Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts
25 juli 2020
Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.
Het hier beschreven protocol is bedoeld om een algoritme aan te tonen voor het testen van de werkzaamheid van de behandeling met behulp van in vivo kankermodellen. Het protocol bestaat uit een combinatie van verschillende technieken. Hele genoom bio-sequencing van menselijke tumormonsters wordt gebruikt om genomische veranderingen te identificeren.
Deze omvatten zowel gen herschikkingen en gen kopie nummer veranderingen. Dus de analyse van geïdentificeerde veranderingen wordt uitgevoerd om potentieel druggable veranderingen te selecteren. De geneesmiddelen geselecteerd op basis van genomische analyse worden vervolgens gebruikt voor in vivo behandeling van overeenkomstige tumoren gekweekt in immuungecompromitteerde muizen.
Het ontwikkelde algoritme is een veelbelovende aanpak om behandelingsbeslissingen voor de zorg voor kankerpatiënten te helpen. Gebruik de Panda tool of een analoge software om doelbare wijzigingen te identificeren. We kunnen een lijst van de genen die werden geïdentificeerd door microsequencing resulteerde als een eenvoudige tab afgebakend bestand met behulp van standaard geaccepteerde gensymbolen.
Voeg het pondteken toe aan de koplijn van de lijst om ervoor te zorgen dat de tabelkop wordt overgebracht naar het padniveau U van de software. Upload het bestand door op het bijbehorende navigatietabblad te klikken. Wijs één pictogram toe om de onderliggende gegevens weer te geven door op het keuzepictogram te klikken en vervolgens op het tabblad afronden te klikken.
Zodra vervolgens een patiëntbestanden zijn geüpload, bekijkt u de pagina om een kolom te identificeren die het aantal geannoteerde genen per traject weergeeft. Dit is de laatste kolom aan de rechterkant. Gebruik een padfilter linksboven in het hoofdvenster om het aantal weergegeven paden te beperken tot de paden die de genen van belang bevatten.
Om trajecten te identificeren die meer geannoteerde genen hebben dan bij toeval zou worden verwacht, gebruikt u een functie die zich onder het verrijkingstabblad bevindt. Vervolgens wordt een kolom toegevoegd aan de hoofdtabel met de bijbehorende p-waarde van de exacte test van een Fisher. Selecteer de database om potentiële druggable genen weer te geven van vooraf ingestelde annotatie door een geschikt pictogram aan de linkerkant van het hoofdvenster te controleren.
Als u een pad voor visualisatie wilt selecteren, klikt u op de naam die wordt weergegeven op de pagina met de routeviewer. Pictogrammen die elke annotatieset vertegenwoordigen, worden naast het bijbehorende gen weergegeven. Als u op een gen in het pad klikt, opent u de bijbehorende pagina met genkaarten.
Selecteer de paden die geannoteerde genen van belang en hits voor potentiële geneesmiddelen voor verdere analyse toonde. Voer het weefsel werk in een laminaire flow kap om steriele omstandigheden te handhaven. Leg het tumorweefsel in een schaal met koude PBS of weefselkweekmedia, zoals RPMI, DMEM, met antibiotica.
Identificeer en isoleer levensvatbaar tumormateriaal uit aangrenzend normaal en necrotisch weefsel met de hulp van een patholoog. Gebruik steriele tangen en scalpel om necrotisch materiaal te verwijderen dat door een patholoog wordt opgemerkt. Om onderhuidse engraftment uit te voeren, snijd het tumorweefsel met steriele tangen, scalpel of chirurgische schaar in kleine fragmenten, ongeveer 2 x 2 x 2 millimeter groot.
Breng het gefragmenteerde weefsel over in een voorgekoelde petrischaal op ijs. Laat koude matrigel in de schotel met het gefragmenteerde weefsel, ongeveer 200 microliter per 10 stukken weefsel. Meng goed en laat de weefselfragmenten 10 minuten in de matrigel weken.
Gebruik steriele chirurgische schaar en tangen om een 5-10 millimeter verticale huid incisie te maken op beide flanken van een muis. Steek rechte tangen voorzichtig in de onderhuidse ruimte om een zak te creëren die groot genoeg is om een tumorfragment onder het vetkussen te plaatsen. Gebruik steriele rechte tangen om tumorfragmenten in de eerder voorbereide zak in elk van de vijf muizen in te voegen.
Sluit de huidincisie met behulp van weefsellijm. Na implantatie, om lymfocytenproliferatie te remmen, injecteer elke muis met 100 microliters rituximab. Bereid de muis voor op orale gavage door de huid van de rug te knijpen en naar achteren te buigen, zodat het hoofd en de lippen van de muis worden geïmmobiliseerd.
Steek de gavage sonde in de achterkant van de keel van de muis totdat de sonde de slokdarm bereikt. Zorg ervoor dat de sonde niet te ver wordt ingebracht, omdat de longen van de muis kunnen perforeren waardoor de dood ontstaat. De representatieve genoomvlotter illustreert het landschap van genomische veranderingen in één tumor.
Typisch voor hoogwaardige serosubtype tumoren, meerdere winsten blauwe lijnen en verliezen rode lijnen, werden geïdentificeerd met vermelding van hoge niveaus van genomische instabiliteit. De belangrijkste trendverandering voor therapeutische interventie in de OC101-tumor was een versterking bij chromosoom 17, waarbij ERBB2 betrokken was, een gen dat codeert voor HER2-receptor. Om de resultaten op DNA-niveau te valideren, werden verschillende sets specifieke primers ontworpen voor de randen van het versterkte gebied.
En PCR werd uitgevoerd. Geen versterking product werd geabsorbeerd wanneer controle menselijk DNA werd gebruikt. Specifieke banden werden geïdentificeerd voor OC101 tumor DNA.
In een andere variant tumor, T14, werden tal van DNA-winsten waargenomen. Die opgenomen AKT2 in RICTOR genen. Validatie uitgevoerd op het eiwitniveau, met behulp van immunoblotting toonde hoge niveaus van AKT in RICTOR.
Een significante vermindering van de tumorlast werd waargenomen in de chemotherapie behandelde groep tegen het einde van week zes. Er was een extra voordeel ten opzichte van chemotherapie alleen in de groepen die een combinatiebehandeling kregen. Tumorweefsel werd verzameld voor moleculaire analyse van de behandelingsrespons aan het einde van het behandelingsonderzoek.
De totale en fosforyleerde niveaus van S6, AKT en mTOR werden bepaald met behulp van immunoblotting. Vergelijking van de niveaus van deze eiwitten in onbehandeld, chemotherapie-behandeld, en behandeld met AKT of mTOR remmer toonde een duidelijke daling voor de laatste twee. De gepresenteerde aanpak is zeer nuttig om de klinische studie in PDX-modellen uit te voeren.
Het maakt gebruik van moleculaire kenmerken van de tumor zoals verkregen door genomische profilering om de beste keuze van geneesmiddelen voor het testen te bepalen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een algoritme voor het testen van de werkzaamheid van gerichte therapieën op basis van de genomische samenstelling van tumoren. Het omvat de identificatie van structurele DNA-rearrangementen en het enten van patiënttumoren in muizen voor het testen van de medicijnrespons.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Oncologie
- Genomica
- Farmacologie
Achtergrond
- Doelgerichte therapieën worden geselecteerd op basis van genomische veranderingen.
- Inzicht in DNA-rearrangementen kan informatie verschaft over behandelingsopties.
- In vivo-modellen zijn essentieel voor het testen van de effectiviteit van geneesmiddelen.
- Immuungecompromitteerde muizen worden gebruikt voor tumor-engraftment.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van geneesmiddelen die via genomische analyse zijn geselecteerd te valideren.
- Om een protocol vast te stellen voor in vivo testen van doelgerichte therapieën.
- Om het begrip van tumorresponsen op specifieke behandelingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bio-sequencing van het volledige genoom van menselijke tumorstalen.
- Identificatie van genomische alteraties, inclusief gen-rearrangementen.
- Selectie van potentieel behandelbare veranderingen op basis van de analyse.
- In vivo behandeling van tumoren in immuungecompromitteerde muizen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van structurele DNA-rearrangementen.
- Validatie van geselecteerde geneesmiddelen in muismodellen.
- Aantonen van de behandelingsefficiëntie op basis van genomische analyse.
- Inzichten in het tumorgedrag als reactie op doelgerichte therapieën.
Conclusies
- Het protocol biedt een kader voor het testen van gerichte therapieën.
- Genomische analyse is cruciaal voor het selecteren van effectieve behandelingen.
- In vivo-modellen zijn waardevol voor het begrijpen van geneesmiddelresponsen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit protocol stelt biofarma R&D-teams in staat om doelgerichte therapieën te evalueren met behulp van patiëntafgeleide xenograftmodellen gestuurd door genomische profilering, wat hypothesegestuurde drugselectie en mechanistisch de-risking in de preklinische ontwikkeling ondersteunt. Door structurele DNA-alteraties te koppelen aan functionele medicijnrespons, vergroot het het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie en informeert het go/no-go-beslissingen voor combinatietherapieën. De benadering is bijzonder relevant voor tumoren met een hoge genomische instabiliteit waarbij standaardtherapieën falen en off-label gebruik van geneesmiddelen wordt overwogen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door structurele DNA-alteraties, zoals genamplificaties en herschikkingen, te koppelen aan behandelbare targets zoals ERBB2/HER2 en AKT2.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie in vivo met behulp van PDX-modellen, waardoor mechanistische ambiguïteit vóór lead-optimalisatie wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Toont de correlatie aan tussen genomische voorspellingen en geobserveerde tumorresponsen, wat helpt bij de portfolio-triage op basis van de betrouwbaarheid van het target.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen (PDX-modellen) voor met gekarakteriseerde genomische profielen voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in downstream screening.
- Operationele waarde: Standardiseert tumor-engraftment en behandelingsprotocollen, wat de reproduceerbaarheid tussen studies verbetert en schaalbare preklinische tests mogelijk maakt.
- Assay-gereedheid: Genereert kwantitatieve moleculaire readouts (bijv. gefosforyleerd S6, AKT, mTOR) via immunoblotting om pathway-inhibitie en behandelingsrespons te beoordelen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van patiëntafgeleide tumoren om de relevantie van de ziekte te behouden, waardoor genomische bevindingen uit menselijke monsters worden overgebracht naar in vivo-modellen.
- Preklinische validatie: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door in vivo tumorlastvermindering en medicijneffecten voor specifieke signaalpaden aan te tonen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen werkzaamheid het gevolg is van monotherapie of combinatietherapie, wat bijdraagt aan het ontwerp van klinische studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert genomische analyse met in vivo werkzaamheidstesten, waardoor deze in het ontdekkingscontinuüm wordt gepositioneerd tussen targetidentificatie en lead-optimalisatie om een datagestuurde overgang naar preklinische ontwikkeling mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseonderzoek en de verduidelijking van signaalpaden door te valideren of structureel gewijzigde genen in vivo functioneel beïnvloedbaar zijn met geneesmiddelen.
- Screening: Creëert assay-klaar PDX-modellen met bekende genomische drijvers, wat betrouwbare screening van verbindingen en evaluatie van combinatietherapie mogelijk maakt.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (tumorlast, proteïnefosforylering) waarmee teams drug-effecten kunnen vergelijken en de target engagement kunnen beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft de continuïteit van de patiënttumor naar het preklinische model, wat de afstemming van biomarkers en voorspellende modellering van de klinische respons ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor het testen van gerichte therapieën over verschillende tumortypen heen, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door te bevestigen dat veranderingen op DNA-niveau vertalen naar functionele druggevoeligheid in vivo.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor weefselverwerking, engraftment en drugstoediening.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door prioriteit te geven aan doelwitten met aangetoonde in vivo-effectiviteit, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van drugkandidaten mogelijk op basis van de concordantie tussen genomische voorspelling en PDX-respons.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in kankergenomica, pathologie en in vivo modellering om levensvatig tumorweefsel nauwkeurig te isoleren en genomische veranderingen te interpreteren.
- Afhankelijk van infrastructuur voor next-generation sequencing en bio-informatica-tools (bijv. Panda tool) voor de analyse van structurele veranderingen en pathway-verrijking.
- Vereist gestandaardiseerde procedures voor steriele tumorfragmentatie, Matrigel-menging en subcutane transplantatie om het succes van de transplantatie te waarborgen.
- Vereist immunoblotting-capaciteiten om de modulatie van downstream pathways (bijv. AKT/mTOR/S6) te beoordelen als farmacodynamische read-outs.
- Beperkt door de tijd en middelen die nodig zijn voor het genereren van PDX-modellen, wat de doorvoer voor grootschalige screeningscampagnes kan beperken.
