Name: Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Leer een snelle en kosteneffectieve methode om zijpopulatiecellen in vaste tumorcellijnen te meten. Deze techniek helpt onderzoekers kankerstamcellen te identificeren en tumorbiologie beter te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 en 81972787; Natural Science Foundation van Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten, Nankai University 63191153.

1. Celvoorbereiding
<ol><li>Celvertering en neutralisatie<ol>
<li>Zaadtumorcellen (zoals MDA-MB-231 cellen) in een 6 putplaat, en kweek ze in een incubator van 37 °C geleverd met 5% CO2.</li>
		<li>Oogst cellen wanneer hun dichtheid ongeveer 90% bereikt. Aspireer het kweekmedium grondig en was de cellen 2x met 3 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Om de effecten van signaalwegremmers (bijv. FRA1-remmer) of activators (bijv. STAT3-activator) op de stameigenschappen van tumorcellen te onderzoeken, worden tumorcellen in een 6-putplaat gezaaid en gedurende een bepaalde tijd vóór de oogst voorbehandeld met remmers of activatoren.</li>
		<li>Voeg 500 μL 0,25% trypsine-EDTA toe aan elke put van de 6-putplaat, plaats de plaat gedurende 1-3 minuten (min) in een incubator op 37 °C en tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken. OPMERKING: Langdurige spijsvertering heeft invloed op het SP-profiel als gevolg van veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen.</li>
		<li>Voeg 3 ml PBS aangevuld met 2% foetale runderserum (FBS) toe aan elke put van de 6-putplaat om de spijsvertering te beëindigen en pipetteer de cellen voorzichtig 3-5x op en neer om de celklonters te verspreiden.</li>
		<li>Voeg 0,5 ml celsuspensie toe aan een put van een nieuwe 6-putplaat en onderzoek deze onder een microscoop. Als celklonters worden waargenomen, geeft u de celsuspensie door een 70 μM celzeef. OPMERKING: Dit is een optionele stap.</li>
		<li>Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer cellen op 200 x g gedurende 5 min naar pelletcellen. Verwijder het supernatant en resuspend ze in 3 ml PBS aangevuld met 2% FBS. Pipetteer de cellen 3-5x op en neer om grondig te mengen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celtellingen<ol>
<li>Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng deze met een trypanblauwe oplossing van 50 μL. Pipet 10 μL van het mengsel om het aantal levende cellen te tellen met behulp van een standaardmethode, zoals een hemocytometer.</li>
		<li>Verdun de cellen in PBS aangevuld met 2% FBS tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan een polystyreenronde reageerbuis met een afgeronde bodem van 5 ml en bereid twee monsterbuizen voor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celbeitsen met Hoechst 33342
<ol><li>Voeg Hoechst 33342 toe aan één buis om een geschikte eindconcentratie te bereiken. OPMERKING: De juiste concentratie Van Hoechst 33342 is bijvoorbeeld 3 μg/ml voor MDA-MB-231 cellen.</li>
	<li>Voeg een blokker (bijv. Fumitremorgin C, Verapamil of Reserpine) toe aan een andere buis tot een geschikte eindconcentratie en incubeer de buis gedurende 30 minuten bij 37 °C voordat u dezelfde concentratie Hoechst 33342 toevoegt als beschreven in stap 2.1. OPMERKING: Voor MDA-MB-231 cellen is de juiste blokker Reserpine (40 μM). Reserpine wordt gebruikt als een blokkeringsbesturingselement om de afwezigheid van cellen in het gated SP-gebied te verifiëren.</li>
	<li>Bereid verschillende buizen met cellen voor en voeg Hoechst 33342 toe aan verschillende concentratiegradiënten. Kies na een flowcytometrietest de juiste concentratie op basis van het profiel en de verhouding SP. OPMERKING: Dit is een optionele stap die wordt gebruikt om de juiste concentratie van Hoechst 33342 te definiëren.</li>
	<li>Bereid verschillende buizen met cellen voor, voeg de blokker toe aan verschillende concentratiegradiënten, incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens Hoechst 33342 toe aan een geschikte concentratie. Kies na de flowcytometrietest de juiste concentratie op basis van de afwezigheid van cellen in het gated SP-gebied. OPMERKING: Dit is een optionele stap die wordt gebruikt om de juiste concentratie blokker te definiëren.</li>
	<li>Plaats de buizen in een incubator van 37 °C en incubeer ze gedurende 60 minuten en schud de buizen elke 10 minuten. OPMERKING: Het grondig schudden van buizen is belangrijk voor kleuring, omdat het zorgt voor volledig contact tussen de cellen en de kleurstof voor betere kleurresultaten.</li>
	<li>Centrifugeer na de incubatie de cellen op 200 x g, 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer het supernatant zorgvuldig, omdat de cellen zeer losse en onstabiele pellets vormen.</li>
	<li>Resuspend cellen van elke buis in 1 ml ijskoud PBS aangevuld met 2% FBS en pipet de cellen op en neer 3-5x om grondig te mengen. Voeg 1 μL propidiumjodide (PI) van 1 μL toe aan de suspensie van elke buis om dode cellen te identificeren. OPMERKING: Alle procedures in deze stap moeten worden uitgevoerd bij 4 °C om de efflux van Hoechst 33342 uit de tumorcellen te remmen. De buizen moeten worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht.</li>
</ol>3. Analyse per flow cytometrie
OPMERKING: Instructies voor het gebruik van de flowcytometersoftware (zie materiaaltabel) worden in deze sectie beschreven en aanvullende figuren 1–10.
<ol><li>Klik in de flowcytometersoftware op de mapknop. Klik op de knop Experiment en klik vervolgens op Nieuw experiment ( aanvullendefiguur 1A,B).</li>
	<li>Klik op de knop OK. "Experiment_001" verschijnt onder de MAP (Aanvullende figuur 2A,B).</li>
	<li>Klik op de knop Experiment_001 om de mapnaam te wijzigen in een specifieke naam (bijvoorbeeld "20191118-SP"). Klik op Enter. De nieuwe naam ("20191118-SP") verschijnt onder FOLDER (Aanvullende figuur 3A,B).</li>
	<li>Klik op de knop Nieuw exemplaar om een exemplaar toe te voegen aan de nieuwe experimentmap ("20191118-SP"). Klik op de knop Nieuwe buis om een buis aan het monster toe te voegen. Klik op de pijlpuntknop (aanvullende figuur 4A-C).</li>
	<li>Klik op de knop Parameters en stel de parameters van de flowcytometer in (Aanvullende figuur 5).<ol>
<li>Gebruik een 610 nm dichroïsche spiegel short-pass (DMSP) om de emissiegolflengten te scheiden. Gebruik een 450/20 nm BP-filter om de blauwe fluorescentie te verzamelen en een EFLP van 675 nm om de rode fluorescentie te verzamelen. OPMERKING: Hoechst 33342 is opgewonden met een UV-laser bij 355 nm en PI is opgewonden bij 488 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de celmonsters uit op de flow cytometer. OPMERKING: SP-cellen kunnen onder steriele omstandigheden worden gesorteerd door fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS). In totaal moeten 100.000-500.000 cellen worden verzameld voor de vervolgexperimenten.<ol><li>Run cellen bevlekt met Hoechst 33342 op de flow cytometer.<ol>
<li>Plaats buizen met cellen bevlekt met Hoechst 33342 op de cytometer.</li>
			<li>Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik vervolgens op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". Geef de puntplot weer van het voorwaartse spreidingspulsgebied (FSC-A, X-as ingesteld op lineaire modus) versus de PI-fluorescentie (Y-as ingesteld op logaritmische schaal). Pas de spanningen aan om de levende cellen aan de rechterkant en de niet-levende cellen, die fel gekleurd zijn met PI, in de linkerbovenhoek weer te geven. Stel vervolgens een polygoonpoort in om dode cellen en celresten uit te sluiten (figuur 1A) door op de knop Polygon Gate te klikken om de P1-subset, ook bekend als FSC-A, PI-A-subset ( Aanvullendefiguur 6A, B ) tegaten.</li>
			<li>Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". Geef de puntplot weer van FSC-A (X-as) versus voorwaartse spreidingspulsbreedte (FSC-W, Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P1 onder de knop Populaties weergeven. Klik op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P2-subset (ook wel FSC-A, FSC-W-subset genoemd) te gaten. Dit zal cellen met grote volumes uitsluiten (Aanvullende figuur 7A-C en figuur 1A).</li>
			<li>Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". Geef de puntplot weer van het pulsgebied van de zijverstrooiing (SSC-A, X-as) versus de breedte van de zijverstrooiingspuls (SSC-W, Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P2 onder De populaties weergeven. Klik vervolgens op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P3-subset (ook bekend als SSC-A, SSC-W-subset) te gaten. Hierdoor krijgt een celpopulatie met uniforme granulariteit (aanvullende figuur 8A-C en figuur 1A).</li>
			<li>Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". Geef de puntplot weer van Hoechst Red-A (X-as) versus Hoechst Blue-A (Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P3 onder de knop Populaties weergeven. Klik op de knop Polygon Gate om een polygoonpoort te maken om de P4-subset (ook bekend als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A subset) te gaten. Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop Populatiehiërarchie weergeven om de populatiehiërarchie weer te geven. OPMERKING: De puntplot toont drie verschillende populaties: 1) een G0-G1-fasepopulatie in de buurt van het midden van de grafiek; 2) een S-G2/M fase populatie in de rechterbovenhoek; 3) de SP. De SP wordt vervolgens voor verdere analyse geheisd (aanvullende figuur 9A-D en figuur 1A). Als de puntplot van Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A geen SP-profiel vertoont dat vergelijkbaar is met dat in figuur 1A,moeten de spanningen worden aangepast totdat een vergelijkbaar profiel wordt gezien. Pas ondertussen alle bovenstaande poorten dienovereenkomstig aan.</li>
			<li>Nadat u het poortgebied van de SP-cellen hebt bepaald, klikt u op Gegevens verzamelen om 20.000-100.000 gebeurtenissen uit elk monster te verzamelen om het percentage SP-cellen te analyseren ( Aanvullendefiguur 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Voer de Hoechst 33342-bevlekte cellen uit die zijn behandeld met een blokker op de flowcytometer.<ol>
<li>Plaats buizen met blokker op de cytometer en laat cellen lopen met dezelfde spanningen en poorten om verder te controleren of de spanningen en poorten op de juiste manier zijn geselecteerd. OPMERKING: In vergelijking met Hoechst 33342 kleuring alleen, zou slechts een zeer klein deel van de cellen, indien aanwezig, moeten verschijnen in het omheinde gebied van de SP (Figuur 1B).</li>
			<li>Verzamel 20.000-100.000 gebeurtenissen uit elk monster om het percentage SP-cellen te analyseren.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Gegevensanalyse
OPMERKING: Instructies voor het gebruik van de flow cytometrie analyse software (zie tabel van materialen) worden beschreven in deze sectie en aanvullende figuren 11–16.
<ol><li>Kopieer de bestanden in fcs-formaat naar een computer, open de flow cytometrie analyse software en sleep een voorbeeldbestand naar de software (Aanvullende figuur 11A,B).
</li>
	<li>Poortcellen en verkrijg het percentage SP-cellen.<ol>
<li>Dubbelklik op dit voorbeeldbestand, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". Maak vervolgens een polygoonpoort en klik op de knop OK om de SUBSET FSC-A, PI-A(Aanvullende figuur 12A-E)te verkrijgen.</li>
		<li>Dubbelklik op het SUBSETBESTAND FSC-A, PI-A, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". Maak vervolgens een rechthoekige poort en klik op de knop OK om de subset FSC-A, FSC-W te verkrijgen (Aanvullende figuur 13A-E).</li>
		<li>Dubbelklik op het FSC-A, FSC-W subsetbestand, klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". Maak vervolgens een rechthoekige poort en klik op de knop OK om de subset SSC-A, SSC-W(Aanvullende figuur 14A-E)te verkrijgen.</li>
		<li>Dubbelklik op het subsetbestand SSC-A, SSC-W, klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". Maak vervolgens een polygoonpoort en klik op de knop OK om de subset Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (Aanvullende figuur 15A-E) te verkrijgen.</li>
		<li>Open de lay-outeditor door op de knop Lay-outeditor openen te klikken. Sleep het SSC-A- en SSC-W-subsetbestand naar layout-editor en klik vervolgens op de knop Klik om lay-outvenster op te slaan in bestand om de afbeeldingsresultaten op te slaan ( Aanvullende figuur16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sla de werkruimte op om de gating-informatie te bewaren bij het sluiten van de software.</li>
	<li>Voer t-testanalyses uit met statistische analysesoftware om het verschil tussen twee groepen te vergelijken. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significant gedefinieerd.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li>
<li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B+CD24%28-%29+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor%2Fstem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90%2B+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology%3A+can+we+translate+into+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncolcology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16(2015).</li>
<li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18(2005).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells%3A+Beyond+Chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li>
<li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2%2FBCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li>
<li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp%2C+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li>
<li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+side+order+of+stem+cells%3A+the+SP+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li>
<li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li>
<li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK2%2FSTAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44%28%2B%29CD24%28-%29+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li>
<li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Lead+to+Drug+Candidate%3A+Optimization+of+3-%28Phenylethynyl%29-1H-pyrazolo%5B3%2C4-d%5Dpyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicnal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li>
<li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li>
<li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+%28SP%29+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li>
<li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+the+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23(2013).</li>
<li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li>
<li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624(2019).</li>
<li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+%3A+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li>
<li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity%3A+A+Quantitative%2C+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188(2016).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li>
<li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Er zijn een aantal belangrijke punten om in gedachten te houden voor de SP-test. De eerste is de selectie van een goede blokker, zoals Verapamil of Reserpine, voor elke cellijn, omdat de "gate" locatie van de SP-cellen wordt bepaald op basis van de positie waarin een groot aantal SP-cellen verdwijnt na de toevoeging van de blocker. Voor de MDA-MB-231 cellijn werkt Reserpine goed. Voor andere cellijnen kunnen verschillende blokkers echter beter werken.
De tweede is de concentratie van Hoechst 3...

Kankerstamcellen (CSC's) zijn deelverzamelingen van cellen met zelfvernieuwingsvermogen en multipel differentiatiepotentieel, die een vitale rol spelen bij tumorgroei, metastase en recidief1,2. Momenteel zijn CSC's geïdentificeerd om te bestaan in een verscheidenheid van kwaadaardige tumoren, met inbegrip van long-, hersen-, alvleesklier-, prostaat-, borst- en leverkankers3,4,5,6,7,8,9. Identificatie van CSC's in deze tumoren is voornamelijk gebaseerd op de aanwezigheid van oppervlaktemarkereiwitten, zoals hoge en/of lage expressie van CD44, CD24, CD133 en Sca-19,10, maar een unieke marker die CSC's van niet-CSC's kan onderscheiden, is tot nu toe niet gerapporteerd. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt om CSC's in tumorweefsel of tumorcellijnen te identificeren en te zuiveren. Deze technieken zijn ontworpen op basis van de specifieke eigenschappen van CSC's. Onder hen, assays en sortering van zijpopulatie (SP) cellen zijn twee van de meest gebruikte methoden.
SP-cellen werden oorspronkelijk ontdekt door Goodell et al.11, toen ze hematopoëtische stamcellen in beenmergcellen van muizen kenmerkten. Toen de beenmergcellen van de muis werden gelabeld met de fluorescerende kleurstof Hoechst 33342, verscheen een kleine groep Hoechst 33342 zwak bevlekte cellen in de tweedimensionale puntplot van een flowcytometrietest. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof en heeft ten minste twee bindingsmodi die leiden tot verschillende spectrale kenmerken. Bij het bekijken van fluorescentie-emissie op twee golflengten tegelijkertijd, kunnen meerdere populaties worden onthuld12. In hun test werd de Hoechst 33342 opgewekt bij 350 nm en werd de fluorescentie gemeten met behulp van het 450/20 nm band-pass (BP) filter en 675 nm edge filter long-pass (EFLP)11. Vergeleken met de hele populatie beenmergcellen werd deze groep cellen verrijkt met hematopoëtische stamcellen genaamd SP-cellen11. SP-cellen kunnen Hoechst 33342 snel verdrijven. De efflux van deze kleurstof is gerelateerd aan ATP-binding cassette (ABC) transporters13, die kunnen worden geremd door sommige middelen zoals Fumitremorgin C14, Verapamil en Reserpine15,16. Daarna werden verschillende verhoudingen SP-cellen gedetecteerd in een verscheidenheid aan weefsels, organen, tumorweefsels en tumorcellijnen17,18,19. Deze SP-cellen hebben veel kenmerken van stamcellen17,19.
Dit manuscript beschrijft Hoechst 33342 etikettering en kleuring van gekweekte tumorcellen en de analyse van SP-cellen door flowcytometrie. Bovendien wordt optimalisatie van de Concentratie Hoechst 33342 en de juiste blokkerselectie voor een specifieke tumorcellijn met behulp van deze aanpak getoond. Ten slotte worden de effecten van stemheidsbevordering of remmingssignalen op het aandeel SP in tumorcellen aangetoond. De experimentele voorbeelden tonen aan dat analyse van SP kan worden gebruikt om de effecten van verschillende signalen te onderzoeken, zoals genexpressie, kleine remmers, activatoren, cytokinen en chemokinen, op tumorstamheid. In vergelijking met andere methoden voor isolatie en zuivering van CSC's, zoals het sorteren van CD44+/ CD24- populatie, aldehydedehydrogenase (ALDH) analyse en tumorbolvormingstesten, is deze methode gemakkelijker te manipuleren en is het kosteneffectief.

<table><tbody><tr><td>6 well cell culture plate</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9.5 cm2 (approx.)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biological Industries (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Flowcytometer software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Flowcytometrie analysesoftware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td></tr><tr><td>Polystyreen ronde bodem testbuis</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propidiumjodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-fenylfenanthridine diiodide</td></tr><tr><td>Reserpine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td>(3&beta;, 16&beta;, 17&alpha;, 18&beta;, 20&alpha;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carbonzuurmethylester</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>Verstrekt door Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%), fenolrood</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilhydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimethoxyfenylethyl)methylamino]
-2-(3,4-dimethoxyfenyl)-2-isopropylvaleronitrilhydrochloride</td></tr></tbody></table>

analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Kankerstamcellen (CSC's) zijn een belangrijke oorzaak van tumorgroei, metastase en recidief. Isolatie en identificatie van CSC's zijn van groot belang voor tumoronderzoek. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt voor de identificatie en zuivering van CSC's uit tumorweefsels en tumorcellijnen. Scheiding en analyse van zijpopulatiecellen (SP) zijn twee van de meest gebruikte methoden. De methoden zijn gebaseerd op het vermogen van CSC's om fluorescerende kleurstoffen snel te verdrijven, zoals Hoechst 33342. De efflux van de kleurstof wordt geassocieerd met de ATP-binding cassette (ABC) transporters en kan worden geremd door ABC transporter remmers. Methoden voor het kleuren van gekweekte tumorcellen met Hoechst 33342 en het analyseren van het aandeel van hun SP-cellen door flowcytometrie worden beschreven. Deze test is handig, snel en kosteneffectief. Gegevens die in deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen aan een beter begrip van het effect van genen of andere extracellulaire en intracellulaire signalen op de stameigenschappen van tumorcellen.

Volgens deze methode werden vier experimentele SP-analyses uitgevoerd. In de eerste ontdekten we het aandeel SP-cellen in MDA-MB-231, een drievoudige negatieve menselijke borstkankercellijn, onder normale omstandigheden. Na het tellen van de cellen werd Hoechst 33342 toegevoegd aan één buis met 1 x 106 cellen tot een eindconcentratie van 3 μg/ml. Reserpine en Hoechst 33342 werden aan een andere buis toegevoegd aan eindconcentraties van respectievelijk 40 μM en 3 μg/ml. PI werd aan beide buizen toegevoegd. De p...

Een handige, snelle en kosteneffectieve methode om het aandeel zijpopulatiecellen in solide tumorcellijnen te meten, wordt gepresenteerd.

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Analyse van zijpopulatiecellen is een van de meest gebruikte methoden om kankerstamcellen uit tumorweefsels en tumorcellijnen te isoleren en te identificeren. Deze test is handig, snel en kosteneffectief. Deze methode kan bijdragen aan een beter begrip van het effect van genen of andere extracellulaire en intracellulaire signalen op de stameigenschappen van tumorcellen.Veel factoren kunnen het percentage SP-cellen in deze analyse beïnvloeden, dus het is van cruciaal belang om de juiste omstandigheden te verkennen vóór het formele experiment. Zaadtumorcellen in een zes-put plaat, en incubeer ze in een 37 graden Celsius incubator geleverd met 5%kooldioxide. Wanneer de celdichtheid ongeveer 90% bereikt, aspireer dan het kweekmedium en was de cellen tweemaal met drie milliliter PBS.Voeg vervolgens 500 microliters van 0,25% trypsine-EDTA toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende één tot drie minuten op 37 graden Celsius. Tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken, voeg drie milliliter PBS aangevuld met 2% FBS toe aan elke put en pipetteer de cellen drie tot vijf keer op en neer om de celklonters te verspreiden. Onderzoek de celsuspensie onder de microscoop.Als er celklonters aanwezig zijn, laat u de suspensie door een zeef van 70 micrometer lopen. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende vijf minuten op 200 maal g. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in drie milliliter PBS aangevuld met 2%FBS, waarbij de cellen drie tot vijf keer op en neer worden geleid om te mengen.Tel cellen onder de microscoop met behulp van een hemocytometer en verdun ze in PBS aangevuld met 2%FPS tot een uiteindelijke concentratie van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Bereid twee reageerbuizen met een ronde bodem van vijf milliliter, polystyreen, ronde bodem en voeg één milliliter van de celsuspensie toe aan elke buis. Label de ene buis als reageerbuis en de andere als blokkeerbuis.Bereid een oplossing van blokker voor door deze tot de juiste concentratie te verdunnen. Voeg het toe aan de blokker controlebuis en meng goed, incubeer de buis vervolgens op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Schud de buis om de 10 minuten.Bereid een oplossing van Hoechst 33342 door deze tot de juiste concentratie te verdunnen. Voeg het apart toe aan de reageerbuis en blokkerregelbuis en meng goed en incubeer de buizen vervolgens gedurende 60 minuten op 37 graden Celsius. Schud de buizen om de 10 minuten.Centrifugeer de cellen na de incubatie gedurende vijf minuten bij 200 keer g en vier graden Celsius en aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de cellen in elke buis met een milliliter ijskoude PBS aangevuld met 2%FBS en pipetteer de cellen vervolgens op en neer om te mengen. Voeg één microliter propidiumjodide van één milligram per milliliter, of PI, toe aan elke buis en meng.Klik op het tabblad Parameters in de flowcytometersoftware. Kies eerst de parameters van respectievelijk FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red en PI. Kies ten tweede de logaritmische schaal voor de PI-parameter.Kies ten slotte gebieds- en breedteschalen voor respectievelijk de parameters FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red en PI. Voer de cellen eerst uit de reageerbuis en voer vervolgens de cellen uit de blokkeerbesturingsbuis met dezelfde spanningen en poorten. Verzamel 20 tot 100.000 gebeurtenissen uit elk monster om het percentage SP-cellen te analyseren.Deze methode werd gebruikt om het aandeel SP-cellen in de MDA-MB-231 menselijke borstkankercellijn te detecteren. De dot plot van FSC-A versus PI-A toonde een populatie van dode cellen, celresten en de belangrijkste populatie van PI negatieve cellen, die werd onderworpen aan verdere analyse. Een eencellige populatie die afkwam van het puntplot van FSC-A versus FSC-W en het puntplot van SSC-A versus SSC-W werd gebruikt om het aandeel SP-cellen te analyseren, dat ongeveer 0,9% was in onbehandelde cellen en ongeveer 0,09% in cellen die met reserpine werden behandeld.Verschillende kleuringsconcentraties van Hoechst 33342 werden getest op MDA-MB-435 cellen, en er werd vastgesteld dat twee microgram per milliliter optimaal was voor SP-analyse. Lage concentraties maakten het moeilijk om SP-cellen te onderscheiden van andere populaties, terwijl hoge concentraties ervoor zorgden dat SP-cellen verdwenen. Verapamil en reserpine werden getest om de juiste blokker voor de MDA-MB-435 cellen te bepalen.Ongeveer 0,4% van de cellen verdreef de kleurstof na de verapamil-behandeling, maar de verhouding daalde tot ongeveer 0,1% na reserpinebehandeling, wat aantoont dat reserpine een geschiktere blokker is voor deze cellijn. Dit protocol werd ook gebruikt om het aandeel SP-cellen te bepalen in A549 menselijke longadencarcinoomcellen behandeld met STAT3 activator colivelin en in T47D menselijke borstkankercellen behandeld met FRA1-remmer SKLB816. Deze test geeft aanwijzingen voor het regulerende effect van signaleringsroutes op de kenmerken van kankerstamcellen en vergemakkelijkt de ontdekking van nieuwe mechanismen, die uiteindelijk de gerichte therapie van tumoren kunnen begeleiden.

analysis-of-side-population-in-solid-tumor-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

The following protocol describes a method for isolating the side population of T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL) tumor cells, consisting of stem cells, from an adult Zebrafish. The side population lacks prominent cell markers and hence we use Hoechst 33342 dye efflux assay to isolate them.

Side Population Assay: A Method to Isolate Side Population of Tumor Cells from Zebrafish

In this video, we describe the isolation of a subpopulation of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines using fluorescence-activated cell sorter or FACS. The isolated side population of cells can be used for further downstream analysis.

Cancer Side Population Discrimination Assay: A Method to Isolate Cancer Stem-like Cells Using Hoechst Dye Efflux Assay

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Methoden die de karakterisering en isolatie van stamcellenpopulaties van biologische monsters mogelijk maken, zijn cruciaal voor het voorschot van stamcelgerichte behandelingen in kanker en daarbuiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor kanker stamcellenisolatie met behulp van het kleurstof geactiveerde zijpopulatie fenotype.

De DNA-kleurstof geactiveerde zijbevolkingsfenotype gebruiken om de kankerstamcellen van biologische monsters te detecteren en te zuiveren

Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.

Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Hier laten we zien dat krachtige lasers van 375 nm en 405 nm Hoechst 33342 effectief kunnen exciteren en kunnen dienen als een levensvatbaar alternatief voor de 355 nm-laser voor celdetectie van zijpopulaties (SP), waardoor het bereik van beschikbare lasers in flowcytometrietoepassingen wordt uitgebreid.

Effectieve detectie van Hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie

Leer een snelle en kosteneffectieve methode om zijpopulatiecellen in vaste tumorcellijnen te meten. Deze techniek helpt onderzoekers kankerstamcellen te identificeren en tumorbiologie beter te begrijpen.

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Meer video's verkennen