Name: Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer twee muizenwondgenezingsmodellen beoordelen: de PVA-sponsimplantatie en de excisionele staarthuidwond. Deze methoden analyseren cellulaire en cytokine-kinetiek bij acute wondgenezing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Kevin Carlson van de Brown University Flow Cytometrie en Sorteerfaciliteit bedanken voor overleg en hulp bij stroomcytometrieexperimenten. Afbeeldingen in figuur 1B en C zijn gemaakt met BioRender. Kayla Lee en Gregory Serpa worden bedankt voor hun fotografische hulp. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de volgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) en de Brown University Research Seed Award.

Alle hier beschreven dierstudies zijn goedgekeurd door het Institute Of The Brown University Institutional Animal Care and Use Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van dieren van de National Institutes of Health.  LET OP: in de video is het chirurgische gordijn weggelaten voor demonstratiedoeleinden.
1. Onderhuidse implantatie van PVA-sponzen
<ol><li>Gebruik een schaar om vellen PVA-spons in stukken van 8 mm x 8 mm x 4 mm te snijden. Rehydrateer de stukjes PVA spons door ze onder te dompelen in steriele 1x PBS in een beker.</li>
	<li>Autoclave de sponzen in 1x PBS te steriliseren, en volledig afkoelen. Bewaar autoclaved sponzen in steriele 1x PBS bij 4 °C.</li>
	<li>Voorafgaand aan het uitvoeren van chirurgische implantatie, aliquot het nodige aantal sponzen in een steriele cultuur schotel onder steriele omstandigheden in een laminaire stroom kap. Bewaar de extra sponzen in steriele 1x PBS bij 4 °C voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat de sponzen na rehydratie tot 1 cm x 1 cm x 0,5 cm zwellen. Een afbeelding van uitgedroogde PVA sponzen wordt weergegeven in figuur 1A. OPMERKING: Om de steriliteit van de chirurgische locatie te behouden, vereist de PVA-sponsimplantatieprocedure één persoon om de muis te behandelen en de chirurgische plaats voor te bereiden, en een tweede persoon om de implantatie uit te voeren.</li>
	<li>Verdoven van een 8-12 weken oude mannelijke C57BL/6J muis door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine. Toedienen 40 mg/kg xylazine intraperitoneally voor analgesie.  Bevestig de diepte van anesthesie door het verlies van een pedaalreflex. Bereid de chirurgische plaats door het verwijderen van het haar langs de dorsum met tondeuse. Breng met behulp van steriel gaas povidone-jodium oplossing op het scheergebied 2x, gevolgd door 70% ethanol.</li>
	<li>Plaats de muis op steriele chirurgische gordijnen. Plaats een verwarmde pad onder de chirurgische gordijnen om de kerntemperatuur van de muis te behouden.</li>
	<li>Draag steriele chirurgische handschoenen voor het uitvoeren van de operatie. Trek de rughuid weg van het onderliggende weefsel met tangen, en met behulp van steriele chirurgische schaar, maak een 2 cm incisie langs de ruglijn middellijn ongeveer 2 cm voorste aan de basis van de staart. Terwijl u de incisie openhoudt met steriele tangen, gebruikt u steriele gebogen, stompe chirurgische schaar om een onderhuidse zak langs de dorsum te vormen in een van de posities die in figuur 1Bzijn aangegeven.</li>
	<li>Blijf tangen gebruiken om de huid weg te tillen van het onderliggende weefsel. Met behulp van steriele chirurgische schaar, voorzichtig knijp een PVA spons in de kweekschaal om overtollige PBS te verwijderen. Pak de PVA spons door een hoek met behulp van steriele chirurgische schaar en, leidt met de hoek gehouden door de schaar, plaats de spons in de onderhuidse zak gevormd in stap 1.4.</li>
	<li>Herhaal dit proces 5x, het plaatsen van een totaal van zes sponzen in onderhuidse zakken zoals afgebeeld in figuur 1B.</li>
	<li>Knijp de ingesneden rughuid samen met steriele tangen en sluit de incisie met twee roestvrijstalen wondclips.</li>
	<li>Gebruik een nieuwe set steriele chirurgische instrumenten voor elke muis. U ook een kraalsterilisator gebruiken om instrumenten tussen muizen te steriliseren.</li>
</ol>2. Isolatie van vloeistoffen uit PVA sponzen
<ol><li>Om de acute wond cytokine milieu te beoordelen, isoleren sponzen tussen 1-14 dagen na implantatie.</li>
	<li>Bereid een vloeistofopvangbuis voor door het vat van een 5 mL-spuit in een kweekbuis van 16 mL te nestelen.</li>
	<li>Euthanaseer een muis met geïmplanteerde PVA-sponzen door CO 2-verstikking, gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Verwijder de chirurgische nietjes en open de incisie met getande tangen. Gebruik een schaar om de incisie langs de ruglijn uit te breiden.</li>
	<li>Met behulp van tangen, haal een spons uit zijn onderhuidse zak en breng het naar de voorbereide spuit vat, voorzichtig om de druk op de spons te minimaliseren. Los van elk bindweefsel dat aan het oppervlak van de spons blijft hangen. Gebruik een schaar om de spons ontleden van het omliggende weefsel indien nodig. Herhaal het sponsverwijderingsproces met de resterende sponzen. Plaats de buis met de sponzen op ijs.</li>
	<li>Om de wondvloeistof te isoleren, centrifugeer t.w.v. de kweekbuis met de 5 mL-spuit met de sponzen op 700 x g gedurende 10 min.</li>
	<li>Gooi na de centrifugering de spuit en de sponzen weg. De wondvloeistof zal verzameld zijn in de 16 mL kweekbuis. Een representatief beeld van vloeistof verzameld van een dag 7 wond wordt weergegeven in figuur 1D. Breng de wondvloeistof over op een schone buis voor langdurige opslag bij -80 °C.</li>
</ol>3. Isolatie van cellen uit PVA sponzen
<ol><li>Om de acute wondgenezing cellulaire milieu te beoordelen, verzamelen sponzen tussen 1-14-dagen na de spons implantatie. Sponzen verkregen uit een wond 7 dagen na implantatie worden weergegeven in figuur 1E.</li>
	<li>Bereid het opvangmedium met 1x HBSS (+calcium/+magnesium/–fenolrood) voor, aangevuld met 1% FBS, 1% HEPES en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Aliquot 5 mL hbss collectie medium in een 15 mL conische buis.</li>
	<li>Haal de PVA-sponzen uit geëeuthaniseerde muizen zoals beschreven in 2.2–2.4. Plaats de sponzen in de conische buis met 5 mL HBSS-opvangmedium.</li>
	<li>Breng de sponzen en het HBSS-opvangmedium door door te gieten naar een blenderzak van 80 mL. Hang de blender zak uit het luik van de peddel blender, geplaatst, zodat de peddels staking de sponzen en media. Pas de instellingen van de peddelblender aan om op hoog te draaien voor 60 s. Druk op start.</li>
	<li>Breng de media van de blenderzak terug naar de conische buis van 15 mL met een pipet, waardoor de sponzen in de zak achterblijven. Knijp in de sponzen om de media grondig los te laten. Pas de instellingen van de peddelblender aan om 30 s hoog te draaien. Voeg 5 mL media toe aan de blenderzak en herhaal het maagproces 2x voor een totaal van drie sponswassingen.</li>
	<li>Centrifugeer de conische buis op 250 x g gedurende 5 min. Een rode pellet van cellen en rode bloedcellen zal zichtbaar zijn aan de onderkant van de conische buis na centrifugatie.</li>
	<li>Gooi de supernatant weg en voer een rode bloedcellyse uit: voeg 900 μL dH2O toe aan de celpellet en pipet om te mengen. Neutraliseer met 100 μL van 10x PBS. Voeg 4 mL van 1x PBS toe aan de buis om de lysis volledig te neutraliseren en centrifugeer vervolgens op 250 x g gedurende 5 min. OPMERKING: De lysisstap moet kort zijn; het water meer dan 3-5 s in contact laten met de cellen kan leiden tot lyse van niet-rode bloedcellen.</li>
	<li>Na centrifugatie zal een witte celpellet met wondcellen zonder rode bloedcellen aanwezig zijn op de bodem van de kegelbuis. Gooi de supernatant weg en stoom de celpellet opnieuw op in het gewenste medium voor downstream-analyses.</li>
</ol>4. Facultatieve stroomcytometrieanalyse van aangeboren leukocyten geïsoleerd van PVA sponswonden
<ol><li>Resuspend0.5-1 x 106 wondcellen in 25 μL van een 2x oplossing voor het blokkeren van antilichamen met 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III antilichaam verdund in 1x PBS + 1% BSA. OPMERKING: Alle antilichamen moeten worden getitreerd om optimale concentraties voor stroomcytometrieanalyse te bepalen.</li>
	<li>Incubeer de cellen met blokkerend antilichaam gedurende 10 min op ijs.</li>
	<li>Maak een 2x master mix van antilichamen die 2,5 mg/mL van PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL fitc-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, en 10 mg/mL van eFluor660-F4-80 verdund in 1x PBS + 1% BSA. Voeg direct 25 μL van de antilichaamcocktail toe aan de cellen die in het blokkeren van antilichaam uitbroeden.</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 20 min op ijs, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Was de cellen 2x met 1x PBS.</li>
	<li>Maak een master mix van amine-reactieve fixable levensvatbaarheid kleurstof-eFluor506 verdund 1:1,000 in 1x PBS. De celpellet opnieuw opschorten in 50 μL van de levensvatbaarheidskleurstofoplossing. OPMERKING: Serum moet worden uitgesloten van de herstelbare levensvatbaarheidsstap, omdat het binding van de kleurstof aan endogene eiwitten zal voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 20 min op ijs, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Was de cellen 2x met 1x PBS. De celpellet opnieuw opschorten in 50 μL van 1% paraformaldehyde.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 1% paraformaldehyde gedurende 15 min op ijs, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Was de cellen 1x met 1x PBS en stouw de pellet opnieuw in 1x PBS voor flow cytometrische analyse.</li>
</ol>5. Uitlaathuidexcisie
<ol><li>Verdoven van een 8-12 weken oude mannelijke C57BL/6J muis door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine. Toedienen 40 mg/kg xylazine intraperitoneally voor analgesie. Bevestig de diepte van anesthesie door het verlies van een pedaalreflex.</li>
	<li>Bereid de chirurgische plaats op de staart van de verdoofde muis met behulp van steriele gaas om povidone-jodium oplossing toe te passen 2x, gevolgd door een toepassing van 70% ethanol.</li>
	<li>Definieer een sectie van 10 mm x 3 mm op het rugoppervlak van de staart, 10 mm van de basis van de staart (figuur 1C) met behulp van een permanente markering om te traceren van een vooraf gemaakte sjabloon.</li>
	<li>Plaats de verdoofde muis op steriele chirurgische gordijnen.</li>
	<li>Draag steriele chirurgische handschoenen om de chirurgische ingrepen uit te voeren. Maak met een steriel scalpelblad een volledige dikteincisie langs de rechter-, onder- en linkerranden van het wondgebied.</li>
	<li>Met behulp van steriele tangen, schil de uitgesneden huid uit de buurt van de staart, en gebruik steriele chirurgische schaar weg te snijden de bovenste rand van de wond gebied.</li>
	<li>Druk uitoefenen met steriel gaas om het bloeden te stoppen.</li>
	<li>Breng een spuitbarrièrefolie aan op het wondbed.</li>
	<li>Fotografeer de wonden van een vaste afstand op regelmatige tijdstippen. Analyseer foto's op planimetrische analyse om de metingen van wondgebieden te bepalen. U ook remklauwen gebruiken om wondlengte en breedtemetingen te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+use+in+wound+healing+research%3A+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).</li>
<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modeling+Conundrum%3A+Murine+for+Cutaneous+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+Mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li>
<li>Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+to+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses to trauma.</a> Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).</li>
<li>Novak, M. L., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Transitions+of+Macrophages+Orchestrate+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair.</a> The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+Their+Receptors+Are+Key+Players+in+the+Orchestra+That+Regulates+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing.</a> Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).</li>
<li>Guerrero-Juarez, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+fibroblast+heterogeneity+and+myeloid-derived+adipocyte+progenitors+in+murine+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds.</a> Nature Communications. 10 (1), 650(2019).</li>
<li>Shook, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+proliferation+and+heterogeneity+are+supported+by+macrophages+during+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair.</a> Science. 362 (6417), 2971(2018).</li>
<li>Davidson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+repair%2C+cell+proliferation%2C+and+collagen+accumulation+are+produced+by+a+cartilage-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor.</a> The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).</li>
<li>Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+epidermal+growth+factor+accelerates+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).</li>
<li>Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+T-lymphocytes+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Significance of T-lymphocytes in wound healing.</a> Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).</li>
<li>Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+T-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Wound healing and T-lymphocytes.</a> Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).</li>
<li>Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+in+wounds%3A+pharmacology+and+effect+on+accumulation+of+collagen+in+wounds+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Surgery+%3D+Acta+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice.</a> The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).</li>
<li>Opalenik, S. R., Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+differentiation+of+bone+marrow-derived+cells+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).</li>
<li>Järveläinen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+decorin+in+cutaneous+wound+healing+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).</li>
<li>Luckett, L. R., Gallucci, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+modulates+migration+and+matrix+metalloproteinase+function+in+dermal+fibroblasts+from+IL-6KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice.</a> The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).</li>
<li>Daniel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+postburn+wound+inflammatory+response+by+gammadelta+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells.</a> Shock. 28 (3), 278-283 (2007).</li>
<li>MacLauchlan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion%2C+giant+cell+formation%2C+and+the+foreign+body+response+require+matrix+metalloproteinase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).</li>
<li>Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+thermal+injury+on+wound+infiltration+and+the+dermal+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response.</a> Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+Induces+Oncostatin+M+Expression+in+Human+Chronic+Wound+Macrophages+through+Axl+Receptor+Tyrosine+Kinase+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway.</a> The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).</li>
<li>Deskins, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stromal+cells%3A+identifying+assays+to+predict+potency+for+therapeutic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+murine+wound+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of murine wound macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).</li>
<li>Thomay, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Interleukin-1+Signaling+Improves+the+Quality+of+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing.</a> The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).</li>
<li>Brancato, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+signaling+regulates+the+acute+local+inflammatory+response+to+injury+and+the+fibrosis%2Fneovascularization+of+sterile+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).</li>
<li>Daley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+soluble+product%28s%29+released+from+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils.</a> Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).</li>
<li>Crane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocyte+to+macrophage+transition+in+the+murine+sterile+wound%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound.</a> PloS One. 9 (1), 86660(2014).</li>
<li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-thickness+wounding+of+the+mouse+tail+as+a+model+for+delayed+wound+healing%3A+accelerated+wound+closure+in+Smad3+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+skeletal+growth+arrest+by+cutaneous+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring.</a> Bone. 66, 223-231 (2014).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Model+for+Cutaneous+Wound+Healing+and+Scarring+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).</li>
<li>Crane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+influenza+A+virus+infection+leads+to+suppression+of+the+innate+immune+response+to+dermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury.</a> PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212(2018).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Techniques+Made+Simple%3A+Animal+Models+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
<li>Rittié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+skin+repair+in+humans+and+other+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).</li>
<li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Bone+Marrow-Derived+Cultured+Mesenchymal+Stem+Cells+Delivered+in+a+Fibrin+Spray+Accelerate+Healing+in+Murine+and+Human+Cutaneous+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds.</a> Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).</li>
<li>Lucas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Roles+of+Macrophages+in+Diverse+Phases+of+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+function+and+fate+of+neutrophils+in+sterile+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair.</a> Science. 358 (6359), 111-116 (2017).</li>
<li>Mirza, R. E., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+cell+subsets+to+cytokine+production+during+normal+and+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing.</a> Cytokine. , 1-4 (2014).</li>
<li>Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+Specific+Macrophage+Ablation+Is+Detrimental+to+Wound+Healing+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).</li>
<li>DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIP-1alpha+as+a+critical+macrophage+chemoattractant+in+murine+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).</li>
<li>Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+Sustained+Induction+of+Chemokines+during+Impaired+Wound+Healing+in+the+Genetically+Diabetic+Mouse%3A+Prolonged+Persistence+of+Neutrophils+and+Macrophages+during+the+Late+Phase+of+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).</li>
<li>Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+wound+healing+in+aging+small+mammals%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft twee hardnekkige murine wond modellen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de acute wondgenezing reactie. De eerste methode omvat de chirurgische implantatie van PVA sponzen in de dorsale onderhuidse ruimte. Deze aanpak biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van biopsie-gebaseerde wondmodellen voor het bestuderen van de cellulaire wondgenezingsrespons vanwege het grote aantal cellen en de hoeveelheid wondvloeistoffen verkregen uit de geïsoleerde sponzen. Voor de succesvolle uitvoering ...

Er zijn veel murine model systemen beschikbaar om wondgenezing processen te onderzoeken, elk met specifieke voordelen en beperkingen1,2. De volgende methoden presenteren twee murinewondmodellen, die elk een bepaald aspect van de wondgenezingsrespons aandeorde, en die kunnen worden gebruikt om de oorzaak en het effect van verstoringen in de reactie op letsel te identificeren. Het proces van wondgenezing vindt plaats in verschillende fasen. De eerste fase is inflammatoir, gekenmerkt door de snelle instroom van bloedplaatjes, neutrofielen en monocyten/macrofagen, evenals de productie van ontstekingscytokines en chemokines. Na de oplossing van ontsteking, de omgeving overgangen naar een meer herstellende toestand met de inductie van profibrotische en proangiogene cytokines en groeifactoren. Granulatieweefsel wordt afgezet en neovessels vormen zich met de migratie van myofibroblasten, fibroblasten, epitheelcellen en endotheelcellen. In de laatste fase wordt de voorlopige extracellulaire matrix gerenoveerd en verloopt littekenvorming en wondsluiting2,3,4,5,6,7,8.
Geen enkel murinemodel biedt een systeem om alle stadia van wondgenezing te bestuderen2. Hier worden twee chirurgische wondmodellen beschreven: de ene verduidelijkt acute cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties, en de andere maakt de beoordeling van wondsluiting en histologische analyses mogelijk. Deze twee methoden kunnen op complementaire wijze worden gebruikt om de effecten van een verstoring of comorbiditeit op verschillende aspecten van de wondgenezingsrespons te beoordelen. De dorsale onderhuidse implantatie van polyvinyl alcohol (PVA) sponzen is een systeem dat is gebruikt in knaagdiermodellen voor decennia tot tal van aspecten van cellulaire en granulatie weefsel reacties9,,10,11,12,14,,15,16,17,18,19,20,1420 ,21,22,23,24. Deze aanpak maakt het ophalen van cytokine-rijke wondvloeistoffen en cellulaire infiltreert. In dit model worden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stukken PVA-spons in onderhuidse zakken geplaatst door middel van een incisie van 2 cm gemaakt aan de achterste ruglijn. De incisie wordt gesloten met chirurgische clips, en de sponzen kunnen worden opgehaald op latere tijd punten voor cel-en vloeistofisolatie. Het cellulaire en cytokine-milieu van geïsoleerde sponzen weerspiegelt de normale stadia van acute wondgenezing tot ongeveer 14 dagen na implantatie. Op latere tijdpunten is het model voordeliger voor het bestuderen van granulatieweefselvorming en de vreemde lichaamsrespons1. Met dit systeem is het mogelijk om >106 cellen te isoleren, wat een duidelijk voordeel biedt voor fenotypische en functionele testen en RNA-isolatie, over het isoleren van cellen van andere biopsie-gebaseerde methoden1,22,23,25,26.
De snelheid van wondsluiting wordt bepaald met behulp van het staarthuidexcisiemodel. In dit model, zoals in eerste instantie beschreven door Falanga et al. en gemeld door anderen27,28,29,30, een 1 cm x 0,3 cm volledige dikte sectie van de staart huid wordt verwijderd in de buurt van de basis van de staart. Het wondgebied wordt gemakkelijk gevisualiseerd en kan na verloop van tijd worden gemeten. Als alternatief kan staartweefsel worden geïsoleerd voor histologische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt als een alternatief voor of in combinatie met de gevestigde dorsale punch biopsie methode. Het primaire onderscheid tussen deze twee modellen zijn de snelheid van wondsluiting, de aan- of afwezigheid van bont en de huidstructuur2,31,32. Staarthuidwonden bieden een langer tijdsbestek om de wondsluiting te beoordelen, omdat het ongeveer 21 dagen duurt voordat de volledige sluiting optreedt. Dit is in tegenstelling tot ongespkal dorsale punch biopten, die veel sneller genezen (~ 7-10 dagen), voornamelijk door contractie als gevolg van de werking van de panniculus carnosus. Spalkd rugstompbiopten genezen langzamer en verminderen de effecten van contractiele genezing, maar vertrouwen op de aanwezigheid van een vreemd lichaam om contractiele mechanismen te beperken1,2,27,30,31,33.
De beschreven wondmodellen zijn informatief voor het begrijpen van normale wondgenezingsprocessen bij afwezigheid van verstoring. Terwijl de genezing van knaagdierhuid op zeer significante manieren verschilt van de menselijke huid, waaronder losse structuur, afhankelijkheid van contractiele genezing en andere anatomische verschillen, biedt het murinesysteem bepaalde voordelen voor mechanistische en screeningsstudies. Belangrijkste onder deze is de beschikbaarheid van inteelt stammen en genetische mutanten, genetische traktaat, en lagere kosten. Mechanistisch inzicht dat is opgedaan met murinestudies kan worden vertaald naar complexe diermodellen die de genezing van de menselijke huid, zoals het varkenssysteem2,,31,beter nabootsen.
Naast het onderzoeken van wondgenezingsreacties in de steady state, kunnen deze modellen worden gecombineerd met comorbide aandoeningen om de basis van wondgenezingsdefecten op cellulair, cytokine en brutoweefselniveau te begrijpen. Het is in deze specifieke setting dat de twee modellen in overleg kunnen worden gebruikt om de effecten van een bepaalde comorbide aandoening, zoals postoperatieve longontsteking, te beoordelen op zowel de acute cellulaire wondgenezingsrespons als de snelheid van wondsluiting30.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes, Olympus</td><td>Genesee</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, &ndash;Phenol Red)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>5ml Syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.2-APC Fire750</td><td>BioLegend</td><td>109852</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80-eFluor660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-4801-82</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6C-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553104</td><td>Clone AL-21</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9668-82</td><td>Clone 1A8-Ly6g</td></tr><tr><td>Anti-mouse Siglec-F-APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565183</td><td>Clone E50-2440</td></tr><tr><td>Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9021392</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9334081</td><td></td></tr><tr><td>Blender Bag, 80mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14258201</td><td></td></tr><tr><td>Culture Tube, 16mL, 17x100</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-130</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor506</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Solution, 1M</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-534</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol sponge - large pore size</td><td>Ivalon/PVA Unlimited</td><td></td><td>www.sponge-pva.com</td></tr><tr><td>Povidone-iodine solution, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>3955-16</td><td></td></tr><tr><td>Spray barrier film, Cavilon</td><td>3M</td><td>3346E</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster, 110V</td><td>Seward</td><td>0080/000/AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional tail skin wound models.

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wondgenezing is een complex proces dat de ordelijke progressie van ontsteking, granulatieweefselvorming, fibrose en resolutie vereist. Murinemodellen bieden waardevol mechanistisch inzicht in deze processen; echter, geen enkel model volledig adressen alle aspecten van de wondgenezing reactie. In plaats daarvan is het ideaal om meerdere modellen te gebruiken om de verschillende aspecten van wondgenezing aan te pakken. Hier worden twee verschillende methoden beschreven die betrekking hebben op diverse aspecten van de wondgenezingsrespons. In het eerste model worden polyvinyl alcoholsponzen onderhuids geïmplanteerd langs de muisdorsum. Na het ophalen van spons, cellen kunnen worden geïsoleerd door mechanische verstoring, en vloeistoffen kunnen worden geëxtraheerd door centrifugering, waardoor een gedetailleerde karakterisering van cellulaire en cytokine reacties in de acute wond omgeving. Een beperking van dit model is het onvermogen om de snelheid van wondsluiting te beoordelen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een staarthuidexcisiemodel. In dit model wordt een rechthoekig stuk staarthuid van 10 mm x 3 mm uitgesneden langs het rugoppervlak, in de buurt van de basis van de staart. Dit model kan gemakkelijk worden gefotografeerd voor planimetrische analyse om genezingtarieven te bepalen en kan worden weggesneden voor histologische analyse. Beide beschreven methoden kunnen worden gebruikt in genetisch veranderde muizenstammen, of in combinatie met modellen van comorbide aandoeningen, zoals diabetes, veroudering of secundaire infectie, om wondgenezingsmechanismen op te helderen.

Systemische ontstekingsreactie na PVA sponsimplantatie De PVA spons implantatie operatie genereerde een systemische ontstekingsreactie, zoals blijkt uit de inductie van IL-6 in het plasma 1 dag na het verwonden (Figuur 2A). Andere ontstekingscytokinen, waaronder TNF-α en IL-1β, evenals een reeks chemokines, waaronder CCL2 en CXCL1, werden systemisch geïnduceerd in de eerste 7 dagen na de sponsimplantatie na PVA, en zijn elders beschreven26,</s...

Hier worden twee murine wondgenezingsmodellen beschreven, een ontworpen om cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties te beoordelen en de andere om de snelheid van wondsluiting te kwantificeren. Deze methoden kunnen worden gebruikt met complexe ziektemodellen zoals diabetes om mechanismen van verschillende aspecten van slechte wondgenezing te bepalen.

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Deze modellen kunnen worden geïmplementeerd om verschillende aspecten van de wondgenezingsrespons te beoordelen, waaronder cellulaire en cytokinetiek en wondsluiting. De PVA spons model maakt het herstel van miljoenen wond leukocyten voor fenotypische en functionele analyses, terwijl de staart huid excisie model maakt de gemakkelijke visualisatie van langzaam genezende wonden. De PVA spons en excisional staart wond modellen kunnen worden gebruikt in combinatie met comorbide voorwaarden, zoals diabetes of longontsteking, om hun impact op wondgenezing te begrijpen.Het aantonen van de procedures met Meredith Crane zal Bill Henry zijn, een onderzoeksassistent van mijn lab. Gebruik voor het begin van het experiment een schaar om vellen PVA-spons in stukken van acht bij acht bij vier millimeter te snijden. Rehydrateer de spons stukken in steriele PBS in een bekerglas gedurende 10 minuten voor autoclave steriliseren van de sponzen in de PBS.Wanneer de sponzen zijn afgekoeld, bewaar de sponzen ondergedompeld in PBS op vier graden Celsius. Op de dag van de procedure, plaats zes sponzen per proefdier in een steriele cultuur schotel in een steriele laminaire flow kap, en bevestigen een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde, acht-tot 12-week-oude, man, C57-Black/6 muis. Laat een assistent clippers gebruiken om het haar langs de dorsum en steriel gaas te verwijderen om povidone-jodium oplossing toe te passen op het geschoren gebied twee keer, gevolgd door een enkele 70% ethanol toepassing.De assistent moet de muis vervolgens overbrengen op steriele chirurgische gordijnen geplaatst over een verwarmd pad. Het dragen van steriele handschoenen, gebruik tangen om de rughuid weg te trekken van het onderliggende weefsel, en gebruik steriele chirurgische schaar om een twee centimeter incisie langs de dorsale middellijn ongeveer twee centimeter voorste naar de basis van de staart te maken. Houd de incisie open met steriele tangen, gebruik steriele, gebogen, stompe kant een chirurgische schaar om een onderhuidse zak langs de dorsum te vormen in een van de posities zoals aangegeven in de figuur.Zodra de schaar zijn ingevoegd, open en sluit de tips twee keer om een zak groot genoeg om een ingevoegde spons te houden vormen. Wanneer de zak is gemaakt, gebruik steriele chirurgische schaar om voorzichtig knijp een PVA spons in de cultuur schotel om overtollige PBS te verwijderen. Til vervolgens de spons door een hoek, en, leidt met de hoek gehouden door de schaar, plaats de spons in de onderhuidse zak.Wanneer alle zes sponzen zijn geplaatst zoals aangetoond, gebruik steriele tangen om de ingesneden rughuid samen te knijpen, en sluit de incisie met twee roestvrijstalen wondclips. Voor PVA spons vloeistof isolatie, een tot 14 dagen na implantatie, verwijder de chirurgische nietjes, en open de incisie met getande tangen. Gebruik een schaar om de incisie uit te breiden langs de dorsale middellijn, en gebruik tangen om een spons te halen uit zijn onderhuidse zak.Plaats de spons in het vat van een vijf-milliliter spuit genesteld in een 16-milliliter cultuur buis op ijs, en gebruik schaar om elk bindweefsel dat blijft aanhangen aan het oppervlak van de spons, indien nodig los te koppelen. Wanneer alle sponzen zijn geëxtraheerd en overgebracht zoals aangetoond, centrifugeren de cultuur buis om de wond vloeistof te verzamelen. Om de cellen te isoleren van de PVA sponzen, na het verzamelen van de sponzen zoals net aangetoond, plaats ze in een 15-milliliter conische buis met vijf milliliter hbss collectie medium.Wanneer alle sponzen zijn verzameld, decanteren de spons schorsing in een 80-milliliter blender zak, en hang de zak van het luik van de peddel blender, zodat de peddels zal de sponzen en medium staking. Stel de peddelblender in om 60 seconden op hoog te draaien en druk op start. Wanneer de blender is gestopt, knijp de sponzen in de zak om het medium volledig los te laten, en gebruik een pipet om het medium van de blender zak terug te brengen in de 15-milliliter buis.Pas de instellingen van de peddelblender aan om 30 seconden op hoog te lopen en voeg vijf milliliter medium toe aan de blenderzak. Herhaal het maagproces nog twee keer voordat u de buis van verzameld mediumcentrifugeert. Een rode pellet van cellen en rode bloedcellen moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de conische buis.Meng 900 microliter gedestilleerd water met de cellen gedurende drie tot vijf seconden voordat u de lyse neutraliseert met 100 microliter van 10x PBS en vier milliliter 1x PBS. Verzamel de cellen door centrifugatie, en resuspend de witte cel pellet in het juiste medium voor downstream-analyse. Om een staarthuidwond te creëren, gebruik steriel gaas na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje in de verdoofde, acht-tot twaalf weken oude, man, C57-Black/6 muis, steriel gaas om povidone-jodiumoplossing twee keer toe te passen op de chirurgische site, gevolgd door één toepassing van 70%ethanol.Met behulp van een permanente marker en een vooraf gemaakte sjabloon, traceer een 10-bij-drie-millimeter sectie op het dorsale oppervlak van de staart, 10 millimeter van de staart basis, en plaats de muis op steriele chirurgische gordijnen. Het dragen van steriele chirurgische handschoenen, gebruik maken van een steriele scalpel mes om een volledige dikte incisie langs de rechter-, onderkant en linkerranden van de wond gebied te maken. Met behulp van steriele tangen, schil de afgeslepen huid uit de buurt van de staart, en gebruik steriele chirurgische schaar weg te snijden de bovenste rand van het wondgebied.Gebruik steriel gaas om druk uit te oefenen op de wond om het bloeden te stoppen en breng een spray barrièrefilm aan op het wondbed. Fotografeer vervolgens de wonden van een vaste afstand op regelmatige tijdstippen en analyseer de foto's op planimetrische analyse om de metingen van het wondgebied te bepalen. PVA spons implantatie chirurgie genereert een systemische ontstekingsreactie, zoals blijkt uit de inductie van IL-6 in het plasma een dag na het verwonden.Het aantal cellen dat kan worden teruggewonnen uit PVA spons wonden toeneemt na verloop van tijd, met neutrofielen, monocyten, en macrofagen bestaande uit de primaire cellulaire infiltreren populaties in de sponzen. Neutrofielen worden geïdentificeerd als Ly6G-positieve, Siglec-F-negatieve cellen. Siglec-F-positieve cellen zijn voornamelijk eosinofielen.Gating op de Ly6G-negatieve, Siglec-F-negatieve cellen maakt de identificatie van F4/80-positieve monocyten en macrofagen. F4/80-positieve cellen kunnen verder worden onderscheiden door hun Ly6C expressie om Ly6C hoge ontstekingsmonocyten en Ly6C lage monocyten-afgeleide macrofagen te onderscheiden. De excisional staart huid model biedt een alternatief voor de dorsale huid punch biopsie methode om wond sluiting in stevige huid ontbreekt dichte vacht te bestuderen.Wondsluiting kan worden gekwantificeerd door het gebied van het wondbed na verloop van tijd te meten. De staart huid wond kan ook worden waargenomen in dwarsdoorsnede door histologische analyse via H en E en Masson's trichrome kleuring. In deze beelden worden de zijdelingse marges van de uitgesneden huid aangegeven door de pijlpunten op het rugoppervlak van de staart.Om te begrijpen steady-state wond genezing, therapeutische verbindingen of interventies kunnen ook worden getest door hun injectie rechtstreeks in de PVA spons of door levering aan de staart wond bed.

assessment-acute-wound-healing-using-dorsal-subcutaneous-polyvinyl

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een handig hulpmiddel om de effecten van drugs, groeifactoren, en / of gemanipuleerde cellen in een diermodel van wondheling te analyseren wordt beschreven. Deze techniek maakt gebruik van de eigenschappen van een polyvinyl alcohol (PVA) spons leveren en bevatten de gewenste behandeling en een platform worden uitgesneden en geanalyseerd voorzien.

De polyvinylalcohol Sponge Model Implantatie

Een murine model van cutane wondgenezing die kunnen worden gebruikt om therapeutische samenstellingen te beoordelen fysiologische en pathofysiologische instellingen.

Muizenmodel van wondgenezing

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

De rat, door zijn omvang, de beschikbaarheid en vrij volgzaam gedrag, is gebruikt als een onderzoeksmodel voor vele jaren. Het doel van dit protocol is om de rat als een ischemische huid wondgenezing model te gebruiken om waardevolle inzichten in de pathofysiologie van chronische wonden te bieden.

Demonstratie van de Rat ischemische Skin wondmodel

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Dit protocol beschrijft hoe bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen kunnen worden gegenereerd en hoe u de wonden vervolgens controleren, oogsten en voorbereiden op morfometrische analyse. Inbegrepen is een diepgaande beschrijving van het gebruik van seriële histologische secties om morfometrische defecten te definiëren, nauwkeurig te kwantificeren en op te sporen.

Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis

Hier demonstreren we een geoptimaliseerde techniek voor het beoordelen van wondherstel met behulp van ex vivo menselijke huid in combinatie met een whole-mount kleuringsbenadering. Deze methodologie biedt een preklinisch platform voor de evaluatie van mogelijke wondtherapieën.

Menselijke Ex vivo wondmodel en whole-mount staining benadering om huidherstel nauwkeurig te evalueren

Deze studie presenteert twee cruciale experimentele technieken: de constructie van een muiswondmodel voor het beoordelen van wondsluiting en de voorbereiding van suspensies van enkele cellen uit muishuid om de celviabiliteit te behouden.

Muizenwondmodellen en het bereiden van single-cell suspensies

Wonden vormen een wereldwijde gezondheidsuitdaging. Deze studie ontwikkelde een gestandaardiseerde fotocabine die gebruikmaakt van digitale planimetrie om de variabiliteit van wondmetingen te minimaliseren. Monitoring van wonden bij muizen gedurende 14 dagen toonde een aanvankelijke toename van het wondgebied en de omtrek, gevolgd door geleidelijke sluiting. Deze methodologie kan helpen bij het evalueren van de kinetiek van wondsluiting in preklinische modellen.

Digitale planimetrie voor het beoordelen van de kinetiek van wondsluiting in een muismodel

Een rattenhuidwondmodel dat de evaluatie van verschillende therapeutische middelen onder fysiologische of pathologische omstandigheden over de verschillende stadia van het genezingsproces mogelijk maakt, wordt beschreven. Daarnaast wordt een protocol beschreven voor het uitvoeren van handmatige planimetrie om de contractiesnelheid van wonden tijdens weefselherstel te monitoren.

Een Rat Chirurgisch Huidwondmodel: Een benadering voor wondgenezingsstudies en biomateriaalevaluatie

Leer twee muizenwondgenezingsmodellen beoordelen: de PVA-sponsimplantatie en de excisionele staarthuidwond. Deze methoden analyseren cellulaire en cytokine-kinetiek bij acute wondgenezing.

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models. (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

Meer video's verkennen