Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie

Ons cultuursysteem vangt de fenotypische plasticiteit van longkwisische celcarcinoomcellen in reactie op tumor-stroma interacties en hoe deze interacties tumormorfologie reguleren tijdens de progressie van longcelcarcinoom. Het belangrijkste voordeel van ons systeem is de mogelijkheid om longkwostraatcelbiologie te modelleren in een 3D-context met behoud van de plasticiteit van de kwaadaardige cellen. Deze 3D cocultuur biedt een uniek systeem om tumor-stroma cel interacties te onderzoeken en kan worden aangepast aan de reacties van long squamous celcarcinoom cellen en kanker-geassocieerde fibroblasten aan de behandeling van geneesmiddelen te controleren.

Om te beginnen ontdooien flesjes van keldermembraan matrix in een vier graden Celsius koelkast 's nachts. Koel twee milliliter plastic pipetten en tips bij min 20 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, warm de reagentia gebruikt om TUM622 cellen te scheiden, HEPES buffer, trypsin / EDTA, en trypsine neutralisatie buffer in een 37-graden Celsius waterbad.

Haal de ontdooide keldermembraanmatrix uit de koelkast en zet de flacon op ijs. Koel de weefselkweekplaten af op een metalen platformkoeler die op ijs is geplaatst. Plaats centrifugebuizen op een metalen koelrek op ijs.

Bereken de hoeveelheid cellen die nodig is op basis van het aantal putten en de concentratie van cellen in elke put die moet worden voorbereid. Breng TUM622 celsuspensie over in een afgekoelde centrifugebuis en draai vijf minuten lang op 300 keer g in een hangende emmercentrifuge bij vier graden Celsius. Met een aspirating pipet bevestigd aan een ongefilterde punt, aspirate de supernatant zorgvuldig, waardoor ongeveer 200 microliter van het medium in de buis.

Tik voorzichtig op de zijkant van de buis om de pellet los te maken en te scheiden en vervolgens terug te brengen naar het koelrek. Met behulp van de twee-milliliter voorgekoelde pipetten, voorzichtig meng de matrix op ijs door pipetting op en neer een paar keer. Pipet op een gelijkmatige en matige snelheid, zodat er geen bellen worden geïntroduceerd in de matrix tijdens deze procedure.

Breng 1,1 milliliter van de matrix in elke centrifugebuis. Met behulp van voorgekoelde tips, pipette de matrix in elke buis op en neer ongeveer 10 keer om een uniforme cel schorsing te maken. Breng 310 microliter van de celmatrixopening over in elke put van een voorgekoelde 24-putplaat.

Plaats de pipet in een hoek van 90 graden op het plaatoppervlak en voeg de ophanging toe aan het midden van de put. De ophanging verspreidt en bedekt de hele put. Om downstream immunofluorescentie analyse te vergemakkelijken, overdracht 60 microliter van cel matrix schorsing in het put centrum van een twee-put kamer dia.

Hierdoor kan de matrix een koepelachtige structuur vormen met een veel kleiner volume. Breng de plaat en de kamer terug in de weefselkweek incubator en uitbroeden gedurende 30 minuten om de matrix te stollen. Bestudeer daarna de plaat en schuif onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat enkele cellen gelijkmatig in de matrix worden verdeeld.

Voeg een milliliter voorverwarmde 3D-cultuur compleet medium in elke put van de plaat en 1,5 milliliter 3D-cultuurmedium in elke put van de kamerglijbaan, en breng ze terug naar de couveuse. Na het voorbereiden van celsuspensies van TUM622 en CAFs zoals eerder beschreven, tel de CAF-celdichtheid door 10 microliters celsuspensie te mengen met 10 microliter trypanblauw. Voeg 10 microliter van het mengsel toe aan elk van de twee kamers op de hemocytometer om de celdichtheid te tellen en te berekenen.

Als u TUM622-cellen en CAF's in de keldermembraanmatrix wilt co-insluiten, berekent u eerst het gewenste aantal cellen dat wordt gebruikt voor beplating op basis van de informatie over de celdichtheid. CAFs worden gezaaid met een verhouding van 2:1 van TUM622 cellen. Breng het berekende volume van TUM622s en CAF-celsuspensie over in dezelfde centrifugebuis.

Spin naar beneden en aspirate alle medium. Resuspend in kelder membraan matrix en plaat 310 microliter van het mengsel in elke put van een 24-well plaat. Voor immunofluorescentie moet 60 microliter tum622- en CAF-mengsels worden overgebracht naar kamerdia's zoals eerder beschreven.

Om TUM622 te coculturen met bedekte CAF's in keldermembraanmatrix, zet eerst TUM622 monocultuur op zoals eerder beschreven, breng tweemaal het aantal CAF-suspensie over in een centrifugebuis en spin naar beneden op 300 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant en resuspend de CAFs in cultuur medium, overdracht twee keer het aantal CAF cellen die werden geresuspended in cultuurmedium in elk van de putten met de ingebedde TUM622 cellen. Typische TUM622-cellen in de 2D-cultuur worden afgerond met grote kernen, terwijl CAF's plat en langwerpig zijn.

Gezaaid in 3D-cultuur, enkele TUM622 cellen waren in staat de vorming van organoïden met acinarlike morfologieën wanneer ingebed. Tussen dag vijf en zeven werd een lumen zichtbaar in de acinarlike structuren en bleef daarna hol. Elke acinus, samengesteld uit een monolaag van cellen rond het holle lumen, vertoonde de juiste apicale basale polariteit vergelijkbaar met die van longepeptheel in vivo.

Deze acinarlike structuren waren hyperplastisch en bleven groeien tot 24 dagen voordat de extracellulaire matrix volledig uiteenviel. In de TUM622-CAF coculturen, ofwel overlaying of co-embedding, de aanwezigheid van CAFs sterk verbeterd het aantal en de grootte van de gevormde sferoïden. Interessant is dat toen TUM622 acini in de nabijheid kwam van CAF's, ze de acini ertoe aangezet om invasief te worden en naar de CAF's te migreren, waardoor teardrop-achtige structuren vormden.

Om een robuuste vorming van acinarlike structuren te garanderen, is het van cruciaal belang om de keldermembraanmatrix in zijn vloeibare vorm te behouden tijdens het gehele proces van het inbedden van de cellen. TUM622-organoïden kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstream-analyses, waaronder maar niet beperkt tot immunofluorescentie, immunohistochemie, stroomcytometrie, RNA en eiwitextractie, en kunnen ook worden gewijzigd voor screening van geneesmiddelen. Met behulp van dit systeem als een platform, kan men onderzoeken hoe tumorcel intrinsieke evenals cel extrinsieke veranderingen in de tumor micro-omgeving kan beïnvloeden tumor epitheelarchitectuur en carcinoom vorming.