Name: Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryos en larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer hele mount immunohistochemie voor eiwitdetectie in intacte weefsels van zebravisembryo's en larven. Deze methode maakt driedimensionale visualisatie van eiwitexpressiepatronen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering van NIH subsidie 8P20GM103436 14.

De procedures voor het werken met zebravis fokken volwassenen en embryo's beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Murray State University.
1. Embryoverzameling en fixatie
<ol><li>Bereid paaitanks voor door volwassen zebravis gemengde seksparen of groepen in tanks te plaatsen met een gaas of sleuvenvoering gevuld met systeemwater 's nachts.</li>
	<li>Bij lichten aan, verander de paaitank water voor vers systeemwater om uitwerpselen te verwijderen. Gebruik een 14 h/10 h lichte donkere cyclus met lichten die aangaan om 9 uur.</li>
	<li>Zodra eieren zijn gelegd, terug te keren de volwassenen naar huis tanks.</li>
	<li>Verzamel eieren door ze op te maken met behulp van een transfer pipet of gieten ze in een mesh zeef.</li>
	<li>Breng de eieren over naar petrischaaltjes die halverwege met embryomedium zijn gevuld (zoals 30% Danieau of E2-embryomedium met 0,5 mg/L methyleenblauw), waardoor het aantal embryo's per schotel wordt beperkt tot 50.</li>
	<li>Verwijder alle eieren die dood zijn of niet te verdelen. OPMERKING: Dode embryo's kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als ze ondoorzichtig worden en vaak "troebel" lijken. Als methyleenblauw aan embryomedium wordt toegevoegd, krijgen de dode embryo's een donkerblauw uiterlijk.</li>
	<li>Broed gerechten van eieren bij 28,5 °C tot ze het gewenste stadium bereiken. Voor dit experiment, verhogen van de embryo's tot 23 pkf.</li>
	<li>Optioneel) Breng de embryo's op 24 pk fin naar 200 μM 1-fenyl 2-thiourea (PTU) in embryomedium om melanogenese16,17te voorkomen . Als alternatief bleekmiddelen na fixatie (zie optioneel punt 5).</li>
	<li>Verander embryo medium of PTU medium per dag.</li>
	<li>Dechorionate onuitgebroede embryo's met behulp van ultra-fijne-tip tangen onder een stereomicroscoop. Als alternatief, chemisch dechorionate embryo's door uitte broeden in 1 mg/mL Pronase in embryo medium gedurende enkele minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de embryo's uit Pronase en was drie keer met embryomedium.</li>
	<li>Gedechorionated embryo's blijven bij plastic. Bewaar ze in glas of plastic petrischaaltjes bedekt met 1-2% agarose opgelost in embryomedium. Verplaats gedechorionated embryo's met behulp van brandgepolijste Pasteur pipten om schade te minimaliseren.</li>
	<li>Breng de embryo's over op centrifugebuizen van 1,5 mL met behulp van een plastic of brandgepolijste pipet.</li>
	<li>Verwijder embryomedium met een micropipet. Laat alleen genoeg vloeistof om alleen de embryo's te dekken na elke vloeistofverandering.</li>
	<li>Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische rookkap. LET OP: PFA is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.</li>
	<li>Bevestig de embryo's in 4% PFA voor 1-2 uur met zacht schommelen bij kamertemperatuur. U ook de embryo's 4 uur vastzetten tot 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was drie keer in 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) gedurende 5 min.</li>
	<li>Gebruik de embryo's onmiddellijk of bewaar maximaal 1 week op 4 °C.</li>
	<li>Voor langdurige opslag dehydrateert u de embryo's in 100% methanol (MeOH) 2 uur of 's nachts bij -20 °C. Bewaar de embryo's enkele maanden op -20 °C in MeOH. LET OP: MeOH is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.</li>
</ol>2. Embryopreparaat
<ol><li>Rehydrateer de embryo's door middel van seriële incubatie bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Incubeer in 75% MeOH/25% 1x PBS voor 5 min, rocken.</li>
		<li>Incubeer in 50% MeOH/50% 1x PBS voor 5 min, rocken.</li>
		<li>Incubeer in 25% MeOH/75% 1x PBS voor 5 min, rocken.</li>
		<li>Incubeer in 100% PBTriton voor 5 min, rocken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Optioneel) Bereid een verse eiwitase K-werkoplossing (10 μg/mL in PBTriton) op ijs door 10 μL vers ontdooide eiwitase K-bouillon (10 mg/mL) toe te voegen.<ol>
<li>Permeabilize de embryo's door tot 30 min te verteren in Proteinase K. LET OP: Voorgestelde timing is <24 pkf: geen spijsvertering; 24 pkf: 15 min spijsvertering; en 7 dagen oud: 30 min spijsvertering.</li>
		<li>Spoel gepermeabiliseerde embryo's in PBTriton en bevestig in 4% PFA gedurende 20 min bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min op kamertemperatuur met zacht schommelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Primaire antilichaam incubatie
<ol><li>Selecteer een commerciële blokkeringsoplossing of serum dat overeenkomt met de secundaire antilichaamgastheersoorten (bijvoorbeeld 10% geitenserum in PBTriton) met of zonder 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Blokkeer de embryo's in blokkerende oplossing voor 1-3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.</li>
	<li>Incubeer in primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum in PBTriton 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen. In dit experiment, de primaire antilichamen gebruikt waren anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA receptor, en anti-fosfo-Histone H3, elk verdund tot een laatste concentratie van 1:500 in 1% geit serum in PBTriton.</li>
	<li>Was vijf keer in PBTriton gedurende 10 minuten op kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
</ol>4. Secundaire antilichaam incubatie
<ol><li>Selecteer een secundair antilichaam op basis van de gastheersoorten van het primaire antilichaam en de gewenste golflengte.</li>
	<li>Incubeer in secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (of 's nachts bij 4 °C) tijdens het schommelen. OPMERKING: Fluorescerende secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. We gebruikten 1:500 geit-anti-muis Alexa488 verdund in 1% geitenserum in PBTriton.</li>
	<li>Bedek de buizen met aluminiumfolie of bedek met een lichtblokkerende doos voor deze en alle volgende stappen.</li>
	<li>Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min op kamertemperatuur tijdens het schommelen.</li>
	<li>Breng de embryo's over naar een 50% glyceroloplossing in PBS over een bed van 2% agarose in embryomedium en ga verder naar documentatie of ga verder naar verdere verwerkingsstappen hieronder.</li>
</ol>Optionele stappen
5. Bleken
<ol><li>Bereid bleekoplossing in een buis van 1,5 mL voor door 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL van 2 M KOH en 100 μL van 30% H2O2toe te voegen.</li>
	<li>Omkeren van de buis drie keer te mengen.</li>
	<li>Pipetteer 1 mL bleekoplossing richting aan de embryo's.</li>
	<li>Open de embryobuisdop om gas te laten ontsnappen. Tik voorzichtig op de buis op de bank om bubbels los te maken.</li>
	<li>Monitor het bleekproces (gebruik indien nodig een microscoop) en stop de reactie wanneer pigment voldoende wordt verwijderd (ongeveer 5 min voor 24 pk f of 10 min voor 72 pkf).</li>
	<li>Verwijder de bleekoplossing voorzichtig met een micropipet en spoel embryo's drie keer in 1 mL PBTriton. LET OP: Embryo's zijn plakkerig in deze stap.</li>
	<li>Ga hieronder verder naar documentatie of verdere verwerkingsstappen.</li>
</ol>6. Embryodissectie en Deyolking
<ol><li>Om de dooier te verwijderen, breng je een kleine hoeveelheid (~ 200 μL of genoeg om het embryo volledig te bedekken, maar beperkend genoeg om te beperken waar het kan zweven) van 1x PBS naar een depressieglijbaan of een gewone glazen glijbaan.</li>
	<li>Gebruik een plastic overdracht pipet om 1 of meer embryo's te verplaatsen naar de PBS druppel.</li>
	<li>Gebruik ultrafijne tangen en 00 insectenpennen om de dooier uit elkaar te halen en heel voorzichtig dooierkorrels van het ventrale oppervlak van het embryo te schrapen (zie ook Cheng et al., 2014)18.</li>
	<li>Verwijder dooierkorrels en vul PBS indien nodig aan.</li>
	<li>Herhaal dit totdat het embryo voldoende vrij is van dooier.</li>
</ol>7. Vlakke montage op glijbanen
<ol><li>Breng dedooierembryo's over op een geladen glazen schuif met een plastic pipet of een micropipet te met 1 mL met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen). Oriënteer naar wens met een 200 μL micropipett tip of insectenpin.</li>
	<li>Wick weg overtollige PBS met een Kim doekje of papieren handdoek.</li>
	<li>Voeg 2-3 druppels montagemedium toe aan de glijbaan en de coverslip.</li>
	<li>De lucht droogt ongeveer 5 tot 10 min.</li>
	<li>Sluit het dekselglas op de glijbaan met duidelijke nagellak. LET OP: De randen van het afdekglas moeten volledig bedekt zijn met een dunne, doorlopende laag nagellak.</li>
	<li>Laat ongeveer 10 minuten drogen voordat u beeldgeeft.</li>
</ol>8. Montage in Agarose
<ol><li>Bereid 1% agarose in embryomedium door 0,5 g agarose toe te voegen aan 50 mL embryomedium in een microgolfveilige kolf of beker van ten minste 3x groter volume dan gewenst.</li>
	<li>Verwarm in een magnetron, wervelend om de 30 s, totdat agarose volledig is opgelost.</li>
	<li>Maak 1 mL aliquots in centrifugebuizen van 1,5 mL. Bewaar de aliquots op kamertemperatuur.</li>
	<li>Dek buisdoppen af met dopsloten voor het verwarmen.</li>
	<li>Plaats agarose buizen in een drijvende buis houder in een beker half gevuld met water.</li>
	<li>Magnetron het bekerglas met drijvende buizen voor 2-3 min, of totdat agarose volledig is gesmolten.</li>
	<li>Breng een embryo over op de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).</li>
	<li>Plaats het embryo op een rechthoekige coverslip met insectenpinnen en voeg ongeveer 20 μL gesmolten agarose direct toe aan het embryo.</li>
	<li>Oriënteer snel de regio van belang het dichtst bij de coverslip met behulp van 00 insecten pinnen. LET OP: Dit is een omgekeerde mount.</li>
	<li>Breng de agarose buis terug naar de warmwaterbuis vlotter tussen elk gebruik en magnetron als dat nodig is.</li>
	<li>Beeld dat een microscoop gebruikt wanneer agarose uithardt. Houd het gemonteerde embryo ondersteboven voor gebruik op een omgekeerde microscoop. Draai de coverslip om (zodat de agarose onder de coverslip ligt) voor gebruik op rechtopstaande microscopen.</li>
</ol>9. Montage op overbrugde glijbanen
<ol><li>Om overbrugde glijbanen te maken, lijm vierkante coverslips aan de glazen glijbaan met behulp van een kleine stip van superlijm. OPMERKING: Er moet een trog van ten minste 5 mm breed tussen de coverslips. Twee #1 coverslips hoog is meestal geschikt voor 24-48 pkf embryo's, terwijl drie coverslips hoog nodig kan zijn voor 72 pkf.</li>
	<li>Breng 1-2 deyolked embryo's over naar de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).</li>
	<li>Wick weg overtolligvocht met een Kim doekje of papieren handdoek.</li>
	<li>Voeg een daling van ≥80% glycerol direct toe aan het embryo.</li>
	<li>Dek af met een rechthoekig dekselglas. De druppel glycerol moet het dekselglas raken.</li>
	<li>Voeg meer glycerol toe aan de ruimte tussen het dekselglas en de dia als dat nodig is om het embryo volledig te bedekken met een marge van glycerol aan de zijkanten van het embryo.</li>
	<li>Schuif het rechthoekige dekselglas voorzichtig om het embryo in positie te rollen voor beeldvorming.</li>
</ol>10. DAB-kleuring
OPMERKING: Deze sectie begint na stap 4.2 hierboven en vervangt de rest van stap 4.
<ol><li>Bebroed de embryo's in een blokkerende oplossing met een geperoxideerd secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.</li>
	<li>Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de embryo's over op een kweekplaat of depressieplaat met een transferpipet.</li>
	<li>Meng 50 μL van 1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) opgelost in ddH2O en 50 μL van 0,3% waterstofperoxide en breng tot 1 mL met PBS. LET OP: DAB is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi dab-verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.</li>
	<li>Bedek met HRP bevlekte embryo's met de hierboven opgestelde DAB-oplossing en monitor onder een microscoop op kleurontwikkeling (meestal 1-5 min).</li>
	<li>Na het bereiken van het gewenste niveau van kleurontwikkeling, spoel de embryo's kort in PBS.</li>
	<li>Breng de embryo's terug naar een buis van 1,5 mL voor fixatie.</li>
	<li>Bevestig de embryo's opnieuw voor 15-20 min in 4% PFA bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min.</li>
	<li>Ga naar documentatie.</li>
</ol>11. Gewijzigd protocol voor kleuring sectioned tissue dat is gemonteerd op dia's
<ol><li>Omring weefsel om te worden bevlekt met een pap pen.</li>
	<li>Breng de glijbanen naar een vochtige kamer.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS direct toe aan de dia.</li>
	<li>Incubeer 7 min bij kamertemperatuur om inbeddingmedium te verwijderen.</li>
	<li>Giet PBS af door dia om te keren.</li>
	<li>Rehydrateer 1 min in maximaal 1 mL TNT buffer (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).</li>
	<li>Blokkeer in maximaal 1 mL blokkeringsoplossing (commercieel of 10% serum + 2% BSA) voor 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer 's nachts in primair antilichaam verdund in 1% serum of blokkeringsoplossing bij 4 °C.</li>
	<li>Was vijf keer in maximaal 1 mL TNT-buffer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer in secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Bedek de kamer met folie of gebruik een donker deksel.</li>
	<li>Was vijf keer in TNT bij kamertemperatuur. Giet de laatste wasaf.</li>
	<li>Monteer met 2-3 druppels montagemedium en coverslip. Laat 5-10 min zitten.</li>
	<li>Sluit het dekselglas op de glijbaan met behulp van duidelijke nagellak. Laat volledig drogen voordat beeldvorming.</li>
</ol>12. Documentatie
<ol><li>Neem de volledige procedure en eventuele afwijkingen op in een labnotebook.</li>
	<li>Neem de concentratie, naam, catalogusnummer, fabrikant en lotnummer van het primaire antilichaam op.</li>
	<li>Plaats de juiste gemonteerde monster op de microscoop fase. Zoek de regio van belang.</li>
	<li>Selecteer een relatief helder voorbeeld. Stel camerabelichting in en gain, zodat het signaal voldoende helder is zonder te verzadigen.</li>
	<li>Vergelijk de kleurintensiteit van dezelfde interesseregio met dezelfde blootstellingsinstellingen wanneer u vergelijkt tussen experimentele embryo's met antilichamen en controleantilichamen (ex. IgG) embryo's.</li>
</ol>

<ol><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li>
<li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+Hybridization%2FImmunohistochemistry+%28ISH%2FIH%29+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li>
<li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li>
<li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen%2C+cryocut+mouse+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376(2014).</li>
<li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1%2FTAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li>
<li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin%2C+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li>
<li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos%2C+but+not+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).</li>
<li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li>
<li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li>
<li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li>
<li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li>
<li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li>
<li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatie te onthullen.

Immunohistochemie is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de spatio-temporele expressie van vrijwel elk eiwit van belang in een organisme te karakteriseren. Immunohistochemie wordt gebruikt op een breed scala aan weefsels en modelorganismen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik bij zebravissen. Immunohistochemie bij verschillende soorten kan verschillende fixatie- en behandelingstechnieken vereisen, waardoor oplossingen worden geblokkeerd, afhankelijk van soorten en de aanwezigheid van endogene pe...

De zebravis (Danio rerio) is ontstaan als een krachtig model voor de studie van biologische processen om verschillende redenen, waaronder korte generatie tijd, snelle ontwikkeling, en beaambaarheid aan genetische technieken. Als gevolg hiervan worden zebravissen vaak gebruikt in hoge doorvoer kleine molecuul schermen voor toxicologisch onderzoek en drugs ontdekking. Zebravissen zijn ook een aantrekkelijk model voor de studie van ontwikkelingsprocessen, aangezien één vrouwtje routinematig 50-300 eieren tegelijk kan produceren en de optisch heldere embryo's zich extern ontwikkelen, waardoor ontwikkelingsprocessen efficiënt kunnen worden gevisualerd. Echter, vroeg onderzoek baseerde zich meestal op voorwaartse genetische schermen met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of andere mutageens als gevolg van uitdagingen bij het vaststellen van omgekeerde genetische technieken. Ongeveer twee decennia geleden werden morpholinos voor het eerst gebruikt bij zebravissen om gerichte genen neer te halen1. Morpholinos zijn kleine antisense oligonucleotiden die de vertaling van doelmRNA remmen na micro-injectie in een embryo in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een grote zwakte van morpholinos is dat ze worden verdund als de cellen te verdelen en over het algemeen verliezen effectiviteit door 72 uur na de bevruchting (hpf). Terwijl morpholinos een krachtig instrument blijven voor verstoring van het zebravisgen, worden transcriptionor-achtige effector nucleases (TALENs), zink-vinger nucleases (ZFNs), en geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPRs) meer recent gebruikt om direct gericht op de zebravis genoom2,3. Deze omgekeerde genetische strategieën, in combinatie met voorwaartse genetica en hoge doorvoerschermen, hebben de zebravissen vastgesteld als een krachtig model om genexpressie en functie te bestuderen.
De capaciteit om genfunctie te bestuderen vereist over het algemeen een evaluatie van de spatio-tijdelijke distributie van gen of genproductuitdrukking. De twee meest gebruikte technieken om dergelijke expressiepatronen te visualiseren tijdens de vroege ontwikkeling zijn in situ hybridisatie (ISH) en hele mount immunohistochemie (IHC). In situ hybridisatie werd voor het eerst ontwikkeld in 1969 en is gebaseerd op het gebruik van gelabelde antisense RNA sondes om mRNA expressie in een organisme te detecteren4. In tegenstelling, gelabelde antilichamen worden gebruikt in immunohistochemie om eiwitexpressie te visualiseren. Het idee van het etiketteren van eiwitten voor detectie dateert uit de jaren 19305 en de eerste IHC experiment werd gepubliceerd in 1941 toen FITC-gelabelde antilichamen werden gebruikt om pathogene bacteriën in geïnfecteerde weefsels op te sporen6. ISH en IHC zijn in de daaropvolgende decennia sterk geëvolueerd en verbeterd en worden nu zowel routinematig gebruikt in het moleculaire en diagnostische onderzoekslaboratorium7,8,9,10,11. Hoewel beide technieken voor- en nadelen hebben, biedt IHC verschillende voordelen ten opzichte van ISH. Praktisch, IHC is veel minder tijdrovend dan ISH en is over het algemeen minder duur, afhankelijk van de kosten van de primaire antilichaam. Bovendien, mRNA expressie is niet altijd een betrouwbare metrische van eiwitexpressie als het is aangetoond bij muizen en mensen dat slechts ongeveer een derde van de eiwit overvloed variatie kan worden verklaard door mRNA overvloed12. Om deze reden is IHC een belangrijk supplement om ISH-gegevens te bevestigen, indien mogelijk. Ten slotte kan IHC subcellulaire en co-lokalisatiegegevens verstrekken die niet kunnen worden bepaald door ISH13,14,15. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode om eiwitten betrouwbaar te detecteren door immunohistochemie in hele mount zebravisembryo's en larven. Het doel van deze techniek is het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie van een eiwit van belang in het hele embryo. Deze technologie maakt gebruik van antigeenspecifieke primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Het protocol is gemakkelijk aan te passen aan gebruik op dia-gemonteerde weefselsecties en voor gebruik met chromogene substraten in plaats van fluorescentie. Met behulp van dit protocol, we aantonen dat de ontwikkeling van zebravissen skeletspier drukt ionotropische glutamaat receptoren, in aanvulling op acetylcholine receptoren. NMDA-type glutamaat receptor subunits zijn detecteerbaar op de longitudinale spier op 23 pkf.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil, heavy duty</td><td>Kirkland</td><td></td><td>Elk merk mag worden vervangen</td></tr><tr><td>Anti-NMDA-antilichaam</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histon H3 (Ser10), clone RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPA-receptor (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABN832</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitraat [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen, 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Klare nagellak</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>Elke nagellak of verharder kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Depressie (concaviteit) glijbaan</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES in ultrapuur water.</td></tr><tr><td>Embryo medium, E2</td><td></td><td></td><td>7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu;M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L methyleenblauw</td></tr><tr><td>Zwevende buishouder</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie-samengestelde microscoop</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie stereomicroscoop</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksels 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksels 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Vochtige kamer met deksel</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide, 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge pap pen</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Insectenpins, maat 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Gaasfilter</td><td>Oneida</td><td></td><td>Elk merk mag worden vervangen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Micro-buisjes dopvergrendeling</td><td>Research Products International</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>Roterende mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount montagemedium</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (glas)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (plastic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-fenyl 2-thioureum</td><td>Acros Organics</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 10x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x gemaakt van 10x stock verdund in dH2O</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Paaitank met deksel en inzetstuk</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superlijm gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% Tween20; gemaakt in dH2O</td></tr><tr><td>Transferpijp</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorazijnzuur (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafijne pincetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100

hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om eiwitexpressie en lokalisatie te verkennen tijdens zowel normale ontwikkelings- als ziektetoestanden. Hoewel veel immunohistochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor weefsel- en weefselsecties van zoogdieren, vereisen deze protocollen vaak modificatie en optimalisatie voor niet-zoogdiermodelorganismen. Zebravissen worden steeds vaker gebruikt als een modelsysteem in fundamenteel, biomedisch en translationeel onderzoek om de moleculaire, genetische en celbiologische mechanismen van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Zebravissen bieden veel voordelen als modelsysteem, maar vereisen ook aangepaste technieken voor optimale eiwitdetectie. Hier bieden we ons protocol voor de gehele mount fluorescentie immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven. Dit protocol beschrijft bovendien verschillende montagestrategieën die kunnen worden gebruikt en een overzicht van de voor- en nadelen die elke strategie biedt. We beschrijven ook wijzigingen in dit protocol om detectie van chromogene substraten in hele mountweefsel en fluorescentiedetectie in gesectioneerd larveweefsel mogelijk te maken. Dit protocol is in grote lijnen van toepassing op de studie van vele ontwikkelingsstadia en embryonale structuren.

Hele mount immunohistochemie maakt gebruik van antilichamen om het ruimtelijke patroon van eiwitexpressie in het intacte dier te detecteren. De basisworkflow van immunohistochemie (afgebeeld in figuur 1)omvat het fokken van zebravis, het kweken en voorbereiden van embryo's, het blokkeren van niet-specifieke antigenen, het gebruik van een antigeenspecifiek primair antilichaam om het eiwit van belang te targeten, dat primaire antilichaam op te sporen met een ge...

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Hele mount immunohistochemie is een relatief snelle en eenvoudige techniek die het mogelijk maakt voor de ruimtelijke en temporele observatie van eiwitten direct in een weefsel of organisme met behulp van gelabelde antilichamen. Het nut van deze techniek is dat het zorgt voor de kleuring van een intact weefsel of een organisme zonder eerst sectie en confocale microscopie kan worden gebruikt om een driedimensionale weergave van het eiwitexpressie patroon te genereren. Immunohistochemie wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om de etiologie en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ziekte te begrijpen.Het is ook een waardevol diagnostisch hulpmiddel om tumoren in pathologische monsters te identificeren. Om te beginnen, bereiden paaitanks gevuld met systeemwater en met een mesh of sleuven voering op zijn plaats. Plaats volwassen zebravissen gemengde geslacht paren in groepen in de tanks 's nachts.Gebruik een 14-uurs/10-uur licht/donker cyclus met lichten die om 9.m aan gaan. De volgende ochtend, met de lichten aan, verander de paaitank water met vers systeem water om uitwerpselen te verwijderen. Zodra eieren zijn gelegd, de volwassenen terug naar huis tanks.Verzamel de eieren door ze op te stellen met behulp van een transfer pipet. Breng 50 eieren naar elke petrischaal gevuld halverwege met embryo medium. Verwijder alle ondoorzichtige en troebele eieren die dood zijn of niet te verdelen.Incubeer de schotel van eieren bij 28.5 graden Van Celsius tot 23 uren na bevruchting. Als embryo's ouder zijn dan 24 uur na de bevruchting, met een pipet brengen de embryo's over naar 200 micromolar PTU in embryomedium om melanogenese te voorkomen. Onder een stereomicroscoop, dechorionate de unhatched embryo's met behulp van ultra fijne tip tang.Met behulp van brandgepolijste Pasteur pipetten om schade te minimaliseren, breng ze in glas of plastic Petri schotels bedekt met 1-2%agarose opgelost in embryo medium. Breng de embryo's vervolgens over op 1,5 milliliter centrifugebuizen met een plastic of vuurgepolijste pipet. Verwijder embryomedium met een micropipet.Laat alleen genoeg vloeistof om gewoon de embryo's te dekken. Bevestig de embryo's in 4%PFA gedurende een tot twee uur met zacht schommelen bij kamertemperatuur. Was vervolgens de embryo's drie keer in 1X PBS en 1%PBTriton gedurende vijf minuten.Gebruik de embryo's onmiddellijk of bewaar maximaal een week op vier graden Celsius. Voor langdurige opslag de hydrateren en opslaan van de embryo's in 100% methanol bij min 20 graden Celsius. Om de embryo's te hydrateren, voert u seriële incubaties uit vijf minuten per stuk bij kamertemperatuur met afnemende hoeveelheden methanol en PBS en PBTriton voor de uiteindelijke wasbeurt.Ga verder met het embryopreparaat volgens het manuscript. Kies een blokkeringsoplossing die overeenkomt met de secundaire antilichaamgastheersoort, bijvoorbeeld 10% geitenserum in PBTriton met of zonder twee milligram per milliliter BSA. Voeg 0,5 milliliter van de blokkeeroplossing toe in de buis met het embryo en plaats de buis één tot drie uur op een tuimelschakelaar bij kamertemperatuur.Dan incubeer het embryo in primaire antilichaam verdund in blokkeren oplossing en PBTriton 's nachts op vier graden Celsius tijdens het schommelen. In de ochtend, was het embryo vijf keer in PBTriton gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur tijdens het schommelen. Selecteer vervolgens een secundair antilichaam op basis van de gastheersoort van het primaire antilichaam en de gewenste golflengte op 488 nanometer.Voeg het secundaire antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing in de buis met het embryo. Bedek de buis met aluminiumfolie en broed gedurende twee uur op kamertemperatuur tijdens het schommelen. Daarna, was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur, terwijl bedekt met aluminiumfolie en schommelen.Breng de embryo's met een pipet over naar een 50%glyceroloplossing in PBS over een bed van 2%agarose in embryomedium. Om de dooier te verwijderen, breng je 200 microliter 1X PBS over naar een depressieschuif of een gewone glazen schuif. Gebruik een plastic transfer pipet om een of meer embryo's naar de PBS druppel te verplaatsen.Gebruik ultra fijne tangen en dubbele nul insectenspelden om de dooier uit elkaar te halen en dooierkorrels zeer voorzichtig van het ventrale oppervlak van het embryo te schrapen. Verwijder de dooierkorrels en vul aan met PBS als dat nodig is. Na montage, plaats het monster op de microscoop stadium.Zoek het interessegebied door een relatief helder voorbeeld te selecteren. Pas de belichting van de camera aan en verkrijg de belichting zodat het signaal voldoende helder is zonder te verzadigen. Gebruik bij het vergelijken tussen de experimentele embryo's met antilichaam en controleantilichaamembryo's dezelfde blootstellingsinstellingen.Dit protocol van hele mount immunohistochemie is een waardevol instrument voor de studie van ruimtelijke en temporele eiwitexpressie met behulp van zebravis ontwikkeling. De GluN1 subunit van het NMDA type glutamaat receptor bleek expressie van glutamaat receptor subeenheden tijdens de ontwikkeling van zebravis spieren op 23 uur na de bevruchting. Bevroren delen van 72-uurs postbevruchting embryo's werden gemonteerd op dia's en immunovlekken voor fosfo-H3, een marker van zich vermenigvuldigende cellen.Verscheidene cellen drukden fosfo-H3 uit en de uitdrukking was het opmerkelijkst bij de ventriculaire streken. Muis IgG controle antilichaam en met uitzondering van primaire antilichamen bleek een laag niveau van niet-specifieke expressie. Het is belangrijk om geschikte blokkeringsoplossingen en secundaire antilichamen te selecteren op basis van de primaire antistoffen gastheersoorten om detectie te garanderen en niet-specifieke kleuring te minimaliseren.Immunohistochemie moet worden geverifieerd om ervoor te zorgen dat het waargenomen signaal daadwerkelijk het eiwit van belang is. Follow-up experimenten meestal te betrekken met behulp van genetisch of ecologisch gemodificeerde organismen. Immunohistochemie verleent onderzoekers de mogelijkheid om eiwitten in situ te observeren, waardoor ons begrip van talrijke systemen in zowel de basis- als de toegepaste biologie sterk wordt versneld, met name tijdens de ontwikkeling van embryo's.Methanol en formaldehyde zijn giftig en moeten zorgvuldig worden behandeld. Afval moet worden ingezameld en afgevoerd volgens institutionele procedures.

whole-mount-immunohistochemistry-in-zebrafish-embryos-and-larvae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo&#39;s

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

Leer hele mount immunohistochemie voor eiwitdetectie in intacte weefsels van zebravisembryo's en larven. Deze methode maakt driedimensionale visualisatie van eiwitexpressiepatronen mogelijk.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Meer video's verkennen