Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Dit protocol is belangrijk omdat het een model voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie beschrijft zonder de noodzaak van vreemde materiële implantatie of immuunonderdrukking. Vertraagde inenting met Pseudomonas aeruginosa 24 uur na volledige dikte excisional wounding prostalls de snelle klaring en verspreiding van de bacteriën, tot vaststelling van een infectie die zeven tot 10 dagen duurt. Dit unieke model zal een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van bacteriële pathogenese, interacties met gastheerpathogen en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfecties.

Mij helpen bij een demonstratie van de procedure zal Dan Liu zijn, een medische student van het Bollyky Laboratorium. Weeg voor het begin van de procedure een verdoofde acht tot twaalf weken oude muis om een basisgewicht te verkrijgen en plaats de muis in de gevoelige positie. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex, injecteer de muis onderhuids met 250 microliter voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride op elke flank.

Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar te verwijderen uit het dorsale gebied van de muis en breng een dunne laag ontharingscrème aan op de blootgestelde huid. Verwijder na 20 tot 60 seconden het haar en overtollige lotion met gaas bevochtigd in warm water. Voor volledige dikte excisional wondchirurgie, eerst gebruik maken van een 25-gauge naald onderhuids injecteren 0,6 tot een milligram per kilogram aanhoudende release buprenorfine op het midden van de rug gebied van de muis en veeg de chirurgische site in een cirkelvormige manier met drie alternatieve steriele Betadine en alcohol swabs.

Plaats een plastic klamp-wrap drap over de chirurgische site en strek de huid strak caudally. Wanneer de huid is gedroogd, gebruik maken van een steriele zes millimeter diameter huidbiopsie punch om een eerste incisie te maken door de linker dorsale epidermis, gevolgd door een tweede incisie op de rechter dorsale opperhuid. Gebruik tangen om de huid tent vanuit het midden van de links geschetste wond gebied en gebruik schaar om de epidermale en huidlagen accijns.

Na het herhalen van de incisie op het rechter geschetste wondgebied om symmetrische excisiewonden te creëren, was beide wonden met 50 microliters steriele zoutoplossing. Wanneer de chirurgische plaats en de omringende huid zijn opgedroogd, bedek de wonden en dorsum met een transparante filmverband en plaats de muis in een schone kooi op een verwarmingskussen met controle tot volledige recumbency. 24 uur na de operatie, weeg de opnieuw verdoofde muis opnieuw en injecteer het dier onderhuids met 250 microliters van voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride in beide flanken.

Laad vervolgens 100 microliters van de lichtgevende P.aeruginosa-stamsuspensie in een 500 microliter tuberculine veiligheidsdop spuit uitgerust met een 27-meterige naald en injecteer 40 microliter bacteriën suspensie door de transparante film dressing in elke wond. Zorg ervoor dat de bacteriële suspensie goed gemengd is en dat de transparante dressing intact is. Zorg ervoor dat u de transparante dressing slechts één keer doorboort met de naaldbezelkant omhoog.

Dan terug de muis naar zijn kooi op een verwarming pagina met monitoring en bieden calorierijke voedingssupplement pasta ingeklemd tussen voedsel pellets op de vloer van de kooi. Plaat het resterende entmateriaal op een LB agar plaat en tel de kolonies om het aantal bacteriën die zijn toegediend te bevestigen. Voor in vivo beeldvorming van de geïnfecteerde wonden, volg bio veiligheid niveau twee insluiting protocollen voor het vervoer van de muizen van en naar het beeldvormingsinstrument en plaats de verdoofde muis in de gevoelige positie binnen de beeldvormingskamer.

Stel in de beeldsoftware de belichtingstijd, binning, f-stop en gezichtsveld in, indien van toepassing voor het experiment. Maak vervolgens een interessegebied op de wondplaats en meet de gemiddelde gedetecteerde flux in fotonen per seconde. Als u de achtergrond wilt meten, maakt u een gebied dat van belang is voor een willekeurig gebied op het beeldvormingsplatform en trekt u het achtergrondaantal fotonen per seconde af.

Gebruik aan het einde van het experiment in een bioveiligheidskast steriele scharen en tangen om de wondbedden weg te snijden en elk bed in één milliliter steriele PBS in een 1,5 milliliter polypropyleenbuis te plaatsen. Hak het wondweefsel met een schaar fijn en broed de weefselstukken op een shaker bij vier graden Celsius in 300 rotaties per minuut gedurende twee uur. Aan het einde van de incubatie, vortex elke buis gedurende 10 seconden voordat serieel verdund het bacteriële effluent in PBS en plating het verdunde bacteriële effluent op LB agar om de bacteriële last te kwantificeren.

Dit representatieve beeld verkregen met behulp van een imaging optisch systeem toont aan dat dit model resulteert in detecteerbare luminescentie. In dit experiment piekte de infectie op dag drie na de inenting en hield zeven dagen na inenting voort op basis van zowel de bioluminescentie als de kolonietellingen. Cultuur van de bacteriën geïsoleerd uit de wond verder aan te tonen dat de gekwantificeerde kolonie vormen eenheden per wond correleren met de gedetecteerde luminescentie.

Hoewel er een eerste snelle gewichtsverlies onmiddellijk na de injectie, zout injecties en aanvullende voeding kan de muizen te herstellen naar hun eerste gewichten. De berekende inentingsdosis waarvan 50% van de wonden wezenlijk besmet zal raken, is vastgesteld op ongeveer 7,7 keer 10 tot de tweede kolonie die eenheden per milliliter vormt. Doses hoger dan een keer 10 tot de vierde kolonie vormen eenheden per milliliter resulteren in een 100%-infectie tarief.

Verschillende actuele en systemische behandelingen kunnen worden toegepast na de wond- en inentingsprocedures om nieuwe potentiële therapieën voor Pseudomonas aeruginosa te onderzoeken. Al het werk met Pseudomonas aeruginosa en geïnfecteerde muizen moet worden uitgevoerd met BSL-2 veiligheidsmaatregelen in overeenstemming met de richtlijn institutionele bioveiligheid van de onderzoeker en het comité voor diergebruik.