Name: Productie van near-infrared sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer de productie van near-infrared gevoelige core-shell polybubbles voor vaccinafgifte met PLGA en PCL. Deze methode verbetert cargostabiliteit en vertraagde afgifte voor toegankelijke vaccindistributie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen dr. Bryan E. Tomlin bedanken die verbonden is aan het elemental analysis lab binnen de afdeling chemie van TAMU die assisteerde bij de neutronenactiveringsanalyse (NAA).

1. Polycaprolacyone triacrylaat (PCLTA) synthese
<ol><li>Droog 's nachts bij 50 °C in een open ronde bodemkolf van 200 mL 3,2 mL van 400 Da polycaprolacyone (PCL) bij 50 °C in een open ronde bodemkolf van 200 mL en K2CO3 in een glazen flacon bij 90 °C.</li>
	<li>Meng het triol met 6,4 mL dichloormethaan (DCM) en 4.246 g kaliumcarbonaat (K2CO3) onder argon.</li>
	<li>Meng 2,72 mL acryloylchloride in 27,2 mL DCM en voeg druppelsgewijs toe aan het reactiemengsel in de kolf van meer dan 5 min.</li>
	<li>Bedek het reactiemengsel met aluminiumfolie en laat het 24 uur ongestoord bij kamertemperatuur onder argon.</li>
	<li>Na 24 uur filtert u het reactiemengsel met behulp van een filterpapier op een Buchner trechter onder vacuüm om overtollige reagentia weg te gooien.</li>
	<li>Neerslagfiltraat vanaf stap 1.5 dat het afgetopte polymeer in diethylether in een 1:3 (vol/vol) en rotovape bij 30 °C bevat om de diethyther te verwijderen.</li>
</ol>2. Vorming van de polybubble
OPMERKING: Het injecteren van polymeer in het gedeïoniseerde (DI) water zou ervoor zorgen dat de polybubbles naar de bodem van de flacon migreren, wat resulteert in een afgeplatte bodem. Gebruik 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulose (CMC) vul de glazen flacon in plaats daarvan om te voorkomen dat polybubble afvlakking.
<ol><li>Bereid 10% (wt/vol) CMC oplossing in DI water.</li>
	<li>Vul een 0,92 mL glazen flacon met 0,8 mL van 10% CMC met behulp van een 1 mL transfer pipet.</li>
	<li>Meng 1000 mg/mL van 14 kDa PCL in DCM en synthetiseer PCLTA in een 1:3 (vol/vol) voor een totaal volume van 200 μL of bereid 200 μL van 1000 mg/mL van 5 kDa poly (melkzuur-co-glycolzuur) diacrylaat (PLGADA) in chloroform.</li>
	<li>Meng het mengsel van 2 hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (fotoinitiator) met het polymeer (PLGADA of PCL/PCLTA) mengsel in 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Laad 200 μL polymeermengsel in een 1 mL glasspuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.</li>
	<li>Gebruik een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te controleren om polymeer in de 10% CMC in de glasfuit te injecteren om de polybubble te vormen.</li>
	<li>Genees de polybellen onder ultraviolet (UV) op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.</li>
	<li>Flash bevriest de polybellen in vloeibare stikstof en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.</li>
	<li>Scheid de polybellen van de gedroogde CMC met behulp van tangen en was de polybubbles met DI water om eventuele resterende CMC te verwijderen. Merk op dat andere polymeren waarschijnlijk kunnen worden gebruikt met wijzigingen om de release kinetiek te veranderen.</li>
</ol>3. Modulatie van polybubble diameter
<ol><li>Vul een 0,92 mL glazen flacon met 10% CMC met behulp van een 1 mL transfer pipet.</li>
	<li>Meng PCL/PCLTA in een 1:3 (vol/vol) met 1000mg/mL 14kDa PCL en synthetiseer PCLTA. Meng de fotoinitiator met polymeermengsel in een 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Laad het polymeermengsel in een 1 mL glazen spuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.</li>
	<li>Gebruik een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te controleren om polymeer in de 10% CMC in de glasfuit te injecteren om de polybubble te vormen.</li>
	<li>Voor het verkrijgen van polybubbles met verschillende diameters, variëren dispensing tarief van 0,0005 tot 1 μL/s.</li>
	<li>Maak foto's van de flacon met de polybubbles met een wisselende diameter.</li>
	<li>Gebruik ImageJ om de diameter van de polybellen te kwantificeren en gebruik de grootte van de flacon als schaal.</li>
</ol>4. Centreren van lading binnen polybubble
<ol><li>
Modulatie van pcl/PCLTA viscositeit met K2CO3: OPMERKING: De viscositeit van PLGADA hoeft niet te worden gewijzigd met K2CO3 omdat de viscositeit van 5 kDa PLAGDA bij 1000 mg/mL voldoende is om de lading te centreren.<ol>
<li>Voeg K2CO3 (dat na de PCLTA-reactie geïsoleerd was) toe aan de PCLTA bij verschillende concentraties, waaronder 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL en 60 mg/mL.</li>
		<li>Meet de dynamische viscositeiten van de oplossingen door de schuifsnelheid te wijzigen van 0 naar 1000 1/s met behulp van rheomemetrie.</li>
		<li>Injecteer de lading handmatig in het midden (zie stap 4.2 om het vrachtmengsel voor te bereiden) van de polybellen die zijn gevormd met behulp van de PCL/PCLTA-oplossingen met verschillende concentraties K2CO3 (stap 4.1.1). Bepaal de optimale concentratie van K2CO3 door te observeren welke oplossing vanaf stap 4.1.1 kan leiden tot het vasthouden van de lading in het midden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centreren van de lading (reeds getoonde haalbaarheid met kleine moleculen) met CMC
	<ol>
<li>Meng de lading met 5% (wt/vol) CMC in een rotator 's nachts om de viscositeit van de lading te verhogen.</li>
		<li>Injecteer handmatig 2 μL vrachtmengsel in de polybubble en ga verder met UV-uitharding op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.</li>
		<li>Flash bevriest de polybubbles in vloeibare stikstof voor 30 s en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.</li>
		<li>Scheid de polybellen van de gedroogde CMC met tangen en was met DI-water om eventuele resterende CMC te verwijderen.</li>
		<li>Snijd de polybubble in de helft en beeld de helften met behulp van confocale microscopie om ervoor te zorgen dat de lading is gecentreerd (verwijzen naar stap 6 voor excitatie en emissie golflengten gebruikt).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vrachtformulering
OPMERKING: Polybubble formulering kan huisvesten verschillende soorten lading, waaronder kleine moleculen, eiwitten, en nucleïnezuren.
<ol><li>Gebruik op basis van eerdere studies, in het geval van eiwitlading, excipiënten, waaronder polyethyleenglycol (PEG)6,polyvinylpyrrolidone (PVP) en glycopolymeren6 om de stabiliteit van eiwitten tijdens polybubbleformulering te verbeteren.</li>
	<li>Vorm polybubbles op basis van het protocol in stap 2.</li>
	<li>Bereid de antigeenoplossing voor door 17,11 g trehalose toe te voegen aan 625 μL HIV-gp120/41-antigeen.</li>
	<li>Injecteer handmatig 1 μL antigeenoplossing in het midden van de polybubble.</li>
	<li>Open polybellen op dag 0, 7, 14 en 21 en noteer de fluorescentie van antigeen met excitatie en emissiegolflengten respectievelijk 497 nm en 520 nm.</li>
	<li>Bepaal de functionaliteit van het antigeen met behulp van enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en gebruik 5% vetvrije melk als blokkeringsbuffer.</li>
</ol>6. Vrijgave van lading
LET OP: Klein molecuul of antigeen kan worden gebruikt als het ladingstype
<ol><li>
Klein molecuul
	<ol>
<li>Incubate polybubbles with centered acriflavine in 400 μL fosfaatbuffer zout (PBS) bij 37 °C, 50 °C voor PLGADA polybubbles en bij 37 °C, 50 °C, 70 °C voor PCL/PCLTA polybubbles. OPMERKING: De reden waarom we aanraden om boven lichaamstemperaturen te testen, is om a) de temperatuur (50 °C) te simuleren waarbij de polybubble reikt tijdens het laseren van de gouden nanorods (AuNRs) binnen PCL en PLGA; b) het afbraakproces van PCL (50 °C, 70 °C) versnellen.</li>
		<li>Verzamel op elk moment de supernatants en vervang ze door 400 μL verse PBS.</li>
		<li>Gebruik een plaatlezer om de fluorescentieintensiteiten in de verzamelde supernatants te kwantificeren. LET OP: Gebruik ex/em van 416 nm/514 nm voor acriflavine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigeen
	<ol>
<li>Incubate polybubbles with centered bovine albumin serum (BSA)-488 in 400 μL pbs at 37 °C, 50 °C for PLGA polybubbles and at 37 °C, 50 °C for PCL/PCLTA polybubbles.</li>
		<li>Verzamel op elk moment de supernatants en vervang ze door 400 μL verse PBS.</li>
		<li>Gebruik een plaatlezer om de fluorescentieintensiteiten in de verzamelde supernatants te kwantificeren. Gebruik ex/em van 497 nm/520 nm voor BSA-488. OPMERKING: Releasestudie bij 70 °C voor PCL/PCLTA-polybubbles mag niet worden uitgevoerd om te voorkomen dat het antigeen wordt blootgesteld aan extreme temperatuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Toxiciteit
<ol><li>
Kwantificeren van chloorgehalte in polybellen met behulp van neutronenactiveringsanalyse (NAA)
	<ol>
<li>Gebruik polybubbles die lyofiel zijn gemaakt voor 2, 4, 6, 20 en 24 uur voor deze studie op 0.010 mBar vacuüm en bij -85 °C.</li>
		<li>Meet 5-9 mg polybellen en plaats ze op LDPE-bestralingsflinry's.</li>
		<li>Bereid 1000 g/mL chloorkalibratieoplossing voor van het National Institute of Standards and Technology (NIST)-traceerbare kalibratieoplossing.</li>
		<li>Gebruik de Triga-reactor van 1 megawatt om neutronenbestralingen uit te voeren op elk monster bij neutronenfluentiesnelheid van 9,1 ×10 12 /cm2·s voor 600 s.</li>
		<li>Breng de polybellen over op niet-bestraalde flesjes.</li>
		<li>Gebruik HPGe detector om gamma-ray spectra te verkrijgen voor 500 s na 360 s verval intervallen.</li>
		<li>Gebruik NAA-software van canberra Industries om de gegevens te analyseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificeren van chloorgehalte vrijgegeven van polybubbles met behulp van NAA
	<ol>
<li>Incubeer polybellen die 's nachts lyofiel werden gelyofilitiseerd (bij 0,010 mBarvacuüm en bij -85 °C) in 400 μL PBS bij 37 °C.</li>
		<li>Verzamel de supernatants op week 1, 2 en 3 na incubatie.</li>
		<li>Analyseer de supernatants op chloorgehalte met behulp van NAA met behulp van dezelfde methode als hierboven beschreven in stap 7.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. AuNR Synthese door Kittler, S., et al.8
<ol><li>Bereid AuNR-zaaioplossing voor door 250 μL chlorauriczuur (HAuCl4),7,5 mL van 100 mM cetrimoniumbromiide (CTAB) en 600 μL van 10 mM ijskoud natriumbouride (NaBH4) te mengen.</li>
	<li>Bereid De groeioplossing voor door 40 mL van 100 mM CTAB, 1,7 mL van 10 mM HAuCl4, 250 μL zilvernitraat (AgNO3)en 270 μL van 17,6 mg/mL ascorbinezuur aan een buis te mengen.</li>
	<li>Meng krachtig 420 μL zaadoplossing met de groeioplossing bij 1200 tpm gedurende 1 min. Laat het mengsel vervolgens 16 uur ongestoord reageren.</li>
	<li>Verwijder de overtollige reagentia uit het mengsel door 8000 × g gedurende 10 minuten te centrifugeren en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>9. Hydrofobicization of AuNRs by Soliman, M.G., et al.9
<ol><li>Pas de pH van 1,5 mL gesynthetiseerde CTAB-gestabiliseerde AuNRs aan op 10 met behulp van 1 mM natriumhydroxide (NaOH).</li>
	<li>Roer de oplossing met 0,1 mL van 0,3 mM gemethyleerde PEG (mPEG) thiol bij 400 rpm 's nachts.</li>
	<li>Meng PEGylated AuNRs met 0,4 M dodecylamine (DDA) in chloroform bij 500 rpm gedurende 4 dagen.</li>
	<li>Pipet uit de bovenste organische laag met hydrofobe AuNRs en bewaar op 4 °C tot toekomstig gebruik.</li>
</ol>10. NIR-activering van polybellen
<ol><li>Meng de polymeeroplossing (PLGADA of PCL/PCLTA) met hydrofobe AuNRs in een 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Voeg fotoinitiator toe aan het polymeer-AuNR mengsel in een 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Vorm polybellen door het polymeer-AuNR mengsel te injecteren in een 0,92 mL glazen flacon met 10% CMC (wt/vol) (zie stap 2).</li>
	<li>Cureer de polybubbles op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.</li>
	<li>Flash vries in vloeibare stikstof voor 30 s en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.</li>
	<li>Scheid de gedroogde polybellen met tangen en was met DI-water om eventuele resterende CMC te verwijderen.</li>
	<li>Broed de polybellen in 400 μL PBS bij 37 °C.</li>
	<li>Activeer de polybubbles met behulp van 801 nm NIR laser op 8A gedurende 5 minuten elke maandag, woensdag en vrijdag.</li>
	<li>Neem toekomstgerichte infrarood (FLIR) beelden van de polybubble voor en na laseractivering om temperatuurwaarden te verkrijgen.</li>
	<li>Bereken temperatuurverschillen tussen voor en na laseractivering op basis van de temperatuurwaarden van de FLIR-afbeeldingen.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).</li>
<li>Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Hydroxycinnamate+for+sequential+photouncaging+of+two+different+functional+groups+and+its+application+in+releasing+cosmeceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Dai, C., Wang, B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+peptide+and+protein+drugs+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).</li>
<li>Souery, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+and+quantifying+the+stability+of+amino+acid-based+cargo+within+polymeric+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems.</a> Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Advanced protein formulations.</a> Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultraviolet-curable%2C+core-shell+vaccine+formed+via+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).</li>
<li>Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+and+Fast+Phase+Transfer+of+CTAB+Stabilised+Gold+Nanoparticles+from+Water+to+Organic+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physikalische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase.</a> Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235(2015).</li>
<li>Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Transfer+and+Polymer+Coating+Methods+toward+Improving+the+Stability+of+Metallic+Nanoparticles+for+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications.</a> Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).</li>
<li>Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+Light-Activatable+Polybubbles+for+On%3FDemand+Therapeutic+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. , 2003579(2020).</li>
<li>Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+and+delayed+release+of+lysozyme+from+ointment-like+poly%28ortho+esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters).</a> Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability%2C+stabilization%2C+and+formulation+of+liquid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals.</a> International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).</li>
<li>Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28epsilon-caprolactone%29+and+poly+%28L-lactic-co-glycolic+acid%29+degradable+polymer+sponges+attenuate+astrocyte+response+and+lesion+growth+in+acute+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury.</a> Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).</li>
<li>Davoodi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems+for+programmed+and+on-demand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems for programmed and on-demand release.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).</li>
<li>Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+laser+intensity+activated+plasmonic+gold+nanoparticle-generated+photothermal+effects+on+cellular+morphology+and+viability%3A+a+real-time%2C+long-term+tracking+and+monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).</li>
<li>Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Shape+Changes+of+Colloidal+Gold+Nanorods+Using+Femtosecond+and+Nanosecond+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Huidige technologieën en uitdagingen Emulsie-gebaseerde micro- en nanodeeltjes zijn vaak gebruikt als drug levering dragers. Hoewel de release kinetiek van de lading van deze apparaten zijn uitgebreid bestudeerd, het regelen van burst release kinetiek is een grote uitdaging11. De veelzijdigheid en functionaliteit van de lading zijn ook beperkt in emulsiesystemen als gevolg van de blootstelling van lading aan overtollige waterige en organische oplosmiddelen. Op eiwitten gebaseer...

Beperkte vaccinatie dekking resulteert in de dood van 3 miljoen mensen specifiek veroorzaakt door vaccin-vermijdbare ziekten1. Ontoereikende opslag- en transportomstandigheden leiden tot verspilling van functionele vaccins en dragen zo bij tot een verminderde wereldwijde vaccinatie. Bovendien veroorzaakt onvolledige vaccinatie als gevolg van het niet naleven van de vereiste vaccinschema's ook een beperkte vaccinatiedekking, met name in ontwikkelingslanden2. Meerdere bezoeken aan medisch personeel zijn vereist binnen de aanbevolen periode voor het ontvangen van booster shots, waardoor het percentage van de bevolking met volledige vaccinatie te beperken. Daarom is er behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor gecontroleerde vaccinlevering om deze uitdagingen te omzeilen.
De huidige inspanningen voor de ontwikkeling van technologieën voor de levering van vaccins omvatten polymere systemen op basis van emulsie3,4. Vracht wordt echter vaak blootgesteld aan een grotere hoeveelheid organisch oplosmiddel die aggregatie en denaturatie kan veroorzaken, met name in het kader van op eiwitten gebaseerde lading5,6. We hebben een nieuw platform voor de levering van vaccins ontwikkeld, "polybubbles", dat mogelijk meerdere laadcompartimenten kan huisvesten terwijl het volume van de lading die wordt blootgesteld aan oplosmiddel7minimaliseert. Bijvoorbeeld, in onze polybubble core-shell platform, een cargo zak van diameter 0,38 mm (SEM) wordt geïnjecteerd in het midden van een 1 mm polybubble. In dit geval zou de oppervlakte van lading die aan organisch oplosmiddel wordt blootgesteld ongeveer 0,453 mm2bedragen . Na het overwegen van de verpakkingsdichtheid van bollen (microdeeltjes) in een bol (vrachtdepot), bedraagt het werkelijke volume van microdeeltjes (10 μm in diameter) die in het depot passen 0,17 mm3. Het volume van een microdeeltje is 5.24x10-8 mm3 en dus het aantal deeltjes microdeeltjes die het depot passen is ~ 3.2x106 deeltjes. Als elk microdeeltje 20 laadzakken heeft (als gevolg van dubbele emulsie) met een diameter van 0,25 μm, bedraagt het oppervlak van lading dat aan organisch oplosmiddel is blootgesteld 1274 mm2. Cargo depot binnen de polybubble zou dus ~ 2800-voudige minder oppervlakte blootgesteld aan organische oplosmiddel in vergelijking met die van organische oplosmiddel blootgestelde lading in microdeeltjes. Ons op polyester gebaseerde platform kan zo de hoeveelheid lading die aan organisch oplosmiddel wordt blootgesteld, verminderen, wat anders ladingaggreggregatie en instabiliteit kan veroorzaken.
Polybubbles worden gevormd op basis van fasescheiding principe waarbij het polyester in organische fase wordt geïnjecteerd in een waterige oplossing wat resulteert in een bolvormige zeepbel. Lading in de waterige fase kan vervolgens worden geïnjecteerd in het midden van de polybubble. Een andere laadruimte kan mogelijk worden bereikt binnen de polybubble door het mengen van een andere lading met het polymeer shell. De polybubble in dit stadium zal kneedbaar zijn en zal dan worden genezen om te resulteren in een solide polybubble structuur met lading in het midden. Sferische polybellen werden gekozen boven andere geometrische vormen om de laadcapaciteit binnen de polybubble te verhogen en tegelijkertijd de totale grootte van de polybubble te minimaliseren. Polybubbles met lading in het centrum werden gekozen om vertraagde burst release aan te tonen. Polybubbles werden ook opgenomen met nabij-infrarood (NIR)- gevoelig (d.w.z. theranostisch inschakelend) middel, namelijk gouden nanorods (AuNR), om een stijging van de temperatuur van de polybubbles te veroorzaken. Dit effect kan mogelijk een snellere afbraak vergemakkelijken en kan worden gebruikt voor het beheersen van kinetiek in toekomstige toepassingen. In dit artikel beschrijven we onze benadering van het vormen en karakteriseren van polybubbles, om vertraagde burst release van de polybubbles te bereiken, en om AuNR op te nemen in de polybubbles om NIR-activering te veroorzaken.

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-2-methylpropiofenon</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Acryloylchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavine</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous ethylether</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HIV1 gp120 antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rund serumalbumine (BSA)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488 kleurstofconjugaten</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Bromosalicylzuur</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethylcellulose (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Centrimoniumbromide (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Coating buffer</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Dichloormethaan (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl amine</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicine hydrochloride</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Syringe Pump</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG thiol</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>Vetvrij droge melk</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonaat</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat zoutoplossing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>(Poly(caprolacton)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>(Poly(caprolacton) triol</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Poly (lactid-co-glycolid) diacrylaat</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonaat</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant HIV1 gp120 + gp41 eiwit</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Zilvernitraat</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborohydride</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachlorogoudaanzuur</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>Trechalose</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Acros Organics</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

productie van near-infrared sensitive, core-shell vaccine delivery platform

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Strategieën voor de afgifte van vaccins die de blootstelling van lading aan organisch oplosmiddel kunnen beperken en tegelijkertijd nieuwe releaseprofielen mogelijk maken, zijn cruciaal voor het verbeteren van de vaccinatiedekking wereldwijd. Hier wordt een nieuwe injecteerbare, ultraviolet-te genezen en vertraagde burst release- waardoor vaccin levering platform genaamd polybubbles geïntroduceerd. Lading werd geïnjecteerd in polybubbles op basis van polyester die werden gevormd in 10% carboxymethycellulose-gebaseerde wateroplossing. Dit papier bevat protocollen om de bolvormige vorm van de polybellen te behouden en de plaatsing en retentie van de lading te optimaliseren om de hoeveelheid lading binnen de polybubbles te maximaliseren. Om de veiligheid te garanderen, werd het gechloreerde oplosmiddelgehalte binnen de polybubbles geanalyseerd met behulp van neutronenactiveringsanalyse. Release studies werden uitgevoerd met kleine moleculen als lading in de polybubble om vertraagde burst release te bevestigen. Om het potentieel voor on-demand levering van de lading verder te laten zien, werden gouden nanorods gemengd in de polymeerschaal om nabij-infraroodlaseractivering mogelijk te maken.

Polybubbles werden uitgebreid gekenmerkt met behulp van SEM en NAA. Cargo werd met succes gecentreerd om te resulteren in een vertraagde burst release. Polybubbles werden ook met succes laser-geactiveerd vanwege de aanwezigheid van AuNRs binnen de polybubbles.
Polybubble karakterisering Polybubbles geïnjecteerd in een waterige oplossing zonder CMC resulteerde in een afgeplatte polybubble als gevolg van hun co...

Dit artikel beschrijft de protocollen die worden gebruikt om een nieuw vaccin levering platform te produceren, "polybubbles," om vertraagde burst release mogelijk te maken. Polyesters, waaronder poly(melk-co-glycolzuur) en polycaprolactone werden gebruikt om de polybubbles te vormen en kleine moleculen en antigeen werden gebruikt als lading.

Productie van near-infrared sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Dit protocol kan helpen de stabiliteit van de lading, die zowel kleine moleculen als eiwitten kan zijn, te behouden door het gebruik van de polybubble, die op zijn beurt de koolstofinteracties met het oplosmiddel kan verminderen. Deze nieuwe techniek kan worden gebruikt om de dekking van vaccins in de ontwikkelingslanden te verbeteren, omdat vaccinfunctionaliteiten vaak in het gedrang kunnen komen als gevolg van inefficiënte transport- en opslagfaciliteiten. Om de polybubbles te fabriceren, gebruik dan eerst een één milliliter transferpipet om 800 microliter van 10%CMC toe te voegen aan een 0,92 milliliter glazen flacon.Om PCLTA te synthetiseren, meng 1.000 gram per milliliter van 14 kilodalton PCL in 200 microliters van DCM. Om PLGADA te synthetiseren, meng 1.000 gram per milliliter van vijf kilodalton PLGADA tot 200 microliter chloroform. Meng fotoinitiator met het polymeermengsel van belang bij een verhouding van 0,005 tot 1 en laad 200 microliters van de resulterende oplossing in een één milliliter glasspuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.Met behulp van een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te regelen, injecteer het polymeer in de 10%CMC in de glazen flacon om de polybellen te vormen en genees de polybellen onder ultraviolet licht op een golflengte van 254 nanometer gedurende 60 seconden bij twee watt per vierkante centimeter, en bevries vervolgens de polybellen in vloeibare stikstof gedurende 30 seconden en lyofiel de dragers 's nachts op 0,01 millibar vacuüm in min 85 graden Celsius. Voor het centreren van de lading van belang binnen een polybubble, meng de lading met 5%CMC in een rotator 's nachts om de viscositeit van de lading te verhogen voordat handmatig injecteren twee microliters van het vrachtmengsel in de polybubble. Wanneer alle van de lading is geïnjecteerd, re-cure, flash bevriezen, en lyophilize de geïnjecteerde polybubble zoals net aangetoond.De volgende ochtend, gebruik tangen om de polybubble te scheiden van de gedroogde CMC en was de polybubble met gedeïoniseerd water om eventuele resterende CMC te verwijderen. Snijd vervolgens de polybubble doormidden en beeld de helften door confocale microscopie om ervoor te zorgen dat de lading gecentreerd is. Voor kleine molecuul lading release, incubeer de polybubbles met gecentreerde acriflavine in 400 microliters van PBS bij 37 graden Celsius voor de juiste incubatielengte.Verzamel op elk experimenteel tijdstip het supernatant en voeg 400 microliter verse PBS toe aan de flacon. Gebruik vervolgens een plaatlezer om de fluorescentieintensiteit van het verzamelde supernatant te kwantificeren. Voor nabij-infrarood activering, meng de polymeeroplossing met hydrofobe gouden nanostaven op een één tot negen verhouding en voeg foto initiator op een 0.005 tot 1 verhouding.Injecteer het resulterende mengsel in een 0,92 milliliter glazen flacon met 800 microliter van 10%CMC en genees de polybubbles onder ultraviolet licht zoals aangetoond. Na het bevriezen van de flits en lyophilisatie zoals aangetoond, was de polybellen met gedeïoniseerd water en incubeer de dragers in 400 microliter van PBS bij 37 graden Celsius voor de aangewezen incubatieperiode. Aan het einde van de incubatie, het verkrijgen van een vooruitstrevend infrarood beeld van de polybubble voor en na het activeren van de polybellen met een 801 nanometer nabij-infrarood laser op acht ampère gedurende vijf minuten gedurende vijf minuten gedurende vier weken gedurende vier weken voor PLGADA polybubbles en 14 weken voor PCL-PCLTA polybubbles.Verzamel op elk experimenteel tijdstip het supernatant en voeg 400 microliter verse PBS toe aan de flacon. Bereken vervolgens de temperatuurverschillen tussen de polybubbles voor en na laseractivering op basis van de temperatuurwaarden van de toekomstgerichte infraroodbeelden. De toevoeging van 10%CMC-gebaseerde waterige oplossing resulteert in een complete polybubble suspensie voor een succesvol onderhoud van de polybubble sfericiteit.Ladinginjectie in de polybubble bij afwezigheid van CMC resulteert in lekkage en een daaruit voortvloeiend gebrek aan ladingretentie in de polybubble. Om deze lekkage aan te pakken, kan de viscositeit van de PCLTA worden verhoogd met behulp van kaliumcarbonaat geïsoleerd na het beëindigen van polycaprolactone met triacrylaat en de viscositeit van de lading kan worden verhoogd door de lading te mengen met 5%CMC. De viscositeit van de PLGADA polybubbles is voldoende om de centrering van de lading te vergemakkelijken en vereist geen modulatie via kaliumcarbonaat.Merk op dat er geen statistisch significant verschil in de bindingsefficiëntie van het antilichaam wordt waargenomen na het mengen van HIV-gp120/41-antigeen met en zonder trehalose vóór polybubbelinjectie. Vertraagde burst releases worden waargenomen in PLGADA polybubbles met acriflavine in het midden op dag 19 voor polybubbles geïncubeerd op 37 graden Celsius en op dag vijf voor polybubbles geïncubeerd op 50 graden Celsius. Bovendien kunnen PLGADA polybubbles en PCL en PCLTA polybubbles met gouden nanostaven meerdere keren met succes worden laser-geactiveerd.Let er bij het vormen van de polybellen op dat de reagentia tegen het licht worden beschermd en dat u de oplossingen ook onmiddellijk gebruikt. Na de ontwikkeling van deze technologie wilden we ook het automatiseren van dit proces onderzoeken om de polybubbleproductie op te schalen.

production-near-infrared-sensitive-core-shell-vaccine-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een algemene procedure voor het bestuderen van recombinante receptor-bindend domein (RBD)-gebaseerde subunit vaccins tegen SARS. Het bevat methoden voor transfectie en expressie van de RBD eiwit in 293T-cellen, immunisatie van muizen met RBD en detectie van de neutralisatie activiteit van muis-sera met behulp van een gevestigde SARS pseudovirus neutralisatie assay.

Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie

This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST),...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

This video demonstrates a method for the generation of a polymer bubble or polybubble-based novel platform that enables delayed burst release. Polyester-based polymers are used to form the polybubbles with core-shell structure, and small molecules and antigens can be used as cargo.

A Technique to Generate a Novel Delivery Platform for a Delayed Burst Release of Molecules

This video demonstrates a method for generating an mRNA vaccine candidate using polymeric nanoparticles. The cationic polymer interacts with negatively charged mRNA, forming polyplexes. The formation of polyplexes stabilizes the mRNA, making it a potential candidate for future mRNA vaccines in immunotherapeutic applications.

Formulating mRNA-Loaded Nanoparticles for Vaccination Purposes

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Dit protocol beschrijft het gebruik van commerciële, celvrije eiwitexpressiekits om membraaneiwitten te produceren die worden ondersteund in nanodisc die kunnen worden gebruikt als antigenen in subunitvaccins.

Celvrije geschaalde productie en adjuvante toevoeging aan een recombinant belangrijk buitenmembraaneiwit van Chlamydia muridarum voor vaccinontwikkeling

Het huidige protocol beschrijft de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als een "Plug-and-Display" vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.

Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Deze methode beschrijft de inkapseling van het rabiësantigeen in biologisch afbreekbare polymere microdeeltjes met structurele en materiaaleigenschappen die pulsatiele afgifte na een vooraf bepaalde vertraging mogelijk maken. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) beoordeling van het antigeen dat uit de deeltjeskern wordt gehaald, bevestigt de aanwezigheid van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne door deeltjesfabricage.

Fabricage van pulsatiele polymere microdeeltjes die rabiësantigeen inkapselen

In dit protocol hebben we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (RA) ontwikkeld dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. Door de door de FDA goedgekeurde RA aan de nano-emulsie toe te voegen, werd antigeenspecifiek sIgA gepromoot in de vagina en dunne darm na intramusculaire injectie van de nano-emulsie.

Kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur als adjuvans ter bevordering van OVA-specifieke systemische en mucosale reacties

Leer de productie van near-infrared gevoelige core-shell polybubbles voor vaccinafgifte met PLGA en PCL. Deze methode verbetert cargostabiliteit en vertraagde afgifte voor toegankelijke vaccindistributie.

Productie van near-infrared sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Meer video's verkennen