Name: Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer een medium-throughput screeningsmethode voor het identificeren van transcriptiefactorregulatoren in kankercellen met behulp van arrayed RNAi-bibliotheken en een dual-luciferase-reporterassay.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Emily Norton en Mikaelan Cucciarre-Stuligross bedanken voor hun hulp bij de voorbereiding van shRNA-vectoren. Dit werk werd mede ondersteund door een Susan G. Komen Career Catalyst Grant die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).

OPMERKING: Een schematische samenvatting van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van de lentivirale vectorbibliotheek
OPMERKING: Het gedemonstreerde scherm gebruikte een arrayed shRNA-bibliotheek gekocht als glycerol-bestanden in 96-putplaten, maar bibliotheken kunnen ook handmatig worden samengesteld op basis van een lijst met kandidaten. Passende besturingselementen moeten in elke bibliotheek worden overwogen en opgenomen. Dit omvat een niet-targeting controle shRNA (shNTC), een controle shRNA gericht op de transcriptie factor wordt onderzocht, en indien mogelijk, een shRNA gericht firefly luciferase.
<ol><li>Voeg 1,3 mL Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl, pH 7.5) met 100 μg/mL ampicillin toe aan elke put van een 96-well deep well plaat. Inent elk goed met 2 μL glycerolvoorraad en groei 's nachts bij 37 °C met constante agitatie bij 225 tpm.</li>
	<li>Breng elke bacteriële cultuur over in een centrifugebuis van 1,5 mL en pellet de bacteriën door centrifugering bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Zuiver elke vector met behulp van een bacteriële mini-prep kit door het volgen van het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van elke vector met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Bewaar de plasmiden op -20 °C. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
</ol>2. Verpakking van de arrayed lentivirale bibliotheek
OPMERKING: Alle werkzaamheden met betrekking tot lentivirus, met inbegrip van verpakking, infectie, en de daaropvolgende kweek van geïnfecteerde cellen moeten strikt voldoen aan de institutionele bioveiligheid regels en voorschriften.
<ol><li>Breid de 293FT-cellen uit met behulp van volledige groeimedia (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L glucose en natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine antibioticum en 2 mM L-glutamine).</li>
	<li>Zaad voor elke vector in de bibliotheek vanaf stap 1.4 één 24-put met 1 x 105 293FT-cellen. OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat sommige extra putten van een controle virale vector worden verpakt en gebruikt om de titer van het virus te testen voordat u doorgaat naar stap 3 (zie hieronder).</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur. OPMERKING: Een algemeen protocol voor de verpakking van lentivirus dat eerder werd beschreven14 is teruggebracht tot 24 putten voor dit protocol. Het gebruikt psPAX2 voor lentivirale verpakking en VSVG als laageiwit. Als ectropic virus gewenst is, kan een vector die Eco levert worden gebruikt in plaats van VSVG. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat dit protocol is geoptimaliseerd om een virale titer te bereiken die tussen de 30%-70% infectie-efficiëntie van de doelcellen geeft (zie Discussie). Zie Aanvullende tabel 1 voor een lijst met alle gebruikte vectoren.</li>
	<li>Stel een transfection mengsel voor elke virale vector uit stap 1.4 zoals hieronder beschreven. Elke transfection moet 250 ng van de virale vector, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μL transfection reagens 1 en 23,75 μL transfection buffer (zie Tabel van materialen)bevatten.<ol>
<li>Verdun elke lentivirale vector tot 50 ng/μL met nucleasevrij water en breng vervolgens 5 μL (250 ng) over in een put van een 96-put PCR-plaat.</li>
		<li>Maak de transfection super mix door het mengen van 1,25 μL * X van transfection reagens 1 en 23,75 μL * X van voorverwarmde transfection buffer waar "X" is het totale aantal transfections plus enkele extra om rekening te houden met volumeverlies tijdens pipetteren.</li>
		<li>Incubeer de transfection super mix bij kamertemperatuur gedurende 5 min.</li>
		<li>Voeg 125 ng * X van psPAX2 en 125 ng * X van VSVG aan de buis van transfection super mix van Stap 2.4.3 en zachtjes pipet op en neer te mengen. Ga snel naar Stap 2.4.5.</li>
		<li>Onmiddellijk aliquot het mengsel uit stap 2.4.4 in elke buis van een PCR strip, en gebruik dan multi-channel pipet om 25 μL het mengsel over te brengen in elke put met virale vector uit stap 2.4.1.</li>
		<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.</li>
		<li>Breng alle 30 μLs van elke 96-put van stap 2.4.6 over in een put van de 24-put met 293 FT cellen uit stap 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 uur en vervang vervolgens de media in elke put van de 24-putplaat door 500 μL verse volledige groeimedia. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor nog eens 24 uur.</li>
	<li>Met behulp van een multi-channel pipet, verzamel de virale supernatant van elke put en aliquot 220 μL (genoeg voor 1 infectie in stap 3 plus wat extra volume) in twee 96-putten elk. Dit zijn de matrixen virale supernatant platen.</li>
	<li>Bewaar de matrixen virale supernatant platen op -80 °C. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het wordt ook aanbevolen om een deel van de extra controle virus dat werd verpakt (zie hierboven) op de cellen te worden besmet voordat u doorgaat naar stap 3 te testen. Dit is om ervoor te zorgen dat de titer voldoende is om ten minste 30% infectie efficiëntie te bereiken.</li>
</ol>3. Infectie van de cellen voor het scherm
OPMERKING: Menselijke melanoomcellen (A375) werden gebruikt om deze aanpak aan te tonen, maar deze methode kan worden toegepast op alle aanhangende cellen die infecteren met lentivirus. Celkweek en beplatingmoeten echter voor elke cellijn worden geoptimaliseerd (zie Discussie).
<ol><li>Breid de cellen uit om te worden geïnfecteerd in volledige groeimedia.</li>
	<li>Zaad 24-well platen met 1 x 105 cellen in 0,5 ml volledige groeimedia per put. Zaad een goed voor elke virale vector worden getest (met inbegrip van controles) en omvatten een extra goed dat niet zal worden besmet die zal dienen als een controle voor de selectie van geneesmiddelen in stap 3.7.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Infecteer elk goed uit stap 3.2 met een andere virale supernatant van de bevroren arrayed lentivirale supernatant als volgt.<ol>
<li>Bereid complete groeimedia voor die 20 μg/mL polybreen bevatten.</li>
		<li>Ontdooi de arrayed lentiviral bibliotheek supernatants van Stap 2.7 naar kamertemperatuur.</li>
		<li>Vermeer de groeimedia van de 24-putplaten uit Stap 3.2 en voeg onmiddellijk 200 μL polybreenhoudende groeimedia toe aan elk goed.</li>
		<li>Breng met behulp van een meerkanaals pipet 200 μL virale supernatant van elke 96-put van stap 3.4.2 naar de 24 putten uit stap 3.4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 - 48 uur. OPMERKING: Sommige cellijnen kunnen langer dan 24 uur nodig hebben om de shRNAs uit te drukken en puromycine resistent te worden. De virale vector die hier wordt gebruikt levert een Turbo-GFP-IRES-puroR met een miR30-gebaseerde shRNA in de 3'UTR van puroR (Figuur 1). Infectie efficiëntie en expressie van de puromycine resistentie gen en de shRNA werden gecontroleerd door groene fluorescerende eiwitten.</li>
	<li>Bereid complete groeimedia voor die 2,5 μg/mL puromycine bevatten. OPMERKING: De selectieconcentratie van puromycine varieert tussen cellijnen. Het wordt aanbevolen dat een antibioticum doden curve worden uitgevoerd voor elke cellijn te worden tested voorafgaand aan het scherm.</li>
	<li>Zuig de media van elke put aan en vervang met 500 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia. OPMERKING: Zorg ervoor dat u ook puromycine toe te voegen aan een controle niet-geïnfecteerde goed dat kan worden gebruikt in de volgende stappen om ervoor te zorgen dat de puromycine selectie is voltooid.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur. OPMERKING: Het is het beste om te selecteren voor 48 uur, dus beplating dichtheid en virale titer moet worden geoptimaliseerd, zodat de cellen niet overconfluent vóór 48 uur.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de geïnfecteerde cellen groen zijn onder de fluorescerende microscoop, en dat cellen op een controle niet-geïnfecteerde goed behandeld met puromycine zijn allemaal dood voordat u doorgaat naar stap 4.</li>
</ol>4. Zaaien cellen voor transfection van dual-luciferase verslaggever
OPMERKING: Er moet een testtransfection worden uitgevoerd om de optimale zaaidichtheid voor elke nieuwe cellijn te bepalen.
<ol><li>Trypsinize elk goed uit stap 3.9 en breng ongeveer 1 x 105 cellen in putten op de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-well plaat als volgt. OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor de screening van bibliotheken met honderden shRNAs, dus het is niet haalbaar om elke put van geïnfecteerde cellen te tellen. Daarom werden de onderstaande stappen gebruikt om celnummers in elke put te schatten om ongeveer dezelfde platingdichtheid te garanderen.<ol>
<li>Groepeer de putten van stap 3.9 in 3 - 4 groepen zodanig dat alle putten in een groep een vergelijkbare celdichtheid hebben.</li>
		<li>Trypsinize 1 vertegenwoordiger goed van elke groep met 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA en 0,1% trypsin) voor 5 min bij 37 °C. Neutraliseer vervolgens de trypsine-EDTA door 400 μL puromycine toe te voegen met volledige groeimedia.</li>
		<li>Tel elke vertegenwoordiger goed om het totale celnummer te bepalen en verdun de celsuspensie van elke vertegenwoordiger goed tot 2 x 105 cellen/mL van het gebruik van volledige groeimedia.</li>
		<li>Zaad 0,5 mL (1 x 105 cellen) van elke put van stap 4.1.3 in de overeenkomstige positie op een nieuwe 24-putplaat en incubeer deze nieuwe 24-well plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
		<li>Gebruik voor elke groep uit stap 4.1.1 het totale celnummer dat in stap 4.1.3 is bepaald om het volume van trypsine-EDTA te berekenen dat aan elke put moet worden toegevoegd, zodat de resulterende celsuspensie 1 x 106 cellen/mL bedraagt.</li>
		<li>Voeg het juiste volume trypsin-EDTA toe aan elke put en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C. OPMERKING: Voor groter scherm wordt aanbevolen dat de 24-put platen worden trypsinized en opnieuw geplated in groepen in plaats van allemaal tegelijk om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen.</li>
		<li>Gebruik tijdens de bovenstaande incubatie een multi-channel pipet om 400 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia toe te voegen aan de overeenkomstige putten op een nieuwe 24-well plaat.</li>
		<li>Breng 100 μL celsuspensie (ongeveer 1 x 105 cellen) van elke put over naar de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-putplaten die in stap 4.1.7 zijn voorbereid.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.6 tot en met 4.1.8 voor alle platen van gegroepeerde putten uit stap 4.1.1, één plaat tegelijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
</ol>5. Transfection of dual-luciferase reporter
<ol><li>Transfect elk goed uit Stap 4.2 met de dual-luciferase verslaggever bouwt als volgt. OPMERKING: De totale hoeveelheid DNA en de optimale verhouding van firefly luciferase reporter vector te controleren Renilla luciferase vector moet worden bepaald voordat u begint met deze test. Hier, 400 ng van een DNA-mengsel dat 20 delen firefly luciferase verslaggever en 1 deel controle Renilla luciferase bevat werd gebruikt.<ol>
<li>Maak het transfection verdunningsmengsel (Buis A) en het verdunningsmengsel van de melder (Buis B) door de aangegeven volumes van elk reagens (tabel 1) te mengen vermenigvuldigd met het totale aantal transfections (plus enkele extra). OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor transfection reagens 2 (zie Materiaaltabel). Als een ander transfection reagens wordt gebruikt, moet de transfection vóór deze stap worden geoptimaliseerd.</li>
		<li>Meng het transfection verdunningsmengsel (Buis A) met reporter verdunningsmengsel (Buis B) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min om transfetiemengsel te produceren.</li>
		<li>Spoel tijdens de bovenstaande incubatie elke 24-put uit stap 4.2 met 0,25 mL fosfaatbufferzout (PBS) en voeg 447 μL complete groeimedia toe aan elke put.</li>
		<li>Gebruik na de incubatietijd van 15 min een multi-kanaals pipet om 53 μL transfection mix te verdelen over elke put van de 24-put platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
</ol>6. Kwantificering van dual-luciferase-activiteiten
<ol><li>Meet luciferase activiteit met behulp van een plaatlezer en een dual-luciferase reporter assay kit zoals hieronder beschreven. OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de aangegeven reporter assay kit (zie Tabel van materialen)en volgt het aanbevolen protocol van de fabrikant.<ol>
<li>Bereid voldoende 1x passieve lysisbuffer voor alle putten plus enkele extra (75 μL is per put nodig) door 5x passieve lysisbuffer (meegeleverd in kit) 1 tot 5 te verdunnen met gedeïoniseerd water. Ook ontdooireagens A en reagens B Buffer (geleverd in kit, 100 μL van elk is nodig voor elke put).</li>
		<li>Aanzuigen de media van elke put van de 24-well plaat van Stap 5.2.</li>
		<li>Voeg 75 μL van 1x passieve lysis buffer aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min met af en toe schudden.</li>
		<li>Bereid reagens B door 50x reagens B substraat (geleverd in kit) 1:50 te verdunnen met ontdooide reagens B buffer.</li>
		<li>Voeg 30 μL van 1x passieve lysisbuffer toe aan 4 putten voor blanking (zie Aanvullende tabel 2).</li>
		<li>Breng 30 μL lysaat van stap 6.1.3 over in dubbele putten van een 96-put platte bodem witte testplaat.</li>
		<li>Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens A aan elke put toe te voegen en lees het firefly luciferase signaal met een plaatlezer.</li>
		<li>Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens B van stap 6.1.4 aan elke put toe te voegen en lees het Renilla luciferase signaal met een plaatlezer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwerk de ruwe gegevens als volgt (zie Aanvullende tabel 2voor een gedetailleerde beschrijving).<ol>
<li>Neem monsters met een zeer laag Renilla luciferase-signaal uit, omdat lage waarden aangeven dat de virale constructie giftig was of dat er te weinig getransfecteerde cellen werden gestoond. OPMERKING: Zoals uitgelegd in de discussie, aanzienlijk "lage" Renilla luciferase signaal kan resulteren in afwijkende resultaten. Hier werden putten waarin het Renilla luciferasesignaal meer dan 1 standaarddeviatie onder het gemiddelde was uitgesloten (zie Aanvullende tabel 2). Dit was gebaseerd op eerdere studies uitgevoerd met behulp van dit reporter systeem in deze cellen14,maar kan verschillen in andere cellijnen.</li>
		<li>Normaliseer de ruwe vuurvlieg luciferase waarde van elke put aan de ruwe Renilla luciferase waarde van dezelfde put om de firefly /Renilla ratio te verkrijgen.</li>
		<li>Gemiddelde de firefly /Renilla ratio's van alle repliceren controle putten en dan verdelen de firefly /Renilla verhouding van elke andere goed door dat aantal om een vouw verandering te krijgen.</li>
		<li>Wijs het controlemonster toe en stel defirefly/Renilla ratio waarde in op 1.</li>
		<li>Gemiddelde de firefly/Renilla ratio's van de dubbele putten en plot met de standaarddeviatie. OPMERKING: De standaarddeviatie wordt niet gebruikt voor statistische analyse, maar als een middel om putten te identificeren waar de replicaties aanzienlijk verschillen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie tonen we een aanpak voor medium-throughput screening van arrayed virale bibliotheken in combinatie met een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test die kan worden gebruikt om te identificeren en testen van nieuwe toezichthouders van transcriptie factoren. Het is van cruciaal belang om het reportersysteem voor elke cellijn voorafgaand aan een scherm te karakteriseren en te optimaliseren. Experimenten moeten worden gedaan om te bevestigen dat de melder reageert op veranderde activiteit van de tr...

Het doel van deze test is om virale bibliotheken te gebruiken om regelgevers van transcriptiefactoren op een relatief snelle en goedkope manier te identificeren. Afwijkende transcriptieactiviteit wordt geassocieerd met kanker en metastase1,,2,3,4,5,6, dus gericht op transcriptiefactoren in kankercellen is een veelbelovende therapeutische benadering. Echter, transcriptie factoren zijn vaak moeilijk te richten farmacologisch7 en velen zijn nodig voor de normale cellulaire functie in volwassen weefsels8,9,10. Gericht op de kanker-geassocieerde trajecten die aberrantly activeren transcriptie factoren om ziekte te rijden is een meer haalbare aanpak met het potentieel om minder ernstige bijwerkingen hebben. De commerciële beschikbaarheid van arrayed lentivirale en retrovirale RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, of ORF bibliotheken stelt onderzoekers in staat om het belang van talrijke genen te testen in een enkel experiment. Er is echter een betrouwbare uitlezing voor gewijzigde transcriptieactiviteit vereist.
Hier beschrijven we het gebruik van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test en arrayed lentivirale bibliotheken om eiwitten die transcriptie factoren in kankercellen te reguleren identificeren. In deze test worden shRNAs die zich richten op kanker-geassocieerde genen geleverd aan zoogdierkankercellen via lentivirale transductie en cellen worden geselecteerd voor stabiele integratie met behulp van puromycine. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met een verslaggever constructie die firefly luciferase gedreven door een promotor die specifiek is voor de transcriptie factor die wordt onderzocht en een controle constructie die Renilla luciferase uitdrukt van een constitutief actieve promotor die niet reageert op de transcriptie factor wordt onderzocht. We demonstreren deze aanpak met een proof-of-concept scherm voor regelgevers van YAP en TAZ, de kritische downstream-effectors van het Hippo-pad8,10,11. Abnormale activiteit van YAP en TAZ bevordert verschillende stappen van de uitgezaaide cascade11 en wordt waargenomen bij veel vormen van kanker11,12,13. Echter, hoe YAP en TAZ worden aberrantly geactiveerd in sommige kankercellen is nog niet volledig begrepen. YAP en TAZ binden geen DNA, maar worden in plaats daarvan aangeworven om promotors door andere transcriptiefactoren. Leden van de TEA-domein (TEAD)-familie van transcriptiefactoren zijn de belangrijkste bindende partners voor YAP en TAZ en zijn van cruciaal belang voor de meeste YAP- en TAZ-afhankelijke functies. Onze verslaggever constructie drukt firefly luciferase van een YAP / TAZ-TEAD-responsieve promotor en eerdere studies hebben aangetoond dat het getrouw veranderingen in YAP-TEAD en TAZ-TEAD transcriptie activiteit2,14,15detecteert .15
Onze aanpak is snel, medium-throughput, en vereist geen screening faciliteiten, geautomatiseerde robots, of diepe volgorde van gepoolde bibliotheken. De kosten zijn relatief laag en er zijn tal van commercieel beschikbare bibliotheken om uit te kiezen. De benodigde apparatuur en reagentia zijn ook relatief standaard in de meeste laboratoria. Het kan worden gebruikt om te screenen voor regelgevers van vrijwel elke transcriptie factor als een luciferase-gebaseerde verslaggever bestaat of wordt gegenereerd. We gebruiken deze benadering om shRNAs in kankercellen te screenen, maar elke cellijn die met redelijke efficiëntie kan worden getransfecteerd, kan worden gebruikt met elk type arrayed-bibliotheek.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>Voor bacteriële mini-prep</td></tr><tr><td>Trypsin - 2.50%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Component van trypsine-EDTA</td></tr><tr><td>96 well flat bottom witte assay plate</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Voor dual-luciferase assay</td></tr><tr><td>Ampicillin - 100 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-10835242001-EA</td><td>Voor bacteriële mini-prep</td></tr><tr><td>Bacto-tryptone - poeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td>Component van LB-bouillon</td></tr><tr><td>Dual-luciferase reporter assay systeem, inclusief LAR II reagens (reagens A), Stop &amp; Glo substraat (reagens B substraat) en Stop &amp; Glo buffer (reagens B buffer) - Kit</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Voor dual-luciferase assay</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium, magnesium en fenol rood - 9.6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>Voor PBS</td></tr><tr><td>EDTA - 0.5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Component van trypsine-EDTA</td></tr><tr><td>Ethanol - 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>Voor bacteriële mini-prep</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum - 100%</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Component van volledig groeimedium</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Voor virusinfectie</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/Hoge glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; natriumpyruvaat</td><td>GE Healthcare life sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Component van volledig groeimedium</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td><td>Molecular devices</td><td></td><td>Voor dual-luciferase assay</td></tr><tr><td>L-Glutamine - 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Component van volledig groeimedium</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 (Transfectiereagens 2) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Voor transfecties</td></tr><tr><td>Moleculair biologie water - 100%</td><td>VWR</td><td>02-0201-0500</td><td>Voor verdunning van shRNA-vector voor virusverpakking</td></tr><tr><td>NaCl - poeder</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>Component van LB-bouillon</td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Voor het meten van vector DNA-concentratie</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Transfectiebuffer) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Voor transfecties</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine - 10.000 Eenheid/ml (Penicilline); 10.000 &micro;g/ml (Streptomycine)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Component van volledig groeimedium</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td>Voor bacteriële mini-prep</td></tr><tr><td>Puromycine - 2.5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Voor antibioticum selectie na infectie</td></tr><tr><td>TC20 geautomatiseerde celteller</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfectiereagens (Transfectie reagens 1) - 100%</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Voor virusverpakking</td></tr><tr><td>Gistextract - poeder</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>Component van LB-bouillon</td></tr><tr><td>P3000 (Transfectie reagens 3) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Voor transfecties</td></tr></tbody></table>

identificatie van transcription factor regulators met behulp van medium-throughput screening van arrayed bibliotheken en een dual-luciferase-based reporter

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcriptie factoren kunnen veranderen de expressie van tal van doelgenen die een verscheidenheid van downstream processen waardoor ze goede doelen voor anti-kanker therapieën beïnvloeden. Echter, direct gericht transcriptie factoren is vaak moeilijk en kan leiden tot nadelige bijwerkingen als de transcriptie factor nodig is in een of meer volwassen weefsels. Het identificeren van upstream regulatoren die afwijkend activeren transcriptie factoren in kankercellen biedt een meer haalbaar alternatief, vooral als deze eiwitten zijn gemakkelijk te drogeren. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om arrayed medium-scale lentivirale bibliotheken en een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie verslaggever assay te combineren om nieuwe regelgevers van transcriptie factoren in kankercellen te identificeren. Onze aanpak biedt een snelle, eenvoudige en goedkope manier om honderden genen in één experiment te testen. Om het gebruik van deze aanpak aan te tonen, hebben we een scherm uitgevoerd van een arrayed lentivirale RNAi-bibliotheek met verschillende regelgevers van Ja-geassocieerdeiwit (YAP) en transcriptieco-activator met PDZ-bindend motief (TAZ), twee transcriptieco-activators die de downstream-effectoren van het Hippo-pad zijn. Deze benadering kan echter worden aangepast om te screenen op regelgevers van vrijwel elke transcriptiefactor of cofactor en kan ook worden gebruikt om CRISPR/CAS9-, cDNA- of ORF-bibliotheken te screenen.

Onze YAP/TAZ-TEAD reporter construct (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) bevat een minimale SV-49 promotor met 5 herhalingen van het canonieke TEAD binding element (MCAT)15 die het firefly luciferase gen aandrijft ( Figuur1). Het wordt samen met de PRL-TK-controlevector (Promega) in cellen omgezet, die Renilla luciferase uitdrukt van de cons...

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Dit protocol kan worden gebruikt om arrayed lentiviral of retroviral test bibliotheken te screenen om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren in kankercellen te identificeren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het snel, medium doorvoer, en goedkoop, en dat het gebruik maakt van apparatuur en reagentia algemeen toegankelijk voor de meeste onderzoekers. Om elke lentivirale vector in de bibliotheek uit te breiden en te zuiveren, voeg u eerst 1,3 milliliter Luria-bouillon toe, aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline aan elke put van een 96-put diepe putplaat.Inenting elk goed met twee microliters van glycerol voorraad voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 225 omwentelingen per minuut. De volgende dag, breng elke bacterie cultuur in individuele 1,5 milliliter microcentrifuge buizen voor centrifugatie. Zuiver elke vector met een geschikte bacteriële miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant.Voor elke vector in de voorbereide bibliotheek, zaad een put van een 24-put plaat met een keer 10 tot de vijfde 293FT cellen en incubeer de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Om een transfectiemengsel te bereiden dat voor elke vector in de bibliotheek zal worden opgezet, ontwijkt u eerst elke lentivirale vector tot een uiteindelijke concentratie van 50 nanogram per microliter met nuclease-vrij water. Breng vijf microliter van elke verdunning over in individuele putten van een 96-put PCR-plaat.Maak een transfectie super mix door het mengen van 1,25 microliter keer x van transfection reagens een met 23,75 microliter tijden x van voorverwarmde transfectie buffer. Incubeer de transfectie super mix op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 125 nanogram x psPAX2 en 125 nanogram keer x VSVG toe aan de supermix met zachte pipetting.Onmiddellijk aliquot de super mix in elke buis van een PCR strip en gebruik een multichannel pipet om 25 microliters van het mengsel over te brengen in elke put van verdunde virale vector. Na een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur, gebruik een multichannel pipet om 30 microliter van elk transfectiemengsel van elke put over te brengen naar een overeenkomstige put van 293FT cellen in de eerder voorbereide 24-put plaat. Broed de cellen gedurende 24 uur voordat u het medium in elke put vervangt door 500 microliters van vers volledig groeimedium voor nog eens 24-uurs incubatie in de celkweek incubator.De volgende dag, gebruik maken van een multichannel pipet om de virale supernatant te verzamelen van elke put en aliquot 220 microliters van elke supernatant in twee putten in een nieuwe 96-put plaat om een arrayed virale supernatant plaat te genereren. Om A375 cellen voor te bereiden op infectie, zaad een keer 10 tot de vijfde cellen in een 24-put plaat in 0,5 milliliter van volledige groei medium per put voor elke virale vector in de bibliotheek. Inclusief een extra put die niet zal worden besmet om te dienen als een controle voor de selectie van geneesmiddelen.Na een 24-uurs incubatie in de celkweek incubator, ontdooien de bevroren arrayed lentivirale supernatant ingesteld op kamertemperatuur voor het vervangen van de groeimedium van elke put van de voorbereide celkweekplaat met 200 microliters van groeimedium aangevuld met 20 microgram per milliliter polybrene. Met behulp van een multichannel pipet, overdracht 200 microliter van virale supernatant van elke 96 goed naar elke put van de 24-put plaat. Breng de cellen 24 tot 48 uur terug naar de celkweek incubator.Vervang aan het einde van de incubatie het medium in elke put door 500 microliters groeimedium aangevuld met puromycine en breng de cellen nog 48 uur terug naar de celkweek incubator. Na de 48-uurs puromycine selectie, sorteer de cellen in drie of vier groepen zodanig dat alle putten in een enkele groep hebben een vergelijkbare celdichtheid en voeg 200 microliter trypsin-EDTA aan een representatieve goed van elke groep voor een vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de trypsine met 400 microliters van de groei medium aangevuld met puromycine en tellen het aantal cellen van elke trypsinized goed.Verdun elke celsuspensie tot een twee keer 10 tot de vijfde cel per milliliterconcentratie met groeimedium aangevuld met puromycine en zaad 500 microliters van cellen van elk goed in dezelfde put positie in een nieuwe 24-well plaat. Na het gebruik van de tellingen van elke representatieve put om het celnummer in elke resterende goed in elke groep te schatten, voeg het juiste volume van trypsin-EDTA toe aan elke put om een een keer 10 tot de zesde cellen per milliliterconcentratie te bereiken. Gebruik tijdens de trypsinisatie een multichannel pipet om 400 microliter groeimedium aangevuld met puromycine toe te voegen aan de juiste overeenkomstige putten in de nieuwe 24-putplaat.Zodra de cellen zijn losgemaakt, voorzichtig meng de inhoud van elke put en breng 100 microliter van elke cel suspensie naar de juiste overeenkomstige goed in de nieuwe 24-put plaat. Breng de cellen vervolgens 24 uur terug naar de celkweek incubator. Om de cellen te transfecteren met de dual-luciferase reporter constructs, bereid het transfectie verdunningsmengsel zoals aangegeven in de tabel.Om het verdunningsmengsel van de verslaggever voor te bereiden, mengt u de volumes van elk reagens vermenigvuldigd met het totale aantal transfecties plus enkele extra volumes. Meng vervolgens het transfectieverdunningsmengsel met het verdunningsmengsel van de verslaggever en ontcubeer de resulterende oplossing 15 minuten bij kamertemperatuur om het transfectiemengsel te produceren. Spoel tijdens de incubatie elke put van de celkweekplaat met 250 microliter PBS en voeg 447 microliters van vers volledig groeimedium toe aan elke put.Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 53 microliters van transfectie mix te distribueren naar elke put van de celcultuurplaat. Plaats de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Om de luciferase-activiteit te meten, verdunt u de 5X-passieflysebuffer uit de luciferase-activiteitskit bij een één-op-vijf-verdunning met gedeïoniseerd water en ontdooi de benodigde volumes reagens A en reagens B-buffer uit de kit.Wanneer de reagentia klaar zijn, vervang de supernatant in elke put met 75 microliters van passieve lyse buffer en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden. Verdun tijdens de incubatie het 50X reagens B-substraat van de kit tot een één-tot-50-concentratie met ontdooide reagens B-buffer. Voeg aan het einde van de incubatie 30 microliter passieve lysebuffer toe aan vier blanco controleputten en breng 30 microliter lysaat van elke put over naar dubbele putten van een 96-put platte witte bodemtestplaat.Wanneer alle lysaat is verguld, gebruik dan een multichannel pipet om 50 microliter reagens A toe te voegen aan elke put en lees de vuurvlieg luciferase signaal met een plaatlezer. Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 50 microliter reagens B toe te voegen aan elke put en lees het Renilla luciferase signaal met een plaatlezer. Zoals verwacht verhoogt YAP2SA de activiteit van firefly luciferase, maar niet de activiteit van Renilla luciferase in vergelijking met de controlevector.Yap2SA S94A daarentegen verhoogt de activiteit van firefly luciferase niet. Belangrijk is dat YAP2SA de activiteit van een minimale promotorconstructie die de MCAT TEAD-bindingselementen mist, niet wijzigt. In cellen die met de YAP-TAZ-TEAD reporter construct zijn doorgescheurd, hebben de tandem YAP en TAZ korte haarspeldbochten het vuurvliegniveau aanzienlijk verminderd, maar de controle korte haarspeldloze controle niet.In tegenstelling, in cellen doorgescheurd met de minimale reporter constructie, de YAP-TAZ korte haarspeld RNA niet significant veranderen firefly luciferase niveaus. De Renilla signaal in elke put is ook niet significant veranderd door de korte haarspeld niet-targeting controle of de YAP-TAZ korte haarspeld RNA. Zoals verwacht vermindert korte haarspeldbo's die zich richten op YAP en TAZ, SARC of PI3 kinase de YAP-TAZ-TEAD-activiteit aanzienlijk.Korte haarspeldbo's gericht op ATM, CDH1, CSK, ERBB2 en gelsolin verhoogden elk genormaliseerde firefly luciferase niveaus in overeenstemming met gepubliceerde studies waaruit blijkt dat deze eiwitten YAP en/of TAZ waren. Ondanks gevestigde rollen voor ATR, CCNE2 en ERBB4 in andere celtypen, veranderen korte haarspeldbochten die zich richten op deze genen niet significant genormaliseerd vuurvlieggehalte in A375-cellen. Na dit scherm moeten het identificeren van regelgevers worden gevalideerd met behulp van andere uitlezingen voor hun transcriptiefactoractiviteit.Effectieve knockdown van de geïdentificeerde regulator door de test moet ook worden bevestigd. Vergeet niet voorzichtig te zijn en veiligheidsrichtlijnen te volgen bij het werken met besmettelijke lentivirussen, vooral als de virussen menselijk besmettelijk zijn.

identification-transcription-factor-regulators-using-medium

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

MicroRNA (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie en is aangetoond dat een rol spelen bij talrijke biologische processen. Om beter te begrijpen miRNA-UTR interacties, hebben we een genoom-brede collectie van drie UTR luciferase reporters gepaard met een nieuw luciferase gen en assay reagens, het LightSwitch systeem.

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor de snelle bouw van kunstmatige transcriptiefactoren (ATF) met verwante GFP verslaggevers en kwantificering van de ATFs mogelijkheid om GFP-expressie te stimuleren via flowcytometrie.

Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Hier beschrijven we een methode om een ​​gerichte siRNA "ubiquitome" scherm om nieuwe ubiquitine en ubiquitine-achtige regulatoren van de-HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren voeren. Dit kan worden aangepast aan elke biologische weg wanneer een robuuste uitlezing van reporter-activiteit beschikbaar.

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Hier stellen we een strategie voor om het effect van een transcriptiefactor van belang op het microRNA-transcriptoom te bestuderen met behulp van openbaar beschikbare gegevens, computationele bronnen en high-throughput gegevens van microRNA-arrays na het transfecteren van cellen met kleine hairpin (sh)RNA die zich richten op een transcriptiefactor van belang.

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan &gt; 1000 TFs in een enkele experiment.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.

Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Leer een medium-throughput screeningsmethode voor het identificeren van transcriptiefactorregulatoren in kankercellen met behulp van arrayed RNAi-bibliotheken en een dual-luciferase-reporterassay.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter (Video) | JoVE Journal

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Meer video's verkennen