Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren
14 januari 2020
We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.
Onlangs is de rol van cerebrale pericyten duidelijk geworden in neurologische aandoeningen en hersenfunctie. Daarom is de ontwikkeling van een betrouwbare cultuurmethode voor deze cellen noodzakelijk. Ons protocol voor de extractie van murine cerebrale pericyten is een betrouwbaar hulpmiddel voor in vitro studies en voor het verstrekken van pericyten met een hoge zuiverheid en celopbrengst.
Het aantonen van de procedure met Anupriya Mehra zal Lucie Dehouck, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van de hersenen van een specifieke ziekteverwekker-vrije vier tot zes weken oude mannelijke C57BL/6 muis op een steriele droge pluisvrij doekje en het gebruik van gebogen tip tangen om de cerebellum, striatum en occipital zenuwen te verwijderen. Gebruik een wattenstaafje om alle zichtbare hersenvliezen te verwijderen en het hersenweefsel ondersteboven te draaien.
Open de lobben met lichte uiterlijke slagen en verwijder alle zichtbare bloedvaten. Plaats vervolgens het hersenweefsel in een 100 millimeter petrischaal met 15 milliliter koelbuffer B.To het weefsel te homogeniseren, breng het hersenmonster over in een Dounce weefselmolenmortelbuis en voeg drie tot vier milliliter wasbuffer B toe aan de buis. Gebruik een losse stamper om het weefsel 55 keer gehakt te maken, spoel de stamper vervolgens af met wasbuffer B en maak het weefsel 25 keer gehakt met een strakke stamper.
Aan het einde van de homogenisatie, even aliquot de drijfmest tussen twee 50 milliliter buizen en voeg 1,5 keer het volume van koude 30% runder serum albumin dextran. Schud vervolgens krachtig de buizen om de drijfmest te mengen. Om de vasculaire fractie te isoleren, sediment de cellen door centrifugatie en de overdracht van de supernatants in twee nieuwe buizen.
Bewaar de pellet in wasbuffer B op ijs. Resuspend de pellets in drie milliliter koude wasbuffer B op ijs. Centrifuge de geoogste supernatants en herhaal deze stap nog een keer verder.
Gooi de supernatants weg en zet de pellets opnieuw op in drie milliliters wasbuffer B.Dan pool de geresuspended pellets en breng het uiteindelijke volume van de gepoolde celsuspensie naar 10 milliliter met verse koude wasbuffer B.Verder scheiden van de cellen met een 10 millimeter pijp zes keer totdat er geen resterende klonten van pellets zichtbaar zijn en gebruik een vacuüm filter assemblage en een nylon mesh strainer om de cel suspensie filteren. Plaats de zeef in een petrischaaltje en maak het gaas leeg met verse wasbuffer B en schrapen om haarvaten terug te krijgen. Voer vervolgens een tweede filtratie uit met een vers filter.
Verdeel het filtraat gelijkmatig over twee buizen en verzamel de cellen door centrifugatie. Na het weggooien van de supernatants, pool de pellets in een enkele buis met voorverwarmde wasbuffer B met enzymen en voeg voorverwarmde Collagenase / Dispase aan de buis. Plaats de buis in een schudden tafelwaterbad voor precies 33 minuten op 37 graden Celsius voor het stoppen van de reactie met 30 milliliter koude wasbuffer B.Verzamel de cellen door centrifugatie en gooi voorzichtig de supernatant.
Snel maar voorzichtig de pellet in wasbuffer B zes keer opnieuw op te zetten en de suspensie opnieuw te centrifugeren. Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellet in 18 milliliter van volledige DMEM medium en zaad twee milliliter van cel suspensie in volledige DMEM in negen putten van drie Matrigel gecoate zes-put platen. Plaats de celculturen in een steriele 37 graden Celsius 5%koolstofdioxide incubator voor 24 uur voordat zorgvuldig verwijderen van het puin uit elke put en voeg verse DMEM media.
Na 48 uur, verander het medium in elke put om de 48 uur. Op dag acht tot 10 wanneer de cellen 100% samenvloeiing bereiken, doorvaarten de cellen in pericyte cultuurmedium op nieuwe gelatine gecoate zes-goed platen en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator voor een extra zes tot zeven dagen met monitoring. Vervolgens splits de cellen weer op dag 17 in pericyte medium in nieuwe gelatine gecoate platen.
Van passage nul tot passage twee, er zijn specifieke morfologische kenmerken waarmee de endotheelcellen en de daaropvolgende geleidelijke toename van pericyten kunnen worden geïdentificeerd. In een passage nulcultuur zijn langwerpige endotheelcellen die zich ontwikkelen uit microschepen in overvloed. Deze overvloed wordt verminderd na passage één en afwezig na passage twee.
Integendeel, pericyten verschijnen als zeldzame vierhoekige cellen in vroege culturen en worden overvloedig door passage twee. Evaluatie van de expressie van NG2, CD146 en PDGFR beta kan worden gebruikt om de zuiverheid van de pericytencultuur te beoordelen door kwantitatieve PCR, immunocytochemie en westerse vlek. De enzymvertering is een cruciale stap voor het succes van het protocol.
Zorg ervoor dat u de enzymconcentraties en incubatietijd strikt controleert.
Overzicht
Deze studie presenteert een betrouwbaar protocol voor de extractie van cerebrale pericyten van muizen, die essentieel zijn voor het begrijpen van hun rol bij neurologische aandoeningen en de hersenfunctie. De methode legt de nadruk op een antibioticumvrije verrijkingsaanpak die resulteert in een hoge zuiverheid en hoge celaantallen, waardoor het aantal benodigde experimentele dieren wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Cerebrale pericyten
- Neurologische aandoeningen
- In vitro cellulaire studies
Achtergrond
- Het belang van cerebrale pericyten voor de gezondheid van de hersenen
- Noodzaak van betrouwbare celkweekmethoden
- Uitdagingen bij bestaande extractieprotocollen
Gebruikte methoden
- Antibiotica-vrije cel-extractie
- Muismodel (C57BL/6 muis)
- Centrifugatie, enzymatische digestie en celkweek
Belangrijkste resultaten
- Hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde pericyten
- Duidelijke morfologische differentiatie tussen pericyten en endotheelcellen
- Evaluatie van de zuiverheid van de celkweek aan de hand van NG2-, CD146- en PDGFR beta-markers
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het isoleren en kweken van cerebrale pericyten van muizen
- Deze studie vergroot het inzicht in de functie van pericyten in neurologische contexten
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Betrouwbare isolatie van cerebrale pericyten met een hoge zuiverheid en opbrengst is cruciaal voor het verbeteren van de validatie van neurovasculaire targets en mechanische risicoreductie bij het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel. Dit protocol maakt schaalbare in vitro modellering van de functie en pathologie van de bloed-hersenbarrière mogelijk, wat bijdraagt aan het voorspellend vertrouwen in neurologisch onderzoek in een vroeg stadium. Extractie met een hoge opbrengst vermindert het gebruik van dieren, wat aansluit bij ethische en operationele prioriteiten in biopharma R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om pericyt-specifieke pathways te onderzoeken die betrokken zijn bij neurovasculaire aandoeningen.
- Ondersteunt functionele target-validatie door pure pericytculturen te leveren voor mechanistische studies.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets in het centraal zenuwstelsel en het reduceren van risico's bij biologische hypothesen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde pericytenkweken met een hoge opbrengst voor reproduceerbare in vitro assays.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de expressie van pericytenmarkers mogelijk voor assay-validatie.
- Ondersteunt de schaalbare preparatie van ziekterelevante cellulaire systemen voor compound-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro pericytmodellen uit met translationele biomarkerstudies in neurovasculair onderzoek.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie van mechanismen van de bloed-hersenbarrière.
- Vermindert biologische risico's in een laat stadium door de getrouwheid en voorspellende waarde van het model te verbeteren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode voor pericytenisolatie met een hoge opbrengst sluit aan bij de interface tussen vroege ontdekking en de ontwikkeling van preklinische modellen voor programma's gericht op het centrale zenuwstelsel.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot pericytenfunctie en neurovasculaire integriteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, marker-gevalideerde pericytenculturen voor de ontwikkeling van assays.
- Analytica: Maakt kwantitatieve meting van NG2, PDGFR-β en CD146-expressie mogelijk voor de beoordeling van de zuiverheid van de cultuur.
- Translationeel onderzoek: Biedt een platform om in vitro bevindingen af te stemmen op in vivo biomarkerstudies.
- Bedrijfsvoerhergebruik: Biedt een schaalbaar, gestandaardiseerd protocol dat aanpasbaar is voor diverse neurovasculaire onderzoeksteams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurovasculaire targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor pericytenkweken.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie bij de verdere ontwikkeling van het CNS-portfolio.
- Impact op het portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurovasculaire targets en modellen mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muizenbreindissectie en celkweektechnieken.
- Toegang tot infrastructuur voor centrifugatie, filtratie en moleculaire markeranalyse is noodzakelijk.
- Strikte naleving van het protocol voor enzymatische digestie en timing is vereist om de celopbrengst en zuiverheid te waarborgen.
- Standaardisatie tussen teams is essentieel voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies.
- Aanpassing aan andere diersoorten of ziektemodellen kan protocoloptimalisatie vereisen.
