Monitoring PD-1-Blocking Antilichamen gebonden aan T-cellen afgeleid van een druppel perifeer bloed

Omdat deze methode PD-1-blokkerende antilichaamgebonden cellen bepaalt met behulp van perifeer bloed van patiënten, kan de specifieke subset worden geïdentificeerd die verantwoordelijk is voor antitumor-effecten en immuungerelateerde bijwerkingen. Deze methode heeft slechts een kleine hoeveelheid bloedmonster nodig en het analyseproces is vrij eenvoudig en snel. Het heeft alleen een flow cytometrie machine nodig.

Om te beginnen, verzamelen van bloedmonsters in bloedafname buizen met EDTA. Behandel elke vijf milliliter ronde bodem polystyreen stroom cytometrie buis met een milliliter van 2%foetale runder serum in PBS. Vortex voor 10 seconden.

Breng vervolgens 20 microliter volbloedmonsters over naar de behandelde vijf milliliter ronde bodembuizen. Voeg 20 microliter van 2%FBS toe aan PBS en 10 microliter van mens-specifieke FC receptor blokkeren reagens. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 500 microliters van rode bloedcel lyse buffer. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg vier milliliter van 2%FBS toe in PBS en spin down cellen op 400 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder de supernatant door aspiratie. Herhaal het was- en aspiratieproces. Resuspend de cellen in 100 microliters van 2%FBS in PBS en verdeel in twee buizen van 50 microliters elk.

Voeg antistoffen met oppervlaktemarkering toe. Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was monsters tweemaal in 2% FBS in PBS zoals voorheen.

Resuspend de cellen in 200 microliters van 2%FBS in PBS. Steek de buizen in de stroomcytometer en verwerf cellen volgens het aanbevolen protocol. Record 10.000 gebeurtenissen als de lymfocyten poort en export stroom gegevens als FCS bestanden voor analyse.

Open bestanden in de analysesoftware en klik op het bestand van isotypebesturingselement om de cellen te visualiseren op een voorwaartse spreiding versus zijverstrooiingsplot en poortlymfocyten. Selecteer enkele cellen met FSCH versus FSCW en SSCH versus SSCW en geef ze weer op een CD3 versus CD8 of CD3 versus CD4 plot. Poort respectievelijk de CD8 T-cellen en CD4 T-cellen.

Selecteer de gated cellen en geef ze weer op een PD-1 versus menselijke IgG4 plot. En selecteer vervolgens op basis van isotypecontrole Q3 om PD-1-blokkerende antilichaamgebonden CD8- en CD4 T-cellen te identificeren. In deze studie, de gating strategie en flow cytometrie analyse gedetecteerd PD-1-blokkerende antilichaam binding aan T-cellen verkregen uit een druppel van de patiënt perifere bloed.

De PD-1 versus menselijke IgG4 plot toont de bindende status van PD-1-blokkerende antilichamen op T-cellen. Oranje stippen en zwarte stippen geven respectievelijk anti-IgG4-antilichaam en isotype controle kleuring aan. Voordat PD-1-blokkerend antilichaam werd toegediend, waren er geen menselijke IgG4-positieve CD8- of CD4 T-cellen aanwezig en pd-1-expressie werd bevestigd door een PD-1 detecterend antilichaam.

Na nivolumab of pembrolizumab toediening kan IgG4 op T-cellen worden gedetecteerd door anti-IgG4-antilichaam, terwijl de PD-1 die antilichaam EH12.1 detecteert geen PD-1 op T-cellen herkent. De rode, blauwe en groene poorten geven respectievelijk volledige binding, gedeeltelijke binding en verlies van binding aan. Nadat patiënten nivolumab en pembrolizumab stopten, daalde de status van PD-1-blokkerende antilichaambinding aan CD8 T-cellen.

Er was gedeeltelijke binding en uiteindelijk volledig verlies van binding. Zorg ervoor dat u het bloedmonster ook met RBC lyse mengt. Ook het mengen van de RBC lysis voor het oppervlak marker vlekken is de belangrijkste stap in deze methode.

Als de onderzoeker toegang heeft tot een geavanceerde stroomcytometriemachine, kunnen PD-1-blokkerende antilichaamgebonden T-cellen worden geëvalueerd met steeds meer markers met betrekking tot Deze strategie kan worden toegepast voor het profileren van T-cel fenotypes die verantwoordelijk zijn voor bijwerkingen veroorzaakt door PD-1-blokkerende antilichamen. Bemonstering van patiënten met ontwikkelde bijwerkingen is belangrijk om het nut van deze strategie te evalueren.