen voor biologische studies, vooral voor soorten die niet gemakkelijk kunnen worden gekweekt in een laboratoriumomgeving. Mariene ongewervelde dieren zijn meer dan 30% van alle diersoorten1en bieden talrijke biologische materialen voor onderzoek naar de regelgevings mechanismen van specifieke biologische processen, zoals regeneratie2,3, stress response4en aanpassing aan de milieu-adaptatie5,6.
De zeekomkommer, apostichopus japonicus, is een van de meest bestudeerde stekelhuidigen soorten die in gematigde wateren langs de Noord-Pacifische kust wonen. Het is bekend als een commercieel belangrijke soort en mariculit op grote schaal in Oost-Azië, met name in China7. Tal van wetenschappelijke vragen met betrekking tot A. japonicus, met inbegrip van de regelgevende mechanismen onderliggende intestinale regeneratie na ontbranding8 en degeneratie in aestivation9, metabole controle10,11, en immuunrespons12,13 onder thermische of pathogene spanningen, hebben de aandacht van onderzoekers aangetrokken. Echter, in vergelijking met goed bestudeerde model dieren, fundamenteel onderzoek, vooral op cellulair niveau, wordt beperkt door technische knelpunten, zoals het ontbreken van geavanceerde celcultuurmethoden.
Onderzoekers hebben veel moeite gedaan om cellijnen vast te stellen, maar ze hebben ook veel uitdagingen ondervonden en er is geen cellijn van een mariene ongewervelde opgericht, maar14. Echter, primaire celculturen van mariene ongewervelde dieren hebben gevorderd in de laatste decennia15,16, en ze hebben een kans voor experimenten op cellulair niveau geboden. Bijvoorbeeld, de regenererende intesine van A. japonicus is gebruikt als een bron van cellen voor lange-termijn celculturen die een praktische methode voor de primaire celcultuur van mariene ongewervelde dieren17. Dit protocol combineerde en geoptimaliseerde ongewervelde celcultuur benadert en ontwikkelde een breed passende primaire kweekmethode voor zeekomkommer of andere ongewervelde zeedieren.
Apoptosis is een intrinsieke cel Suicide programma getriggerd door verschillende exogene en endogene stimuli. Gecoördineerde apoptosis is cruciaal voor veel biologische systemen18,19, en het is betrokken bij de intestinale regressie van zee komkommer tijdens aestivation9. Om het apoptotische proces in organismen van belang te onderzoeken, zijn een reeks methoden, waaronder Hoechst kleuring en microscopie testen, vastgesteld en met succes toegepast20. Hier, we voerden apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen van zee komkommer om te beoordelen van de bruikbaarheid van primaire cellen in biologische studies van mariene ongewervelde dieren. Dexamethason, een van de meest gebruikte synthetische glucocorticosteroïden21, werd gebruikt voor het opwekken van Apoptosis in gekweekte darmcellen van zee komkommer, en significante Hoechst 33258 signaal werd met succes gedetecteerd in de bevlekte cellen door fluorescerende microscopie.

<table><tbody><tr><td>0.1 &mu;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m filter</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4 cm schotels</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde-oplossing</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>80096618</td><td>in PBS</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuges</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488-kit</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>Constant temperature incubator</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>Elektrisch thermostatisch waterbad</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor (FGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamycin</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258-kleuringsoplossing</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>XW1106168001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-achtige Growth Factor (IGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (100 mg/mL)</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>XW77863031</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>PH-meter</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primaire gekweekte cellen worden gebruikt in een verscheidenheid van wetenschappelijke disciplines als uitzonderlijk belangrijke instrumenten voor de functionele evaluatie van biologische stoffen of de karakterisering van specifieke biologische activiteiten. Echter, vanwege het gebrek aan universeel toepasbare celcultuur media en protocollen, zijn goed beschreven celkweek methoden voor mariene organismen nog steeds beperkt. Ondertussen belemmeren de vaak voorkomende microbiële besmetting en polytrope eigenschappen van mariene ongewervelde cellen de totstandbrenging van een effectieve celcultuur strategie voor ongewervelde mariene organismen. Hier beschrijven we een gemakkelijk te hanteren methode voor het kweken van darmcellen van zeekomkommer Apostichopus japonicus; Daarnaast bieden we een voorbeeld van in vitro apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen. Bovendien biedt dit experiment informatie over de juiste methode voor kweekmedium en celverzameling. Het beschreven protocol is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea, en het kan voldoende cellen bieden voor meervoudige in vitro experimentele toepassingen. Deze techniek zou onderzoekers in staat stellen om de primaire celculturen efficiënt te manipuleren van ongewervelde mariene organismen en om de functionele evaluatie van gerichte biologische materialen op cellen te vergemakkelijken.

Hier hebben we de primaire intestinale celcultuur van A. japonicus vastgesteld en de cellen door gevoerd. Figuur 1 toont ronde cellen in verschillende stadia van culturing. En de EdU-kleurings testen bieden directe bewijzen om de proliferatieve activiteit van deze ronde cellen in een later stadium te onthullen (Figuur 2). We hebben ook het protocol enigszins aangepast, het kweken van gehakte weefsel blokken in plaats van gefiltreerde cellen; Bovendien, ...

Dit protocol biedt een eenvoudig te hanteren methode voor het kweken van de darmcellen van Sea komkommer Apostichopus japonicus en is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea.

Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Het protocol biedt een eenvoudig te hanteren en op grote schaal compatibele primaire celkweekmethode voor ongewervelde mariene dieren. Deze techniek geeft onderzoekers een manier om de mariene ongewervelde cellen cultuur voor relatief lange tijd. Een cultuur van cellen moet worden voorzien van een consistente genetische achtergrond voor verschillende verdere biologische experimentele toepassingen in mariene biologie onderzoek.Voor het nieuwe onderzoek op dit gebied zijn wij van mening dat het aangegeven vereenvoudigde protocol de goede keuze moet zijn om uit te oefenen. Na verdovenderij, ontleden en verzamelen van de voorste darmen, dan sectie van de weefselmonsters verticaal en verwijder de innerlijke inhoud. Was de weefselmonsters twee keer in PBS en desinfecteer ze door ze langer dan twee seconden onder te dompelen in een 75%-ethanoloplossing.Dan was de weefselmonsters in PBS drie keer om de ethanol te verwijderen, en breng ongeveer 100 milligram weefsel monster in een twee milliliter steriele microcentrifuge buis. Voeg 1,5 milliliter vooraf geoptimaliseerd cultuurmedium toe aan het darmweefselblok voor zeekomkommers en maak het blok gehakt met gesteriliseerde chirurgische schaa

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo&#39;s en differentiëren van embryonale stamcellen

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Een workflow met behulp van stroom cytometry of differentieel centrifugeren is ontwikkeld om te detecteren, te kwantificeren en te isoleren van apoptotic instanties uit een monster apoptotic hoge zuiverheid.

Detectie en isolatie van Apoptotic instanties hoge zuiverheid

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

Apoptose kan worden gekenmerkt door flowcytometrische analyse van vroege en late apoptotische biomarkers. De cervicale kankercellijn, SiHa, werd geanalyseerd op apoptosebiomarkers na behandeling met Actinomycine D met behulp van een benchtop flowcytometer.

Flowcytometrische analyse van apoptotische biomarkers in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Leer een eenvoudige primaire celcultuurmethode voor darmcellen van Apostichopus japonicus. Dit protocol ondersteunt langdurige kweek van mariene ongewervelden voor celbiologisch onderzoek.

Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen

Meer video's verkennen