NF-κB-afhankelijke Luciferase activering en kwantificering van genexpressie in met salmonella geïnfecteerde weefselkweek cellen

Dit protocol is handig voor het bepalen van veranderingen in NF-kappa-B activering in cellen die een NF-kappa-B luciferase reporter uitdrukken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het zorgt voor een high-throughput scherm van factoren of omstandigheden die leiden tot veranderingen in NF-kappa-B activering. NF-kappa-B is een transcriptiefactor voor een breed scala aan cellulaire processen.

Een bekende functie van NF-kappa-B is in de inductie van ontstekingsreacties door het induceren van de expressie van verschillende cytokinen en chemokines. Ons lab is vooral geïnteresseerd in de inductie van NF-kappa-B geïnduceerd door de ziekteverwekker Salmonella typhimurium. Hier gebruiken we de HeLa cellijn die stabiel is getransfecteerd met een NF-kappa-B luciferase verslaggever plasmid.

Andere bacteriën, of zelfs virussen of chemische verbindingen, kunnen worden gebruikt in deze cellijn om de activering van NF-kappa-B te bestuderen. Andere cellijnen kunnen ook worden gebruikt als je zo'n NF-kappa-B luciferase reporter plasmid in die cellijn introduceren. Iemand die dit doet voor de eerste keer kan problemen hebben goed gebruik te maken van steriele techniek die nodig is voor celcultuur en bacteriële werk.

Een dag voor celstimulatie, verwijder de groeimedia van HeLa 57A cellen die zijn gegroeid tot ongeveer 75%-samenvloeiing. Was cellen met een milliliter van 0,05% trypsin EDTA. Vervang met een andere milliliter trypsin EDTA en breng de kolf gedurende vijf minuten over naar een 37 graden Celsius incubator.

Nadat de cellen zijn losgemaakt van de kolf, schorsen ze in 10 milliliter groeimedia. Combineer 10 microliter celsuspensie met 10 microliter Trypan blauw, pipet op en neer om te mengen, en breng 10 microliters naar een cel teller schuif. Tel cellen in suspensie met behulp van een cel teller, en gebruik groeimedia om de cellen te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 keer 10 tot de vijf cellen per milliliter in een 50 milliliter conische buis.

Breng 250 microliter van de celsuspensie over naar elke put van een 48-putplaat. Dop en draai de conische buis periodiek om een homogene celsuspensie te garanderen. Tik op de plaat voorzichtig aan de zijkant om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdelen in de putten.

Breng de plaat naar 37 graden Celsius in een 5%koolstofdioxide incubator en laat de cellen te hechten en groeien 's nachts. Streep bevroren voorraden Salmonella op LB agar platen om enkele kolonies te produceren. Breng de platen over op een couveuse set op 37 graden Celsius en laat 's nachts groei.

De volgende dag, voeg drie milliliter LB aan steriele bacteriële kweekbuizen, en voeg geschikte antibiotica aan de media toe. Met behulp van een steriele inentingslus, kies een enkele kolonie uit de gestreepte bacteriële culturen en raak de lus aan op de LB-media. Dop de buizen na het inenten en gooi de lus weg.

Plaats de buizen in een schudden incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 180 RPM, dan laat de bacteriën om te groeien 's nachts. Haal 's ochtends 's nachts bacteriële culturen uit de couveuse. Bereid buizen voor subcultuur door het toevoegen van drie milliliter verse LB en antibiotica.

Breng 30 microliters van de nachtelijke bacteriële cultuur naar de vers bereide media. Plaats de buizen in een schudden incubator ingesteld op 37 graden Celsius voor drie uur. Na de drie uur incubatie, breng een milliliter steriele LB bouillon in een plastic cuvette om te dienen als de blanco.

Breng 900 microliter LB over in de andere cuvettes die voor de monsteranalyse moeten worden gebruikt. Breng 100 microliter bacteriële subcultuur over in een cuvette met 900 microliters LB en pipet meerdere keren op en neer om te mengen. Herhaal dit voor elke bacteriële suspensie.

Zet de spectrofotometer aan om de optische dichtheid van de bacteriële culturen te meten op een golflengte van 600 nanometer. Plaats de blanco in de spectrofotometer. Let op de oriëntatie.

Sluit het deksel en druk op de lege knop op de spectrofotometer om de achtergrondabsorptie te krijgen. Vervang de lege cuvette door een monster cuvette in dezelfde richting en druk op lezen. Nota van de OD600-waarden van deze monsters.

Vermenigvuldig de waarde met 10 om rekening te houden met de verdunningsfactor. Verdun de suspensie één tot tien in een cuvette en meet de absorptie, die een waarde van ongeveer 0,1 moet geven die ruwweg overeenkomt met één keer 10 tot de negen CFU per milliliter. Voeg in een nieuwe buis een passend volume van de verdunde subcultuur toe aan verse LB om een suspensie van één keer 10 te bereiken tot de acht CFU per milliliter die als entmateriaal moet worden gebruikt.

Bereid seriële verdunningen van het entmateriaal door 50 microliter bacteriële suspensie over te brengen naar een buis met 450 microliter steriele PBS tot een definitieve verdunning van ongeveer 100 CFU per milliliter is gemaakt. Breng 100 microliter van de twee laagste verdunningen, 100 en 1000 CFU per milliliter, over naar twee LB agar platen, en verspreid de suspensie met een celspreader om enkele kolonies te verkrijgen. Breng deze platen naar een 37 graden Celsius incubator en incubeer 's nachts.

De volgende dag, tel de kolonies en bereken de bacteriële concentratie van het initiële entmateriaal om de werkelijke entmateriaalconcentratie te bepalen. Op dezelfde dag, label het deksel van de plaat volgens de infectie voorwaarden die zullen worden gebruikt voor elke put, met elke voorwaarde wordt gedaan in drievoud. Voeg 10 microliter van het entmateriaal toe aan de juiste putten en voeg 10 microliter steriele LB toe aan niet-geïnfecteerde controleputten.

Om de tijd van infectie te synchroniseren, plaats de plaat in een tafelblad centrifuge en draai op 500 keer G gedurende vijf minuten, ervoor te zorgen dat de plaat wordt gecompenseerd. Breng vervolgens de geïnfecteerde cellen een uur lang over naar een 5%koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius. Plaats een 15 milliliter conische buis met een aliquot van cel cultuur media in een 37 graden Celsius water bad voor gebruik in de volgende stap.

Een uur na de tijd van infectie, verwijder de 15 milliliter conische buis met celcultuur media uit het water bad en veeg de buitenkant met 70%ethanol. Breng de weefselkweekplaten van de couveuse over naar een bioveiligheidskast. Gebruik steriele tips om media uit de putten aan tezuilen en te vervangen door 250 microliters van verse, warme celkweekmedia.

Breng de platen terug naar de 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius voor een extra vier uur. Verwijder daarna de platen uit de koolstofdioxide-incubator en haal de media uit de putten. Voeg voor luciferase-analyse 100 microliters van 1X-cellysebuffer toe aan de putten.

Breng de plaat naar een negatieve vriezer van 80 graden Celsius en broed gedurende ten minste 30 minuten in om een efficiënte cellyse te garanderen. Plaats vervolgens de plaat met bevroren cellysaat op een bankje om te ontdooien en bereid luciferase substraatreagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat luciferase substraatreagentia in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.

Schakel vervolgens de plaatlezer in en open het bijbehorende lezersprogramma. Stel de machine in om de luminescentie te meten. Breng 10 microliter van elke cellysate over naar een put van een ondoorzichtige 96-putplaat.

Voeg met behulp van een multichannel pipet 50 microliters van het luciferase assay reagens toe aan elke put van de ondoorzichtige plaat. Tik voorzichtig op de plaat aan de zijkant om putten te mengen, en zorg ervoor dat het onderste oppervlak is bedekt met vloeistof. Plaats de plaat in een plaatlezer en start met lezen.

Kopieer de luminescentiewaarden naar een spreadsheetprogramma en plot de resultaten. Dit protocol richt zich op de activering van de transcriptiefactor NF-kappa-B met behulp van een NF-kappa-B afhankelijke luciferase reporter die stabiel wordt doorgetransfecteerd in een lijn van HeLa cellen. Dit cijfer toont een representatief experiment van NF-kappa-B afhankelijke luciferase activering en IL6 genexpressie in HeLA 57A cellen besmet met de Salmonella typhimurium stammen.

Infectie met het wilde type SL1344 stam veroorzaakte een sterk luciferase signaal in zowel de RLU als IL6 expressie, die werd verminderd in cellen besmet met de sipA sopB sopE2 triple mutant en gereduceerd tot controle niveaus met de sipA sopB sopE2 sopEruple mutant. Let goed op bij het doen van uw seriële verdunningen en beplating. Dit zal ervoor zorgen dat u een consistente entmateriaal over uw stammen.

Na het identificeren van factoren die bijdragen aan NF-kappa-B activering en downstream veranderingen in mRNA expressie, kan de westerse vlektechniek worden gebruikt om veranderingen in eiwitexpressie te identificeren. Dit protocol heeft ons lab niet alleen toegestaan om NF-kappa-B activering veroorzaakt door Salmonella te evalueren, maar ook andere verbindingen en eiwitten die betrokken zijn bij NF-kappa-B activering. Salmonella typhimurium is een menselijke ziekteverwekker.

Gebruik de juiste PPE bij het werken met deze bacteriën.