Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

Dit is een zeer nauwkeurige en kosteneffectieve methode voor het begrijpen van genexpressie op het niveau van één cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we 96 monsters in één batch kunnen monteren. Dit hoge aantal monsters stelt ons in staat om cellulaire subfennotypes te identificeren met een anatomische specificiteit.

De pijplijn van deze methode kan worden toegepast op elk biologisch probleem, elk systeem, elk weefsel, om te informeren naar de individuele cellulaire respons van individuele neuronen of andere celtypen op ziekte of enige andere verstoring, elke functie. En ga dan verder en vraag of die celreacties een anatomische architectuur hebben. Verwijder de hersenen uit de weefselopvang en plaats op de cryostat chuck.

Verzamel 10 micron secties met de centrale kern van de amygdala of andere voorkeur hersengebied door dooi montage 10 micron secties op gewone glazen platen. Plaats de glazen glijbanen onmiddellijk op een metalen pan die op droogijs rust. Zet de dia's met hersensecties zo snel mogelijk in een min 80 graden Celsius vriezer.

Om een ethanol- en xyleen-uitdrogingsserie uit te voeren, dompelt u de glijbanen eerst gedurende 30 seconden in 75% ethanol. Onmiddellijk daarna, dip de dia's in 95%ethanol gedurende 30 seconden. Dan dip de dia's in 100% ethanol gedurende 30 seconden.

Tot slot, dip de glijbanen direct in een tweede container van 100% ethanol gedurende 30 seconden. Na de ethanol uitdroging serie, dip de glijbanen in vers gegoten xyleen voor een minuut. Onmiddellijk daarna, dip de dia's in een tweede container van xyleen gedurende vier minuten voor het drogen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik fluorescentie om het gekleurde celtype en de kern ervan in het gebied van belang te identificeren. Kies één cel of meerdere cellen als u monsters met één cel hebt samengevoegd. Markeer de cellen van belang met behulp van laser capture microdissection of LCM software.

Plaats de LCM-dop bovenop het segment op het interessegebied en smelt de LCM-doplijm over het gebied van de geselecteerde cel zoals beschreven in het tekstprotocol. Selecteer de afzonderlijke cellen die moeten worden verzameld voor analyse met behulp van de LCM-softwaretools. Geselecteerde cellen moeten zich in het anatomische gebied van de centrale kern van de amygdala bevinden op basis van de atlas van de rattenhersenen en de bregma.

Cellen moeten ten minste drie micron uit de aangrenzende gekleurde kernen. Dan vuur de infrarood laser om de geïdentificeerde enkele cellen te verzamelen. Plaats de dop in het QC-station en bekijk deze om ervoor te zorgen dat alleen de gewenste cellen zijn geselecteerd.

Als andere cellen per ongeluk zijn geselecteerd, kan een ultraviolette laser worden gebruikt om de ongewenste cellen te vernietigen terwijl de dop in het QC-station blijft. Maak een foto van de weefselsectie van waaruit de cel is verzameld om de anatomische specificiteit ervan vast te leggen. Nota van de afstand van het segment van de bregma indien van toepassing met behulp van een rat hersenen atlas als referentie.

Verwijder de LCM-dop van het QC-station en bevestig de monsterafzuigingsinrichting. Dan pipet 5,5 microliter lysis buffer op het monster. Plaats het extractieapparaat op een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter en plaats het gedurende 15 minuten op een hete plaat op 75 graden Celsius.

Draai het monster en de lysisbuffer gedurende 30 seconden op lage snelheid naar beneden en plaats het verzamelde monster in een dokvries van min 80 graden Celsius. Om pre-versterking van eencellige mRNA uit te voeren voor een dynamische array chip, voeg eerst vijf microliters van 5X VILO toe aan elke put van een nieuwe 96 bij 96 PCR-plaat. Verwijder LCM single cell monsters van min 80 graden Celsius en laat ze kort ontdooien.

Na centrifugatie bij een lage snelheid, voeg 5,5 microliter van de lysed single cell monsters aan de PCR-plaat toe te voegen elk monster op zijn eigen put. Plaats de PCR-plaat met de monsters en VILO in de thermocycler en verwarm anderhalve minuut op 65 graden Celsius. Draai de plaat vervolgens een minuut op 1, 300 keer g en vier graden Celsius en leg de plaat op ijs.

Voeg 10X cDNA synthese master mix, T4 Gene 32 Protein en DNA-suspensiebuffer toe aan elke put. Plaats de PCR-plaat die monsterplaat één is in de thermocycler en voer zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg na de cyclus negen microliters taq polymerase-oplossing toe aan elke put in de 96-well PCR-plaat.

Negen microliter bestaat uit 7,5 microliter taq polymerase master mix en 1,5 microliter van de primer pool. Plaats nu de PCR-plaat in de thermocycler en voer het pre-versterkingsprogramma uit dat in het tekstprotocol is beschreven. Voeg na het pre-versterkingsprotocol zes microliters exonuclease-oplossing toe aan elke put in de 96-put PCR-plaat.

De exonuclease-oplossing bestaat uit 0,6 microliter 10X exonuclease-one reactiebuffer, 1,2 microliter exonuclease-one en 4,2 microliter DNA-suspensiebuffer. Plaats de PCR-plaat in de thermocycler en voer het programma uit dat in het tekstprotocol wordt vermeld. Voeg ten slotte 54 microliters TE-buffer toe aan elke put van monsterplaat één.

Draai de PCR-plaat vijf minuten lang op 1, 300 keer g. Bewaar op vier graden Celsius als onmiddellijk door te gaan naar de volgende stap. In een nieuwe 96-well PCR plaat die monster plaat twee, voeg vijf microliter van DNA bindende kleurstof en master mix oplossing.

Voeg drie microliter voorversterkte monsters van monsterplaat één toe aan de overeenkomstige putten in monsterplaat twee. Draai de PCR-plaat op 1,300 keer g en zet de plaat op ijs. In een nieuwe 96-well PCR plaat die test plaat twee, voeg vijf microliters van test laadoplossing aan elke put.

Test laadoplossing bestaat uit 3,75 microliters van 2X GE test laden reagens en 1,25 microliter dna-suspensie buffer per put. Voeg vervolgens 2,5 microliter van 10 micromolar qPCR primer van testplaat een toe aan de overeenkomstige put in testplaat twee. Draai de PCR-plaat vijf minuten lang op 1, 300 keer g.

Om de dynamische arraychip te laden en uit te voeren, past u eerst de chip met regelvloeistof. Plaats de chip vervolgens in een IFC-controller HX en voer het prime 136X-script uit. Voeg zes microliter van monsterplaat twee toe aan de bijbehorende monsterputten in de 96 bij 96 dynamische arraychip.

Voeg nu zes microliters van testplaat twee toe aan de overeenkomstige assay putten in de 96 bij 96 dynamische arraychip. Gebruik naalden om luchtbellen in de putten van de 96 bij 96 dynamische array chip pop. Plaats de chip vervolgens in de IFC-controller HX en voer het load mix 136X-script uit.

Verwijder vervolgens de chip van de IFC-controller HX. Plaats de 96 bij 96 dynamische arraychip in een microfluïdisch RT-qPCR-platform en voer het GE fast 96 bij 96 PCR-protocol uit. De selectie van de enkele cellen werd zowel visueel als moleculair gevalideerd. Visueel, cellulaire morfologie werd bekeken voordat cel collectie.

Hier zijn representatieve beelden van een dia met hemisected rat voorhersenen met de centrale kern van de amygdala. Latere beelden tonen de selectie van enkele cellen en hun verwijdering uit het weefsel voor transcriptomische analyse. Moleculair, celtype specifieke markers aangetoond verhoogde expressie in hun respectieve celtype.

Specifiek, verhoogde expressie van NeuN werd waargenomen in neuronen, Maf in microglia, en Gfap in astrocyten. De warmtekaart toont de expressie van alle monsters in 40 besnemde genen. Rijen zijn trekmonsters, de getallen geven de monsterclusters aan en de kolommen zijn de genen.

Multivariate analysemethoden tonen aan dat astrocyten in de terugtrekkingsgroep het meest getroffen celtype waren. Op basis van deze gegevens in de context van andere studies spelen astrocyten waarschijnlijk een belangrijke rol bij ontsteking in de centrale kern van de amygdala tijdens opioïde terugtrekking. Het belangrijkste om te onthouden over deze techniek is het gebruik van de juiste pipetting om het aantal luchtbellen te beperken.

De transcriptie bevindingen van deze experimenten kunnen worden gevalideerd met behulp van eiwit meetmethoden zoals immunofluorescentie of westerse vlek op hetzelfde weefsel.