Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Dit protocol kan worden gebruikt om arrayed lentiviral of retroviral test bibliotheken te screenen om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren in kankercellen te identificeren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het snel, medium doorvoer, en goedkoop, en dat het gebruik maakt van apparatuur en reagentia algemeen toegankelijk voor de meeste onderzoekers. Om elke lentivirale vector in de bibliotheek uit te breiden en te zuiveren, voeg u eerst 1,3 milliliter Luria-bouillon toe, aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline aan elke put van een 96-put diepe putplaat.

Inenting elk goed met twee microliters van glycerol voorraad voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 225 omwentelingen per minuut. De volgende dag, breng elke bacterie cultuur in individuele 1,5 milliliter microcentrifuge buizen voor centrifugatie. Zuiver elke vector met een geschikte bacteriële miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant.

Voor elke vector in de voorbereide bibliotheek, zaad een put van een 24-put plaat met een keer 10 tot de vijfde 293FT cellen en incubeer de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Om een transfectiemengsel te bereiden dat voor elke vector in de bibliotheek zal worden opgezet, ontwijkt u eerst elke lentivirale vector tot een uiteindelijke concentratie van 50 nanogram per microliter met nuclease-vrij water. Breng vijf microliter van elke verdunning over in individuele putten van een 96-put PCR-plaat.

Maak een transfectie super mix door het mengen van 1,25 microliter keer x van transfection reagens een met 23,75 microliter tijden x van voorverwarmde transfectie buffer. Incubeer de transfectie super mix op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 125 nanogram x psPAX2 en 125 nanogram keer x VSVG toe aan de supermix met zachte pipetting.

Onmiddellijk aliquot de super mix in elke buis van een PCR strip en gebruik een multichannel pipet om 25 microliters van het mengsel over te brengen in elke put van verdunde virale vector. Na een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur, gebruik een multichannel pipet om 30 microliter van elk transfectiemengsel van elke put over te brengen naar een overeenkomstige put van 293FT cellen in de eerder voorbereide 24-put plaat. Broed de cellen gedurende 24 uur voordat u het medium in elke put vervangt door 500 microliters van vers volledig groeimedium voor nog eens 24-uurs incubatie in de celkweek incubator.

De volgende dag, gebruik maken van een multichannel pipet om de virale supernatant te verzamelen van elke put en aliquot 220 microliters van elke supernatant in twee putten in een nieuwe 96-put plaat om een arrayed virale supernatant plaat te genereren. Om A375 cellen voor te bereiden op infectie, zaad een keer 10 tot de vijfde cellen in een 24-put plaat in 0,5 milliliter van volledige groei medium per put voor elke virale vector in de bibliotheek. Inclusief een extra put die niet zal worden besmet om te dienen als een controle voor de selectie van geneesmiddelen.

Na een 24-uurs incubatie in de celkweek incubator, ontdooien de bevroren arrayed lentivirale supernatant ingesteld op kamertemperatuur voor het vervangen van de groeimedium van elke put van de voorbereide celkweekplaat met 200 microliters van groeimedium aangevuld met 20 microgram per milliliter polybrene. Met behulp van een multichannel pipet, overdracht 200 microliter van virale supernatant van elke 96 goed naar elke put van de 24-put plaat. Breng de cellen 24 tot 48 uur terug naar de celkweek incubator.

Vervang aan het einde van de incubatie het medium in elke put door 500 microliters groeimedium aangevuld met puromycine en breng de cellen nog 48 uur terug naar de celkweek incubator. Na de 48-uurs puromycine selectie, sorteer de cellen in drie of vier groepen zodanig dat alle putten in een enkele groep hebben een vergelijkbare celdichtheid en voeg 200 microliter trypsin-EDTA aan een representatieve goed van elke groep voor een vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de trypsine met 400 microliters van de groei medium aangevuld met puromycine en tellen het aantal cellen van elke trypsinized goed.

Verdun elke celsuspensie tot een twee keer 10 tot de vijfde cel per milliliterconcentratie met groeimedium aangevuld met puromycine en zaad 500 microliters van cellen van elk goed in dezelfde put positie in een nieuwe 24-well plaat. Na het gebruik van de tellingen van elke representatieve put om het celnummer in elke resterende goed in elke groep te schatten, voeg het juiste volume van trypsin-EDTA toe aan elke put om een een keer 10 tot de zesde cellen per milliliterconcentratie te bereiken. Gebruik tijdens de trypsinisatie een multichannel pipet om 400 microliter groeimedium aangevuld met puromycine toe te voegen aan de juiste overeenkomstige putten in de nieuwe 24-putplaat.

Zodra de cellen zijn losgemaakt, voorzichtig meng de inhoud van elke put en breng 100 microliter van elke cel suspensie naar de juiste overeenkomstige goed in de nieuwe 24-put plaat. Breng de cellen vervolgens 24 uur terug naar de celkweek incubator. Om de cellen te transfecteren met de dual-luciferase reporter constructs, bereid het transfectie verdunningsmengsel zoals aangegeven in de tabel.

Om het verdunningsmengsel van de verslaggever voor te bereiden, mengt u de volumes van elk reagens vermenigvuldigd met het totale aantal transfecties plus enkele extra volumes. Meng vervolgens het transfectieverdunningsmengsel met het verdunningsmengsel van de verslaggever en ontcubeer de resulterende oplossing 15 minuten bij kamertemperatuur om het transfectiemengsel te produceren. Spoel tijdens de incubatie elke put van de celkweekplaat met 250 microliter PBS en voeg 447 microliters van vers volledig groeimedium toe aan elke put.

Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 53 microliters van transfectie mix te distribueren naar elke put van de celcultuurplaat. Plaats de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Om de luciferase-activiteit te meten, verdunt u de 5X-passieflysebuffer uit de luciferase-activiteitskit bij een één-op-vijf-verdunning met gedeïoniseerd water en ontdooi de benodigde volumes reagens A en reagens B-buffer uit de kit.

Wanneer de reagentia klaar zijn, vervang de supernatant in elke put met 75 microliters van passieve lyse buffer en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden. Verdun tijdens de incubatie het 50X reagens B-substraat van de kit tot een één-tot-50-concentratie met ontdooide reagens B-buffer. Voeg aan het einde van de incubatie 30 microliter passieve lysebuffer toe aan vier blanco controleputten en breng 30 microliter lysaat van elke put over naar dubbele putten van een 96-put platte witte bodemtestplaat.

Wanneer alle lysaat is verguld, gebruik dan een multichannel pipet om 50 microliter reagens A toe te voegen aan elke put en lees de vuurvlieg luciferase signaal met een plaatlezer. Gebruik vervolgens een multichannel pipet om 50 microliter reagens B toe te voegen aan elke put en lees het Renilla luciferase signaal met een plaatlezer. Zoals verwacht verhoogt YAP2SA de activiteit van firefly luciferase, maar niet de activiteit van Renilla luciferase in vergelijking met de controlevector.

Yap2SA S94A daarentegen verhoogt de activiteit van firefly luciferase niet. Belangrijk is dat YAP2SA de activiteit van een minimale promotorconstructie die de MCAT TEAD-bindingselementen mist, niet wijzigt. In cellen die met de YAP-TAZ-TEAD reporter construct zijn doorgescheurd, hebben de tandem YAP en TAZ korte haarspeldbochten het vuurvliegniveau aanzienlijk verminderd, maar de controle korte haarspeldloze controle niet.

In tegenstelling, in cellen doorgescheurd met de minimale reporter constructie, de YAP-TAZ korte haarspeld RNA niet significant veranderen firefly luciferase niveaus. De Renilla signaal in elke put is ook niet significant veranderd door de korte haarspeld niet-targeting controle of de YAP-TAZ korte haarspeld RNA. Zoals verwacht vermindert korte haarspeldbo's die zich richten op YAP en TAZ, SARC of PI3 kinase de YAP-TAZ-TEAD-activiteit aanzienlijk.

Korte haarspeldbo's gericht op ATM, CDH1, CSK, ERBB2 en gelsolin verhoogden elk genormaliseerde firefly luciferase niveaus in overeenstemming met gepubliceerde studies waaruit blijkt dat deze eiwitten YAP en/of TAZ waren. Ondanks gevestigde rollen voor ATR, CCNE2 en ERBB4 in andere celtypen, veranderen korte haarspeldbochten die zich richten op deze genen niet significant genormaliseerd vuurvlieggehalte in A375-cellen. Na dit scherm moeten het identificeren van regelgevers worden gevalideerd met behulp van andere uitlezingen voor hun transcriptiefactoractiviteit.

Effectieve knockdown van de geïdentificeerde regulator door de test moet ook worden bevestigd. Vergeet niet voorzichtig te zijn en veiligheidsrichtlijnen te volgen bij het werken met besmettelijke lentivirussen, vooral als de virussen menselijk besmettelijk zijn.