Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren in neurale voorlopercellen en vervolgens in neuron astrocyten en oligodendrocyte. Echter, type cultuur methode voor menselijke embryonale stamcellen en hun differentiatie in neurale voorloper cellen zijn zeer inefficiënt en open in vivo co-cultuur systeem Hier presenteren we een verbeterde en robuuste cultuur systeem dat gemakkelijk schaalbaar is met behulp van high-density eencellige type cultuur met menselijke embryonale stamcellen. Eencellige type cultuur van menselijke embryonale stamcellen biedt een snel en efficiënt systeem om de moleculaire mechanismen die de multi-stap differentiatie langs verschillende en verschillende gedifferentieerde afstammingen te reguleren, met inbegrip van neurale voorloper cellen en hun daaropvolgende differentiatie in extra neurale afstammingen te bestuderen.

Begin met de voorbereiding van menselijke embryonale stamcel gekwalificeerde kelder membraan matrix gecoate platen. Ontdooi de keldermembraanmatrixoplossing langzaam minstens twee tot drie uur of 's nachts bij vier graden Celsius. Verdun de matrix in koude DMEM/F-12 tot 2% goed en bestrijk elke put van een zesputige plaat met één milliliter van de verdunde oplossing.

Incubeer de gecoate platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur of bij vier graden Celsius 's nachts. Om de feeder-vrije culturen van kolonietype H9 menselijke embryonale stamcellen te overgaan die op keldermembraanmatrix worden gekweekt, het middel van de putten aanzuigen en eens met één milliliter DPBS wassen. Voeg een milliliter Dispase oplossing aan elke put en incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Verwijder de Dispase en was de cellen één keer voorzichtig met twee milliliter DMEM/F-12. Na de was, verwijder het medium en voeg twee milliliter DMEM / F-12 aan elke put. Maak de kolonies voorzichtig los door op en neer te pipetten en ze over te brengen naar een buis van 15 milliliter.

Centrifugeren de buis op 370 keer g gedurende twee minuten. Het medium aanzuigen. Vervolgens scheiden van de cel pellets in enkele cellen door het toevoegen van twee milliliter van cel ontachement oplossing en uitbroeden ze op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Herhaal de centrifugatie en verwijder de onthechtingsoplossing. Resuspend de cellen in mTeSR-1 menselijke ESC medium door zachtjes pipetten op en neer. Om het kolonietype menselijke embryonale stamcellen aan te passen aan een cultuur van het eencellige type, plaat ongeveer 1,5 tot twee miljoen cellen in elke put van de kelder membraanmaten gecoate plaat in twee milliliter mTeSR-1 met 10 micromolar ROCK remmer.

Vervang het medium na 24 uur door verse mTeSR-1 zonder ROCK-remmer. Laat de cellen groeien als een eencellige type gedurende drie dagen het veranderen van het medium per dag. Op de vierde dag, dissociate de cellen in onthechting oplossing en opnieuw plaat ze zoals eerder beschreven.

Na het opnieuw uitzetten en uitbroeden van de cellen volgens de handschriftrichtingen, breng de kleine embryonale lichamen over naar een buis van 15 milliliter, laat ze zich naar de bodem nestelen en verwijder het medium voorzichtig met een pipet. Breng ze naar EB medium en laat ze uit te breiden in lage bevestiging gerechten voor zeven dagen. Om neurale voorloper cel of NPC differentiatie induceren, dissociaal het eencellige type menselijke embryonale stamcellen met een milliliter van detachement oplossing en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Centrifugeren de cellen gedurende twee minuten op 370 keer g. Verwijder de onthechtingsoplossing supernatant. Dan resuspend de cellen in DMEM/F-12.

Plaat de cellen op een kelder membraan matrix gecoate zes-put plaat op een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per put in twee milliliter van mTeSR-1 met 10 micromolar ROCK remmer. Vervang na 24 uur het kweekmedium door neurale inductiemedium aangevuld met één micromolar Dorsomorphin en vijf micromolar SB431542. Verander het medium om de andere dag tijdens de eerste vier dagen van neurale inductie, dan elke dag tot de samenvloeiing wordt bereikt op dag zeven.

Na zeven dagen van neurale inductie, dissociate de cellen door het toevoegen van een milliliter onthechting oplossing en incuberen ze gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius. Centrifugeren de cellen op 370 keer g en verwijder de ontwijdingsoplossing supernatant. Voeg een milliliter NPC expansiemedium toe en pipette de cellen voorzichtig op en neer om opnieuw te worden opgetrokken.

Dan plaat een keer 10 tot de vijfde cellen per put in twee milliliter van NPC expansiemedium op de kelder membraan matrix gecoat zes-put platen. Passage de cellen als dat nodig is wanneer culturen bereiken 90%-samenloop toe te voegen 10 micromolar ROCK remmer tijdens de eerste drie tot vier passages. Verander het medium om de andere dag tijdens de uitbreiding.

Om PLO laminine gecoate platen te bereiden, verdun de PLO-voorraadoplossing in PBS of water tot een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter, meng goed, en bestrijkt elke put van een zes-put plaat met één milliliter van de oplossing. Broed de platen minstens twee uur bij 37 graden Celsius of 's nachts bij vier graden Celsius. Vervolgens was je elke put met PBS en onmiddellijk na de vacht van elke put met een milliliter laminineoplossing bereid volgens de handschriftaanwijzing.

Houd de platen maximaal een week op vier graden Celsius. Om NPC's te differentiëren in dopaminerge neuronen, de cellen in PLO laminine-gecoate gerechten in NPC-expansiemedium bij een dichtheid van ongeveer 50% Na 24 uur, verander het medium naar DA1 en verander het medium daarna om de andere dag. Om culturen door te geven wanneer ze samenvloeiing bereiken, distantieer de cellen met een milliliter onthechtingsoplossing en broed ze gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.

Vercentrifugeren ze vervolgens op 370 keer g en verwijder de ontwijdingsoplossing supernatant. Resuspend de cellen in een milliliter VAN DA1 medium en plaat een keer 10 tot de vijfde cellen in twee milliliter van medium op de PLO laminine gecoate zes-put platen. Om de NPC's te differentiëren in astrocyten, plaat de cellen op de PLO laminine platen en NPC expansie medium bij een dichtheid van 50%veranderen het medium tot astrocyten medium na 24 uur, en passage de cellen zoals eerder beschreven.

Toen menselijke embryonale stamcellen van kolonietype werden aangepast aan de eencellige kweek, bleek dat de cellen bij hoge dichtheid konden worden gehandhaafd en vervolgens gemakkelijk en efficiënt werden gesubcultuurd wanneer de samenvloeiing werd bereikt. Deze cellen behielden de celcycluskenmerken die kenmerkend zijn voor menselijke embryonale stamcellen van kolonietype, zoals een korte G1-fase en een hoog percentage cellen in de S-fase. Kwantitatieve PCR-analyse bevestigde ook dat zij ESC-markers uitdrukken op niveaus die vergelijkbaar zijn met die van kolonietypecellen.

Bovendien werd aangetoond dat eencellige menselijke embryonale stamcellen embryonale lichamen konden vormen die cellen uit alle drie de kiemlagen bevatten:endoderm, mesoderm en ectoderm. Vervolgens werd aangetoond dat eencellige embryonale stamcellen efficiënt gedifferentieerd in NPC's, zoals aangegeven door het verlies van typische menselijke embryonale stamcelmorfologie en het uiterlijk van NPC morfologie. Differentiatie werd ondersteund door de toegenomen expressie van kenmerkende NPC-markers en bevestigd door immunostaining en FACS-analyse.

Dezelfde analyse toonde ook aan dat meer dan 90% van de cellen positief gekleurd voor SOX1, PAX6, en NCAM eiwitten. Bovendien waren de afgeleide NPC's in staat om zich te onderscheiden in dopaminerge neuronen en astrocyten, zoals aangegeven door het verschijnen van karakteristieke morfologieën en expressie van afstammingsspecifieke markers. Bij het proberen van deze procedure is het essentieel om de menselijke embryonale stamcellen met een hoge dichtheid te plaat om een gezonde, ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcelkweek te behouden.

Dit protocol biedt een platform voor eenvoudige, robuuste en schaalbare productie van voorloper en gedifferentieerde cel die schaalbaar zal zijn voor basisstudie, medicijnscherm en toepassing in neurodegeneratieve geneeskunde.