Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Analyse van zijpopulatiecellen is een van de meest gebruikte methoden om kankerstamcellen uit tumorweefsels en tumorcellijnen te isoleren en te identificeren. Deze test is handig, snel en kosteneffectief. Deze methode kan bijdragen aan een beter begrip van het effect van genen of andere extracellulaire en intracellulaire signalen op de stameigenschappen van tumorcellen.

Veel factoren kunnen het percentage SP-cellen in deze analyse beïnvloeden, dus het is van cruciaal belang om de juiste omstandigheden te verkennen vóór het formele experiment. Zaadtumorcellen in een zes-put plaat, en incubeer ze in een 37 graden Celsius incubator geleverd met 5%kooldioxide. Wanneer de celdichtheid ongeveer 90% bereikt, aspireer dan het kweekmedium en was de cellen tweemaal met drie milliliter PBS.

Voeg vervolgens 500 microliters van 0,25% trypsine-EDTA toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende één tot drie minuten op 37 graden Celsius. Tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken, voeg drie milliliter PBS aangevuld met 2% FBS toe aan elke put en pipetteer de cellen drie tot vijf keer op en neer om de celklonters te verspreiden. Onderzoek de celsuspensie onder de microscoop.

Als er celklonters aanwezig zijn, laat u de suspensie door een zeef van 70 micrometer lopen. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende vijf minuten op 200 maal g. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in drie milliliter PBS aangevuld met 2%FBS, waarbij de cellen drie tot vijf keer op en neer worden geleid om te mengen.

Tel cellen onder de microscoop met behulp van een hemocytometer en verdun ze in PBS aangevuld met 2%FPS tot een uiteindelijke concentratie van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Bereid twee reageerbuizen met een ronde bodem van vijf milliliter, polystyreen, ronde bodem en voeg één milliliter van de celsuspensie toe aan elke buis. Label de ene buis als reageerbuis en de andere als blokkeerbuis.

Bereid een oplossing van blokker voor door deze tot de juiste concentratie te verdunnen. Voeg het toe aan de blokker controlebuis en meng goed, incubeer de buis vervolgens op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Schud de buis om de 10 minuten.

Bereid een oplossing van Hoechst 33342 door deze tot de juiste concentratie te verdunnen. Voeg het apart toe aan de reageerbuis en blokkerregelbuis en meng goed en incubeer de buizen vervolgens gedurende 60 minuten op 37 graden Celsius. Schud de buizen om de 10 minuten.

Centrifugeer de cellen na de incubatie gedurende vijf minuten bij 200 keer g en vier graden Celsius en aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de cellen in elke buis met een milliliter ijskoude PBS aangevuld met 2%FBS en pipetteer de cellen vervolgens op en neer om te mengen. Voeg één microliter propidiumjodide van één milligram per milliliter, of PI, toe aan elke buis en meng.

Klik op het tabblad Parameters in de flowcytometersoftware. Kies eerst de parameters van respectievelijk FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red en PI. Kies ten tweede de logaritmische schaal voor de PI-parameter.

Kies ten slotte gebieds- en breedteschalen voor respectievelijk de parameters FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red en PI. Voer de cellen eerst uit de reageerbuis en voer vervolgens de cellen uit de blokkeerbesturingsbuis met dezelfde spanningen en poorten. Verzamel 20 tot 100.000 gebeurtenissen uit elk monster om het percentage SP-cellen te analyseren.

Deze methode werd gebruikt om het aandeel SP-cellen in de MDA-MB-231 menselijke borstkankercellijn te detecteren. De dot plot van FSC-A versus PI-A toonde een populatie van dode cellen, celresten en de belangrijkste populatie van PI negatieve cellen, die werd onderworpen aan verdere analyse. Een eencellige populatie die afkwam van het puntplot van FSC-A versus FSC-W en het puntplot van SSC-A versus SSC-W werd gebruikt om het aandeel SP-cellen te analyseren, dat ongeveer 0,9% was in onbehandelde cellen en ongeveer 0,09% in cellen die met reserpine werden behandeld.

Verschillende kleuringsconcentraties van Hoechst 33342 werden getest op MDA-MB-435 cellen, en er werd vastgesteld dat twee microgram per milliliter optimaal was voor SP-analyse. Lage concentraties maakten het moeilijk om SP-cellen te onderscheiden van andere populaties, terwijl hoge concentraties ervoor zorgden dat SP-cellen verdwenen. Verapamil en reserpine werden getest om de juiste blokker voor de MDA-MB-435 cellen te bepalen.

Ongeveer 0,4% van de cellen verdreef de kleurstof na de verapamil-behandeling, maar de verhouding daalde tot ongeveer 0,1% na reserpinebehandeling, wat aantoont dat reserpine een geschiktere blokker is voor deze cellijn. Dit protocol werd ook gebruikt om het aandeel SP-cellen te bepalen in A549 menselijke longadencarcinoomcellen behandeld met STAT3 activator colivelin en in T47D menselijke borstkankercellen behandeld met FRA1-remmer SKLB816. Deze test geeft aanwijzingen voor het regulerende effect van signaleringsroutes op de kenmerken van kankerstamcellen en vergemakkelijkt de ontdekking van nieuwe mechanismen, die uiteindelijk de gerichte therapie van tumoren kunnen begeleiden.