Voorspellende immuunmodellering van vaste tumoren

Het volledig karakteriseren van de tumormicro-omgeving is essentieel in immuno-oncologieonderzoek. Deze test is de eerste die RNA-gebaseerde gezondheidsexpressiemodellen gebruikt om immuuncellen in vast tumorweefsel te meten. Deze test stelt onderzoekers in staat om zeer gevoelige en specifieke metingen van de immuuncontextuur in FFB vaste tumorweefsels te krijgen en deze resultaten te combineren tot een multidimensionale biomarker.

Alle kankerbehandelingen, niet alleen immunotherapieën, ontlokken een immuunrespons op de plaats van de vaste tumor. Het meten van deze immuunrespons is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de ziekte en de reacties op therapie. Dit protocol combineert traditionele RNA bibliotheek voorbereidingstechnieken met gerichte opname.

Hoewel tijdrovend, na de wasstappen en het toezicht op de kwaliteitscontrole checkpoints zoals voorgesteld is zeer belangrijk voor succes. Voor sterk gedegradeerd RNA van formaline-vaste paraffine ingebedde monsters, monteren de eerste streng synthese reactie op ijs volgens de tabel. Meng de reacties grondig door meerdere keren op en neer te pipetten voordat u de monsters kort in een microcentrifuge naar beneden draait.

Plaats aan het einde van de centrifugatie de monsters onmiddellijk in een voorverwarmde thermische cycler volgens programma nummer drie van de tabel. Voor een intact RNA van hoge kwaliteit, monteer de eerste strengsynthesereactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis zoals beschreven in de tabellen. Om deze procedure te beginnen, meng 200 nanogram van de barcodebibliotheek van belang met twee microgram COT-1 DNA en twee microliters van het blokkeren van oligo's in een nuclease-vrije PCR buis.

Gebruik vervolgens een vacuüm concentrator ingesteld op 30 tot 45 graden Celsius om de inhoud van de buis te drogen. Na hybridisatie, verwijder de monsters uit de thermische cycler en zet de thermische cycler in te broeden op 65 graden Celsius met de verwarmde deksel ingesteld op 70 graden Celsius. Gebruik een multichannel pipet om 17 microliter volledig gehomogeniseerde kralen over te brengen naar de monsters en pipet grondig op en neer 10 keer.

Om het DNA te binden aan de kralen, plaats de buizen in de thermische cycler volgende programma 10 kort verwijderen van de gestripte buizen om de 10 tot 12 minuten gedurende drie seconden van zachte vortexing om de kralen resuspended te houden. Onmiddellijk na de bindende incubatie, verwijder een strook buizen uit de thermische cycler en voeg 100 microliters van voorverwarmde wasbuffer een aan de buizen. Pipet grondig op en neer 10 keer en plaats de buizen op een magnetisch rek om de kralen volledig te scheiden van de wasoplossing voordat het ongebonden DNA met supernatant aspirating.

Haal de buizen uit het rek en voeg 150 microliters van voorverwarmde strenge wasbuffer met grondig mengen om de kralen volledig te hersuspend die ervoor zorgen om bellen te vermijden. Plaats de buizen terug in de thermische cycler op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten voor het plaatsen van de buizen terug op het magnetische rek om de kralen volledig te scheiden van de supernatants. Gooi het ongebonden DNA met supernatants weg, was de kralen nogmaals met voorverwarmde strenge wasbuffer, zoals zojuist is aangetoond voor in totaal twee strenge wasbeurten.

Na de laatste wasbeurt, verwijder de supernatant en voeg 150 microliter van kamertemperatuur wassen buffer een aan de buizen. Pipette de was 10 tot 20 keer om de kralen volledig te herhalen en de monsters uit te broeden met het deksel gedurende twee minuten afgesloten afwisselend 30 seconden en 30 seconden rusten. Aan het einde van de incubatie, centrifuge kort en plaats de buizen op het magnetische rek en verwijder de supernatant zodra de kralen volledig hebben gehecht aan de magneet.

Centrifugeren de buizen kort met de doppen gesloten en terug te keren de monsters naar het magnetische rek. Gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffers te verwijderen en voeg 150 microliters kamertemperatuur wasbuffer twee toe. Pipette de was 10 tot 20 keer om de kralen volledig te herhalen en de monsters uit te broeden met de deksels gedurende twee minuten verzegeld afwisselend vortexing gedurende 30 seconden en 30 seconden rusten.

Breng na een korte centrifugatie het volledige volume kralen van elke buis over in schone nuclease-vrije PCR-buizen en plaats de buizen op het magnetische rek. Na het weggooien van het ongebonden DNA met supernatants, even centrifugeren de monsters opnieuw en gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen uit de kralen terwijl ze in het magnetische rek. Voeg 150 microliter wasbuffer drie aan de buizen en pipet op en neer 10 tot 20 keer om de kralen volledig opnieuw op te zetten.

Incubeer de buis gedurende twee minuten afwisselend tussen 30 seconden zachte vortexen en 30 seconden rust voordat kort centrifugeren. Plaats de buizen op het magnetische rek om de supernatants aan te trekken en de kraalmonsters kort opnieuw te centrifugeren. Gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffers uit de kralen te verwijderen terwijl ze zich in het magnetische rek bevinden voordat ze de buizen uit het rek verwijderen en de kralen opnieuw in 20 microliter nuclease-vrij water per buis.

Dan pipette de kralen 10 keer om ervoor te zorgen dat eventuele kralen vast aan de zijkant van de buizen zijn geresuspended. De aanwezigheid van adapter dimers moet worden geëvalueerd om te bepalen of extra opschoning nodig is. Dit elektropherogram vertoont bijvoorbeeld een aanvaardbaar niveau van adapterverkleter dat verschijnt als een scherpe piek rond 128 basisparen, terwijl dit elektropherogram een onaanvaardbaar niveau van adapterverkleinter vertoont.

De immuunprofielen voor en na de behandeling kunnen worden gebruikt om de effecten van een specifieke therapie op de tumormicro-omgeving te begrijpen, zoals in deze representatieve analyse waarvoor de veranderingen in percentage voor elke immuuncel van belang en het totale immuunsysteem voor en na chemotherapie voor één patiënt worden getoond. In deze analyse werden monsters tussen patiëntengroepen vergeleken op basis van hun tijd tot ziekteprogressie na de behandeling. Een subgroep van de patiënten vertoonde ziekterecidief na 18 maanden, terwijl een andere subset sneller vorderde in 18 of minder maanden.

De mediane deltawaarde kan vervolgens voor elk monster worden vergeleken om vermeende biomarkers van ziekteprogressie te identificeren. Hier werden bijvoorbeeld twee immuunvluchtgenen geïdentificeerd als statistisch significante differentiators van de steekproefgroepen. Omdat de individuele genbiomarkers robuust waren met duidelijke statistische significantie, heeft de multidimensionale biomarker geen significante voorspellende waarde toegevoegd.

Zorg ervoor dat u de verwarmde wasbeurten een strip tegelijk uitvoert om monsterkoeling te voorkomen en vergeet niet om de kralen over te brengen naar verse buizen om besmetting met off-target te voorkomen. Dit protocol toont het gebruik van genexpressiemodellen aan om immuuncellen en tumorweefsel te kwantificeren. Er worden nieuwe modellen ontwikkeld om celtoestanden te meten, zoals uitputting of activering.