Name: Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer een vertraagde inentingsmethode voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfecties bij immunocompetente muizen. Dit model onderzoekt bacteriële pathogenese zonder immuunonderdrukking of vreemd materiaal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 luminescente constructvector was een genadig geschenk van J. Hardy. Schema's zijn gemaakt met BioRender.com. Wij danken het lab van G. Gurtner voor hun advies over het wondinfectie model. We danken T. Doyle van het Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging ook voor zijn technische expertise. Dit werk werd ondersteund door subsidies R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, en subsidies van Stanford SPARK, de Falk Medical Research Trust en de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) aan P.L.B. C.R.D. werd ondersteund door T32AI007502. Een Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering en een Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship ondersteund J.M.S.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van Stanford University.
1. Voorbereiding en groei van bacteriën
<ol><li>Voer al het werk met P. aeruginosa en dieren met BSL-2 voorzorgsmaatregelen volgens de onderzoekers institutionele bioveiligheid comite en dier gebruik comité richtlijnen. Doen alle stappen beschreven hier met Betrekking tot P. aeruginosa, met inbegrip van muis inenting, in een bioveiligheid kabinet.</li>
	<li>De lichtgevende PAO1:lux stam van P. aeruginosa is op verzoek verkrijgbaar in ons lab. Streak PAO1, opgeslagen als bevroren glycerol voorraad, op Lysogeny Broth (LB) agar. Voor de lichtgevende PAO1:lux-stam moet LB agar selectieve antibiotica bevatten (100 μg/mL carbenicillin en 12,5 μg/mL kanamycine). Groei 's nachts bij 37 °C in een bacteriële couveuse.</li>
	<li>Kies een geïsoleerde kolonie en groei 's nachts bij 37 °C in 3 ml LB medium, pH 7.4. Voor lichtgevende stammen moet bouillon 100 μg/mL carbenicillin bevatten. Groeien onder schudden, aërobe omstandigheden.</li>
</ol>2. Procedurevoorbereiding
<ol><li>Laat al het personeel het uitvoeren van een operatie dragen een schone jurk / Lab jas, gezichtsmasker, haarnet, en handschoenen.</li>
	<li>Autoclave alle chirurgische instrumenten, met inbegrip van schaar en tangen. Gebruik aseptische techniek om gereedschappen tussen dieren te steriliseren.</li>
	<li>Maak de chirurgische tafel schoon met ethanol en bereid een schoon chirurgisch veld voor.</li>
</ol>3. Ontharing
<ol><li>Verdoven 8-12 week oude C57BL/6J muizen met behulp van 1%-3% isoflurane. Onderzoekers moeten volgen hun instelling veterinaire personeel richtlijnen voor anesthesie bij het gebruik van isoflurane.<ol>
<li>Begin anesthesie door het leveren van 1%-3% isoflurane en pas de zuurstofstroom snelheid aan 1,5 L /min. Plaats de muis in de inductiekamer.</li>
		<li>Knijp de teen van de muis om de diepte van anesthesie te beoordelen. Wanneer de muis niet meer reageert op stimulatie, verwijder het uit de inductiekamer en plaats deze op de chirurgische bank met zijn neus in de isoflurane neuskegel.</li>
		<li>Breng oculair smeermiddel aan op beide ogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weeg de muis om een basislijn pre-procedure gewicht te verkrijgen.</li>
	<li>Plaats de muis in een gevoelige positie. Injecteer de muis onderhuids met voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride, 250 μL aan elke flank voor een totaal van 500 μL.</li>
	<li>Scheer het ruggebied van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Scheren moet op een andere locatie dan het chirurgische station optreden om haarbesmetting van de wond te voorkomen.</li>
	<li>Breng een dun laagje ontharingslotion aan. Laat de lotion zitten voor 20-60 s. Verwijder het haar en overtollige lotion met gaas bevochtigd in warm water. Na ontharing gaat u over tot de excisional eerprocedure.</li>
</ol>4. Volledige dikte excisional wondchirurgie
<ol><li>Injecteer aanhoudende afgifte buprenorfine 0,6–1 mg/kg onderhuids met behulp van een 25 G naald in het midden van de rugstreek van de muis. Slow release buprenorfine biedt pijnverlichting over 48-72 uur.</li>
	<li>Desinfecteer de chirurgische plaats. Veeg het dorsale oppervlak af met een steriel betadine-wattenstaafje. Veeg overtollige betadine af met een steriel alcoholuitstrijkje. Dit moet 3 keer worden uitgevoerd (afwisselend tussen betadine en alcohol), wattenstaafjes door van het centrum op een cirkelvormige manier naar de rand te gaan. Laat het gebied drogen.</li>
	<li>Maak een gordijnen rond de chirurgische site met behulp van steriele gaas of plastic vastklampen wrap.</li>
	<li>Rek de huid strak strak. Gebruik een steriele huidbiopsiepunch met een diameter van 6 mm om een eerste incisie te maken via de linker rugopperhuid. Herhaal op de rechter rugopperhuid.</li>
	<li>Gebruik tangen om de huid tent vanuit het midden van de linker geschetste wond gebied. Accijnzen de epidermale en dermale lagen met behulp van schaar. Herhaal op het recht geschetste wondgebied om symmetrische excisional wonden te creëren.</li>
	<li>Was wonden met 50 μL steriele zoutlijn. Laat de chirurgische plaats en de omliggende huid drogen. Bedek vervolgens de wonden en het dorsum met een transparante filmdressing.</li>
	<li>Plaats de muis terug in een schone kooi. Huis 1 dier per kooi.</li>
	<li>Plaats de kooi op een verwarmingskussen en monitor tot de muis wakker wordt.</li>
	<li>Bij het uitvoeren van de bovenstaande operatie op meerdere dieren, gebruik maken van een hete kraal sterilisator om alle chirurgische instrumenten tussen dieren schoon te maken.</li>
	<li>Laat 24 uur voor de muizen om te herstellen van de chirurgische ingreep en voor de vorming van een voorlopige wondmatrix over de wonden voorafgaand aan de procedure inenting met bacteriën.</li>
</ol>5. Inenting met P. aeruginosa
<ol><li>Verdun 's nachts PAO1:lux cultuur tot OD600 = 0,05 in 75 mL LB media met 100 μg/mL carbenicillin en laat de bacteriën groeien totdat de cultuur zich in een vroege exponentiële fase bevindt (OD600 ∙ 0,3). Dit duurt ongeveer 2-3 uur.</li>
	<li>Verdun PAO1:lux in PBS tot een concentratie van (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Zorg ervoor dat overtollige inoculum voor te bereiden om voldoende volume te garanderen en voor beplating na het experiment. Als het vervoer tussen faciliteiten (d.w.z. van het laboratorium naar het vivarium), gebruik dubbele insluiting in een lek bewijs doos duidelijk gemarkeerd Biohazard.</li>
	<li>Voer al het werk uit met P. aeruginosa en muizen met behulp van goedgekeurde persoonlijke beschermingsmiddelen in een dierbioveiligheidsniveau 2 (ABSL-2) goedgekeurde biologische veiligheidskast (BSC). Herbruikbare apparatuur, zoals de weegschaal, moet worden bedekt met kleeffolie om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Verdovende isoflurane met behulp van 3% isoflurane zoals hierboven beschreven. Weeg de muis en neem het gewicht op. Injecteer de muis onderhuids met voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride, 250 μL aan elke flank voor een totaal van 500 μL.</li>
	<li>Als de transparante filmdressing van de muis 's nachts is uitgeschakeld, verwijder dan de resulterende korst voorzichtig en trek een nieuwe dressing aan.</li>
	<li>Gebruik een 500 μL tuberculine 27 G veiligheidsdopspuit om 40 μL van de PAO1:lux suspensie te injecteren door de transparante foliedressing in elke wond. Verschillende muizen moeten worden gebruikt voor niet-ingeënte/PBS-wondcontroles om kruisbesmetting van de contralaterale kant te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de muis terug in de kooi op een verwarmingskussen en monitor totdat hij wakker wordt. Alle muizen moeten individueel in aparte kooien worden ondergebracht om kruisbesmetting te voorkomen.</li>
	<li>Zorg voor calorierijke voedingssupplement pasta ingeklemd tussen voedsel pellets op de vloer van de kooi.</li>
	<li>Gebruik het resterende inoculum om een LB agar plaat streep. Tel kolonies om het aantal toegediende bacteriën te bevestigen.</li>
</ol>6. In vivo beeldvorming van geïnfecteerde wonden
<ol><li>Volg BSL-2 containmentprotocollen voor het vervoer van muizen van en naar het beeldinstrument, inclusief het gebruik van een secundaire container. Zorg ervoor dat geen dierlijk beddengoed wordt overgebracht of laten vallen tijdens de overdracht van de muis naar de inductiekamer of het beeldvormingsinstrument.</li>
	<li>Induceer anesthesie van de muis met ingeademde 1%–3% isoflurane in een inductiekamer zoals beschreven in stap 3.1.</li>
	<li>Zodra de muis is verdoofd, plaats het in gevoelige positie in de beeldkamer van een optisch beeldvormingssysteem met de neus in de isoflurane neuskegel.</li>
	<li>Open het softwareprogramma.</li>
	<li>De acquisitieparameters variëren afhankelijk van het aantal dieren dat tegelijkertijd wordt afgebeeld en de intensiteit van bioluminescentie. De basisparameters die moeten worden ingesteld zijn belichtingstijd, binning, f/stop en gezichtsveld (FOV). Onze standaard startinstellingen zijn belichtingstijd 30 seconden, binning low (2), f/stop 1.2 en FOV 25. Pas deze instellingen zo nodig aan, afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker.</li>
	<li>Analyseer luminescentiegegevens met behulp van een beeldvormingsprogramma (zie Tabel met materialen). Luminescentie zal worden weergegeven als een pseudocolor beeld bedekt op een kleurenfoto van de muizen.<ol>
<li>Maak een regio van belang (ROI) op de wondplaats en meet de gemiddelde flux (fotonen/seconde) gedetecteerd. Houd er rekening mee dat gegevens ook kunnen worden gerapporteerd als uitstraling (fotonen/seconde/cm²/steradian), maar zolang de afstand van het beeldplatform van de camera constant blijft tussen beeldvorming, is flux voldoende.</li>
		<li>Meet de achtergrond door een ROI te maken op een willekeurig gebied op het imagingplatform. Trek het achtergrondnummer van fotonen/seconde af.</li>
		<li>Exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer beeldvorming zoals hierboven beschreven zo vaak als dagelijks om infectie progressie bij te houden.</li>
</ol>7. Postoperatief beheer
<ol><li>Monitor muizen volgens richtlijnen die zijn vastgesteld door het IACUC-protocol van de onderzoeker. We monitoren alle muizen dagelijks gedurende de eerste 4 dagen, dan om de andere dag tot het einde van het experiment. Weeg de muizen eenmaal per dag voor de eerste 4 dagen na de operatie in een BSC. Injecteer 250 μL van 0,9% natriumchloride onderhuids op de post-infectiedagen 1 en 2.</li>
	<li>Controleer op tekenen van pijn / nood bij de muizen, met inbegrip van gebogen houding, smerig jas, lethargie, moeite met ademhalen, gezichtsgrimas, en gewichtsverlies.</li>
	<li>Als dieren tekenen vertonen van een verslechterende gezondheid, neem dan contact op met een dierenarts. Elke muis die lijkt te vertonen verergerende tekenen van pijn / nood en een gewichtsverlies van 20% of meer moet worden geëuthanaseerd.</li>
</ol>8. Wondexcisie
<ol><li>Offer aan het einde van het experiment de muizen op met CO 2-inademing, gevolgd door cervicale dislocatie. Gooi het karkas van het dier weg volgens de ABSL-2-protocollen van de instelling.</li>
	<li>Accijns wondbedden met behulp van steriele schaar en tangen in een BSC. Plaats elk wondbed in 1 mL steriel PBS in een polypropyleenbuis van 1,5 mL. Hak het wondweefsel fijn met een schaar. Alle wonden moeten worden behandeld als ASBL-2, zelfs als ze niet als besmet worden beschouwd.</li>
	<li>Incubeer op een shaker bij 300 tpm voor 2 uur bij 4 °C. Vortex elke buis voor 10 s en serieel verdunnen van de bacteriële effluent in PBS. Bekeer het verdunde bacteriële effluent op LB agar om de bacteriële last op te sommen.</li>
	<li>Overweeg wonden besmet als luminescent signaal in de wond is boven de achtergrond luminescentie en meer bacteriën worden gedetecteerd in de wond effluent dan in wonden ingeënt met PBS als controle.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.

We hebben een nieuwe vertraagde inenting P. aeruginosa wondinfectie model. De strategie van het uitstellen van inenting met bacteriën tot 24 uur na excisional wondwond maakt de evaluatie van wondinfecties over een tijdsbestek van 1 week mogelijk. Door gebruik te maken van een lichtgevende stam van P. aeruginosa,is het mogelijk om infectieprogressie tijdens de infectiecursus te volgen. Het langere verloop van de infectie in vergelijking met andere P. aeruginosa infectie modellen zal nieuwe mogel...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een gram-negatieve staafvormige bacterie met toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte. Het is verantwoordelijk voor uitgebreide morbiditeit en mortaliteit in nosocomiale omgevingen, met name met wondinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten1,2. De opkomst van multiresistente stammen van deze ziekteverwekker heeft een verdere impuls gegeven voor onderzoek naar factoren die bijdragen aan p. aeruginosa virulentie, mechanismen van P. aeruginosa antibioticaresistentie, en nieuwe methoden voor preventie en behandeling van deze dodelijke infectie3. Als zodanig is de behoefte aan diermodellen van chronische wondinfectie als instrumenten voor het onderzoeken van deze onderzoeksvragen nog nooit zo groot geweest.
Helaas hebben veel diermodellen van P. aeruginosa-infectie de neiging om acute infectie te simuleren met een snelle oplossing van infectie of snelle afname als gevolg van sepsis4,5, die de vaak chronische aard van deze infecties niet voldoende simuleert. Om dit nadeel aan te pakken, maken sommige modellen gebruik van de implantatie van vreemde lichamen zoals agarkralen, siliconenimplantaten of alginaatgels6,7,8. Andere modellen maken gebruik van muizen die immuungecompromitteerd zijn als gevolg van gevorderde leeftijd, obesitas of diabetes, of via farmacologische middelen zoals cyclofosfate-geïnduceerde neutropenie9,10,11,12. Echter, ofwel het gebruik van vreemde materialen of immuun gecompromitteerde gastheren waarschijnlijk verandert de lokale ontstekingsproces, waardoor het moeilijk is om een goed begrip van de pathofysiologie die betrokken zijn bij chronische wondinfecties in gastheren met anders normaal immuunsysteem te krijgen.
We hebben een chronisch model van P. aeruginosa wondinfectie bij muizen die vertraagde inenting met bacteriën na excisional wond impliceert. Vertraagde inenting maakt experimenten met bacteriële last en zich uitstrekt tot ten minste 7 dagen mogelijk. Dit model opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van zowel pathogenese als nieuwe behandelingen van P. aeruginosa chronische infecties.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injectie</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 steriele naald</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 steriele naald</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol wattenstaafje</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mannelijke muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Wegwaarpuns voor wegwerpbiopsie, 6 mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar - Tungsten Carbide</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Glaskralen Droogsterilisator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Gegranuleerde Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Insulinespuit met 28 G naald</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Imaging System</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB-broth</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1 mL-sering</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Dierentrimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Haarverwijderingslotion met Baby Oil</td><td>Church and Dwight</td><td>n/a</td><td>Beschikbaar in elke apotheek</td></tr><tr><td>Octagontang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Press and Seal Plasticfolie</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide Insulinespuit met 30 G naald</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide Insulinespuit, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Supplical voedingssupplement</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

een vertraagde inenting model van chronische pseudomonas aeruginosa wondinfectie

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een belangrijke nosocomiale ziekteverwekker van toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte, met name bij het instellen van chronische wondinfecties bij diabetes en gehospitaliseerde patiënten. Er is dringend behoefte aan chronische infectiemodellen om te helpen bij het onderzoek naar wondpathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen deze ziekteverwekker. Hier beschrijven we een protocol dat 24 uur na het voldikte excisional verwonden gebruik maakt van vertraagde inenting. De infectie van de voorlopige wondmatrix die op dit moment aanwezig is, verhindert ofwel snelle klaring of verspreiding van infectie en zorgt in plaats daarvan voor chronische infectie die 7-10 dagen duurt zonder dat er geen vreemde materialen of immuunonderdrukking nodig zijn. Dit protocol bootst een typisch temporele loop van postoperatieve infectie bij mensen na. Het gebruik van een lichtgevende P. aeruginosa stam (PAO1:lux) maakt een kwantitatieve dagelijkse beoordeling van bacteriële last voor P. aeruginosa wondinfecties mogelijk. Dit nieuwe model kan een nuttig instrument zijn in het onderzoek naar bacteriële pathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor chronische P. aeruginosa-wondinfecties.

Met behulp van een lichtgevende stam van PAO1 met een plasmid codering van de luxABCDE reporter systeem (PAO1:lux), voerden we excisional verwonden op muizen, ingeënt deze wonden met planktonische P. aeruginosa 24 uur later, en gemeten bacteriële last na verloop van tijd(Figuur 1 en figuur 2). Een representatief beeld verkregen met behulp van een imaging optisch systeem toont aan dat dit model resulteert in detecteerbare...

We beschrijven een vertraagd inentingsprotocol voor het genereren van chronische wondinfecties bij immunocompetente muizen.

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een model voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie beschrijft zonder de noodzaak van vreemde materiële implantatie of immuunonderdrukking. Vertraagde inenting met Pseudomonas aeruginosa 24 uur na volledige dikte excisional wounding prostalls de snelle klaring en verspreiding van de bacteriën, tot vaststelling van een infectie die zeven tot 10 dagen duurt. Dit unieke model zal een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van bacteriële pathogenese, interacties met gastheerpathogen en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfecties.Mij helpen bij een demonstratie van de procedure zal Dan Liu zijn, een medische student van het Bollyky Laboratorium. Weeg voor het begin van de procedure een verdoofde acht tot twaalf weken oude muis om een basisgewicht te verkrijgen en plaats de muis in de gevoelige positie. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex, injecteer de muis onderhuids met 250 microliter voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride op elke flank.Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar te verwijderen uit het dorsale gebied van de muis en breng een dunne laag ontharingscrème aan op de blootgestelde huid. Verwijder na 20 tot 60 seconden het haar en overtollige lotion met gaas bevochtigd in warm water. Voor volledige dikte excisional wondchirurgie, eerst gebruik maken van een 25-gauge naald onderhuids injecteren 0,6 tot een milligram per kilogram aanhoudende release buprenorfine op het midden van de rug gebied van de muis en veeg de chirurgische site in een cirkelvormige manier met drie alternatieve steriele Betadine en alcohol swabs.Plaats een plastic klamp-wrap drap over de chirurgische site en strek de huid strak caudally. Wanneer de huid is gedroogd, gebruik maken van een steriele zes millimeter diameter huidbiopsie punch om een eerste incisie te maken door de linker dorsale epidermis, gevolgd door een tweede incisie op de rechter dorsale opperhuid. Gebruik tangen om de huid tent vanuit het midden van de links geschetste wond gebied en gebruik schaar om de epidermale en huidlagen accijns.Na het herhalen van de incisie op het rechter geschetste wondgebied om symmetrische excisiewonden te creëren, was beide wonden met 50 microliters steriele zoutoplossing. Wanneer de chirurgische plaats en de omringende huid zijn opgedroogd, bedek de wonden en dorsum met een transparante filmverband en plaats de muis in een schone kooi op een verwarmingskussen met controle tot volledige recumbency. 24 uur na de operatie, weeg de opnieuw verdoofde muis opnieuw en injecteer het dier onderhuids met 250 microliters van voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride in beide flanken.Laad vervolgens 100 microliters van de lichtgevende P.aeruginosa-stamsuspensie in een 500 microliter tuberculine veiligheidsdop spuit uitgerust met een 27-meterige naald en injecteer 40 microliter bacteriën suspensie door de transparante film dressing in elke wond. Zorg ervoor dat de bacteriële suspensie goed gemengd is en dat de transparante dressing intact is. Zorg ervoor dat u de transparante dressing slechts één keer doorboort met de naaldbezelkant omhoog.Dan terug de muis naar zijn kooi op een verwarming pagina met monitoring en bieden calorierijke voedingssupplement pasta ingeklemd tussen voedsel pellets op de vloer van de kooi. Plaat het resterende entmateriaal op een LB agar plaat en tel de kolonies om het aantal bacteriën die zijn toegediend te bevestigen. Voor in vivo beeldvorming van de geïnfecteerde wonden, volg bio veiligheid niveau twee insluiting protocollen voor het vervoer van de muizen van en naar het beeldvormingsinstrument en plaats de verdoofde muis in de gevoelige positie binnen de beeldvormingskamer.Stel in de beeldsoftware de belichtingstijd, binning, f-stop en gezichtsveld in, indien van toepassing voor het experiment. Maak vervolgens een interessegebied op de wondplaats en meet de gemiddelde gedetecteerde flux in fotonen per seconde. Als u de achtergrond wilt meten, maakt u een gebied dat van belang is voor een willekeurig gebied op het beeldvormingsplatform en trekt u het achtergrondaantal fotonen per seconde af.Gebruik aan het einde van het experiment in een bioveiligheidskast steriele scharen en tangen om de wondbedden weg te snijden en elk bed in één milliliter steriele PBS in een 1,5 milliliter polypropyleenbuis te plaatsen. Hak het wondweefsel met een schaar fijn en broed de weefselstukken op een shaker bij vier graden Celsius in 300 rotaties per minuut gedurende twee uur. Aan het einde van de incubatie, vortex elke buis gedurende 10 seconden voordat serieel verdund het bacteriële effluent in PBS en plating het verdunde bacteriële effluent op LB agar om de bacteriële last te kwantificeren.Dit representatieve beeld verkregen met behulp van een imaging optisch systeem toont aan dat dit model resulteert in detecteerbare luminescentie. In dit experiment piekte de infectie op dag drie na de inenting en hield zeven dagen na inenting voort op basis van zowel de bioluminescentie als de kolonietellingen. Cultuur van de bacteriën geïsoleerd uit de wond verder aan te tonen dat de gekwantificeerde kolonie vormen eenheden per wond correleren met de gedetecteerde luminescentie.Hoewel er een eerste snelle gewichtsverlies onmiddellijk na de injectie, zout injecties en aanvullende voeding kan de muizen te herstellen naar hun eerste gewichten. De berekende inentingsdosis waarvan 50% van de wonden wezenlijk besmet zal raken, is vastgesteld op ongeveer 7,7 keer 10 tot de tweede kolonie die eenheden per milliliter vormt. Doses hoger dan een keer 10 tot de vierde kolonie vormen eenheden per milliliter resulteren in een 100%-infectie tarief.Verschillende actuele en systemische behandelingen kunnen worden toegepast na de wond- en inentingsprocedures om nieuwe potentiële therapieën voor Pseudomonas aeruginosa te onderzoeken. Al het werk met Pseudomonas aeruginosa en geïnfecteerde muizen moet worden uitgevoerd met BSL-2 veiligheidsmaatregelen in overeenstemming met de richtlijn institutionele bioveiligheid van de onderzoeker en het comité voor diergebruik.

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: de Vries, C. R., et.al. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the delayed inoculation of luminescent Pseudomonas aeruginosa into a mouse bearing two full-thickness dorsal skin wounds covered by a transparent film dressing. This facilitates biofilm formation and the establishment of chronic infection. Regular bioluminescence monitoring enables quantification of bacterial burden and tracking of infection...

Developing a Mouse Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Skin Wound Infection 

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Hier beschrijven we een roman diabetische lymfkliertest model met behulp van haarloze muizen voor real-time, niet-invasieve, bewaking van biofilm wond infecties van bioluminescente Pseudomonas aeruginosa. Deze methode kan worden aangepast aan de infectie van andere bacteriesoorten en genetisch gemodificeerde micro-organismen, met inbegrip van meerdere soorten biofilms, evalueren en testen van de werkzaamheid van antibiofilm strategieën.

Aan de kant van licht komen: In Vivo Monitoring van Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecties in chronische wonden in een diabetische haarloze lymfkliertest Model

Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.

Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

Chronische wonden zijn ontwikkeld uit acute wonden op een diabetische muismodel door het induceren van hoge niveaus van oxidatieve stress na een full-dikte cutane wond. De wond wordt behandeld met remmers voor katalase en glutathion peroxidase, resulterend in verminderde genezing en biofilm ontwikkeling door bacteriën aanwezig in de huid microbiome.

Protocol voor het maken van chronische wonden bij diabetische muizen

Periprothetische gewrichtsinfectie (PJI) veroorzaakt door gevaarlijke ziekteverwekkers komt vaak voor in de klinische orthopedie. Bestaande diermodellen kunnen de werkelijke situatie van PJI niet nauwkeurig simuleren. Hier hebben we een Candida albicans biofilm-geassocieerd PJI-muismodel opgezet om nieuwe therapieën voor PJI te onderzoeken en te ontwikkelen.

Een periprothetisch gewrichtsinfectiemodel van Candida albicans bij muizen

Chronische wonden die resistent zijn tegen antibiotica vormen een grote bedreiging voor de gezondheidszorg. Biofilminfecties zijn hardnekkig en vijandig en kunnen een gebrekkige functionele wondsluiting veroorzaken. We rapporteren een klinisch relevant varkensmodel van biofilm-geïnfecteerde chronische wonden van volledige dikte. Dit model is zowel krachtig voor mechanistische studies als voor het testen van interventies.

Varkensmodel van biofilminfectie en onzichtbare wonden

Er is momenteel een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infecties. Hier beschrijven we een protocol voor wondinfectie door een Pseudomonas aeruginosa klinisch isolaat om een persisterende infectie bij zebravislarven te genereren.

Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Leer een vertraagde inentingsmethode voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfecties bij immunocompetente muizen. Dit model onderzoekt bacteriële pathogenese zonder immuunonderdrukking of vreemd materiaal.

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Meer video's verkennen