Name: Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer een ex vivo methode voor het isoleren van hippocampale arteriolen en capillairen uit muizenhersenen voor drukmyografie. Deze techniek maakt gedetailleerde studies van vasculaire signalering mogelijk zonder storende effecten van omliggend weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Jules Morin bedanken voor de inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door Awards van de CADASIL samen hebben we hoop non-profit organisatie, het centrum voor de gezondheid van vrouwen en onderzoek, en de NHLBI R01HL136636 (FD).

Alle experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical campus en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. oplossingen
<ol><li>Gebruik MOPS-gebufferde zoutoplossing voor de dissectie en om monsters bij 4 °C te houden vóór het gebruik ervan. Gas de oplossing niet. Bereid MOPS gebufferde zoutoplossing met volgende samenstelling: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2po4, 1 mm mgso4, 2,5 mm CACL2,5mm glucose, 3 mm Mops, 0,02 mm EDTA, 2 mm Pyruvate, 10 mg/ml boviene serumalbumine, pH 7,3 bij 4 °c.</li>
	<li>Gebruik kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) als de badoplossing en pipet oplossing. Gas zowel aCSF en CA2 +-gratis acsf met 5% Co2, 20% O2, en N2 balans. Bereid de oplossing voor met de volgende samenstelling: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mm Nah2po4, 1 mM MgCl2, 4 mm glucose, 2 mm CACL2, pH 7,3 (met beluchting met 5% Co2, 20% O2en N2 balans).</li>
	<li>Verkrijg de maximale verwijding in nominaal CA2 +-vrije acsf (0 mm [CA2 +]o, 5 mm EGTA).</li>
</ol>2. bereiding van de orgaan kamer
<ol><li>Steek de capillairen van borosilicaatglas (buitendiameter = 1,2 mm; binnendiameter = 0,69 mm; lengte = 10 cm) in een glazen trekker. Trek het capillair aan om een lange, dunne punt aan de ene kant te maken.</li>
	<li>Aan één kant van de kamer, voeg een canule die kan aansluiten op een miniatuur peristaltische pomp om luminally druk het vat. Breek de punt van de canule onder een dissectie Microscoop, zodat het klein genoeg is om het vat van belang te passen, maar groot genoeg om oplossingen door de tip te laten stromen. Zorg ervoor dat de punt ongeveer 10-15 μm in diameter is.</li>
	<li>Vul de canule met behulp van een injectiespuit met een bijgevoegde 0,22 μm filter met zuurstof zuur aCSF. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen of vuil in de canule aanwezig zijn.</li>
	<li>Voeg nog twee canules toe aan de andere kant van de kamer. Breek hun tips niet.</li>
</ol>3. Hippocampus dissectie en isolatie
<ol><li>Euthanize en onthapitate een muis. Gebruik voor dit experiment een 8 weken oude C57BL6/J-muis om verschillen tussen mannetjes en vrouwtjes te vergelijken. Injecteer de muis met pentobarbital en onthoofden met chirurgische schaar.</li>
	<li>Met behulp van kleine dissectie schaar, snijd de huid langs de middenlijn aan de bovenkant van het hoofd. Beweeg de huid naar de zijkanten.</li>
	<li>Begin aan de caudale kant van de schedel en snijd de schedel langs de middenlijn tot de olfactorische bollen zijn bereikt. Verwijder delen van de schedel totdat de hersenen zichtbaar zijn.</li>
	<li>Verwijder langzaam de hersenen, beginnend bij de neus van de muis. Scheid de hersenen van de olfactorische bollen, craniale zenuwen en het ruggenmerg door de structuren te snijden met de kleine dissectie schaar.</li>
	<li>Plaats de hersenen in een dissectie plaat met voldoende MOPS-oplossing om het volledig te laten onderdompelen. Met behulp van een dissectie Microscoop, plaats de hersenen in het midden van de dissectie plaat met de ventrale zijde naar beneden gericht.</li>
	<li>Met behulp van een scheermesje, snijd je de hersenen in tweeën langs de longitudinale spleet. Houd het mesje zo dat de scherpe rand evenwijdig is aan de onderkant van de dissectie plaat. Druk het mes in één slag door de hersenen. Beweeg een halve bol naar de zijkant van de plaat.</li>
	<li>Voer de volgende stappen voor elke halve bol afzonderlijk of parallel uit.<ol>
<li>Plaats een halve bol in het midden van de plaat zodat de middenlijn naar beneden is gericht. Gebruik vervolgens het scheermesje om langs de dwars spleet te snijden om de cerebellum en de hersenstam te verwijderen. Duw het blad recht door het weefsel.</li>
		<li>Draai de hemisfeer zodanig dat de mediale zijde naar boven is gericht (Figuur 1A). Gebruik één spatel om de hersenen op zijn plaats te houden. Met behulp van een tweede spatel, steek de punt onder het corpus callosum en schep eronder om de thalamus, septum en hypothalamus te verwijderen, bedekt de Hippocampus (Figuur 1B).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de hippocampus is nu zichtbaar als een gebogen structuur in de buurt van de achterste kant van de cerebrum. Met behulp van één spatel te houden van de hersenen op zijn plaats, gebruik maken van de tweede spatel te Scoop de Hippocampus uit de hersenen (Figuur 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng de hippocampi over naar een nieuwe dissectie plaat gevuld ongeveer halverwege met MOPS-oplossing. Gooi de rest van de hersenen weg.</li>
</ol>4. hippocampal Arteriole isolatie
<ol><li>Voltooi de volgende stappen voor elke Hippocampus.<ol>
<li>Speld een van de hippocampi met behulp van kleine pinnen aan elk uiteinde van de sectie. De hippocampal slagader is naar boven gericht.</li>
		<li>Met behulp van zeer scherpe Tang, voorzichtig rekken kleine delen van de hippocampus. Dit zal het weefsel rond de arteriolen losmaken, waardoor het gemakkelijker is om ze te ontleden.</li>
		<li>Zoek door het rugweefsel van hippocampal om de uitwendige dwarse slagader te identificeren (Figuur 1C)16,27.</li>
		<li>Pak voorzichtig de uitwendige dwarse slagader en trek hem langzaam weg van het weefsel om de arteriolen en haarvaten te verzamelen die de CA3-regio van de Hippocampus perfectiongebruiken.</li>
		<li>Zodra er geen vaten meer uit het weefsel verwijderd worden, gooi de hippocampi weg. Houd de vaten op het ijs in de platen terwijl ze niet in gebruik zijn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole cannulatie
<ol><li>Vind een Arteriole met een tak die eindigt met haarvaten. Breng het over naar de orgaan kamer. Zorg ervoor dat de Arteriole is ongeveer 15-30 μm wanneer volledig verwijd (Figuur 1D).</li>
	<li>Monteer het bloedvat voorzichtig door de canule Tip door de Arteriole Wall onder het doelgebied te duwen. Schuif het vat voorzichtig op de canule totdat er voldoende weefsel is om de stropdas op te plaatsen.</li>
	<li>Maak een losse knoop met 12-0 nylon hechtingen zodat deze over het bloedvat en de canule past. Gebruik een half-Hitch knoop om banden te beveiligen. Trek vervolgens aan de uiteinden om de knoop aan te spannen en de Arteriole aan de canule te beveiligen. Verwijder alle externe takken van het vaartuig onder de stropdas door ze zachtjes met een tang te trekken.</li>
	<li>Maak een andere stropdas en Beveilig het aan de andere kant van de Arteriole om het te verzegelen.</li>
	<li>Verlaag de canule met het bijgevoegde vat totdat deze plat is tegen de afdekplaat aan de onderkant van de kamer. Wees voorzichtig om de canule niet te veel te verlagen of het zal breken.</li>
	<li>Met behulp van een canule aan de andere kant van de kamer, verlaag het zo dat het punt van het pinnen van de stropdas op het einde van de Arteriole.</li>
	<li>Gebruik de derde canule om de capillaire tak aan de dekslip te vastmaken. Plaats het uiteinde dicht bij het uiteinde van de tak en laat de uiteinden van de haarvaten bloot (niet onder de canule).</li>
</ol>6. myografie van de druk
<ol><li>Verplaats de kamer van het dissectie bereik naar de microscoop met de opname software.</li>
	<li>Sluit de toevoer-en uitstroom slang aan op de kamer voor perfusie. Start de perfusie met verwarmde aCSF (37 °C) met een debiet van 4 mL/min.</li>
	<li>Bevestig de druk canule aan een peristaltische pomp in combinatie met een druk transducer en breng de inwendige druk op 20 mm Hg.</li>
	<li>Start de opname software. Pas de Microscoop-en beeldvormings instellingen aan om het duidelijkste beeld te bereiken. Start de opname zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd voor de detectie software.</li>
	<li>Verhoog de druk van het vat tot 40 mm Hg tijdens het opnemen van de arteriële diameter met een randdetectie software.</li>
	<li>Laat ~ 15-20 min om MOPS-oplossing uit de kamer te spoelen met aCSF, en om de HiCaPA-bereiding te laten equilibreren en myogene Toon te ontwikkelen.</li>
	<li>Om de levensvatbaarheid van een vat te testen, breng 1 μM NS309 oplossing aan op de badperfusie (Zie Figuur 2a, B en de sectie representatieve resultaten). Het arteriollaire segment moet verwijden, waarbij ongeveer 30-40% myogene Toon wordt aangetoond zoals eerder beschreven3,14,20.</li>
</ol>7. focale stimulatie van capillaire uiteinden
<ol><li>Zodra de basislijn Toon voor de Arteriole is vastgesteld en de endotheliale functie is beoordeeld, test de respons van capillaire stimulatie.</li>
	<li>Met behulp van een glazen trekker, maken canules zodat er een fijne punt aan de ene kant. Breek de tip van een canule zodat het geteste medicijn door de tip soepel kan stromen bij 5 psi.</li>
	<li>Vul de canule met de drug-oplossing van belang en voeg deze toe aan een 3-assige micro manipulator bevestigd aan de Microscoop. Sluit de slang van het drukejectiesysteem aan op de canule.</li>
	<li>Verlaag de canule langzaam in het bad in de buurt van de haarvaten, en zorg ervoor dat u geen enkel deel van het vat of de hardware in de kamer raakt. Manoeuvreren de punt van de canule naast de uiteinden van de haarvaten zonder ze aan te raken. Houd de punt van de canule net buiten de dekslip om te voorkomen dat het vat wordt gestimuleerd als de canule lekt.</li>
	<li>Wanneer klaar om de haarvaten te stimuleren, verlaagt u de canule naar de dekslip en net naast de haarvaten. Activeer het drukejectiesysteem met de gewenste ejectietijd (hier 20 s). Zodra de stimulatie is voltooid, verhoogt u de canule iets om verdere stimulatie te voorkomen.</li>
	<li>Herhaal de stimulatie indien nodig. Verander het drukejectiesysteem canule om verschillende geneesmiddel verbindingen te testen.</li>
	<li>Om te bevestigen dat alleen de capillairen worden gestimuleerd, vult u de canule met 1 μM NS309 oplossing en herhaalt u de bovenstaande stappen. Opmerking: capillaire endotheliale cellen niet uitdrukken K+ kanalen geactiveerd door NS309, zodat de Arteriole mag niet reageren op de stimulatie. Als de Arteriole verwijde, dan zal de canule moeten worden verplaatst of de diameter van het gat moet kleiner zijn (Zie Figuur 2A, B en de representatieve resultaten sectie).</li>
</ol>

<ol><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+Myogenic+Tone%2C+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles%3A+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging%3A+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li>
<li>Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoide%2C+M+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22">Microcirculation (New York, N.Y.:1994)</a>. 25 (1), (2018).</li>
<li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+endfoot+Ca2%2B+and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2%2C+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent%2C+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li>
<li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K%2B+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li>
<li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia%3A+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li>
<li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).</li>
<li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age%3A+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li>
<li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351(2018).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li>
<li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li>
<li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li>
<li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li>
<li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+the+K%28ir%292+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe%3A+the+discovery%2C+SAR%2C+and+pharmacological+characterization+of+ML133%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De onder druk staande hicapa (hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole) voorbereiding beschreven in het huidige manuscript is een Verleng teken van onze gevestigde procedure om parenchymale arteriolen29te isoleren, onder druk te zetten en te bestuderen. We onlangs gemeld dat Kir 2.1 kanalen in hersen capillaire endotheliale cellen Sense toeneemt in [K+]o geassocieerd met neurale activering, en het genereren van een stijgende hyperpolariserende signaal dat stroomopwaarts ...

De Piale circulatie op het oppervlak van de hersenen is het voorwerp geweest van veel studie, deels vanwege de experimentele toegankelijkheid. Echter, de topologie van de cerebrale vasculatuur creëert verschillende regio's. In tegenstelling tot het robuuste pial-netwerk dat rijk is aan anastomosen met aanzienlijke capaciteit voor het omleiden van de bloedstroom, presenteren de intracerebrale parenchymale arteriolen (PAs) beperkte onderpand toevoer, elk met een discrete hoeveelheid zenuwweefsel1,2. Dit creëert een knelpunt effect op de bloedstroom die, in combinatie met unieke fysiologische kenmerken3,4,5,6,7,8, maakt intracerebrale arteriolen een cruciale plaats voor de cerebrale doorbloeding (CBF) voorschrift9,10. Ondanks de technische uitdagingen die inherent zijn aan de isolatie en de cannulatie van PAs, heeft de laatste tien jaar een toegenomen belangstelling voor ex-vivo -functionele studies met onder druk staande schepen11,12,13,14,15,16,17. Een van de redenen voor deze toegenomen belangstelling is de aanzienlijke onderzoeksinspanningen uitgevoerd op neurovasculaire koppeling (NVC), het mechanisme ondersteunen van de hersenen functionele hyperemie18.
Regionaal, CBF kan snel toenemen na lokale neurale activering19. De cellulaire mechanismen en signalering eigenschappen die NVC beheersen zijn niet volledig begrepen. Echter, we identificeerden een eerder onverwachte rol voor de hersen capillairen tijdens NVC in sensing neurale activiteit en vertalen in een hyperpolariserende elektrische signaal te verwijden stroomopwaarts arteriolen20,21,22. Actie potentialen23,24 en opening van grote-conductance CA2 +-geactiveerde K+ (BK) kanalen op de astrocytische endfeet25,26 Verhoog de concentratie van de interstitiële kalium ionen [K+]o, wat resulteert in de activering van sterke inkomende gelijkrichter K+ (KIR) kanalen in het vasculaire endotheel van de capillairen. Dit kanaal wordt geactiveerd door externe K+ , maar ook door hyperpolarisatie zelf. De hyperpolariserende stroom verspreidt zich door tussenruimte kruisingen en regenereert vervolgens in aangrenzende capillaire endotheliale cellen tot aan de Arteriole, waar het myocyten ontspanning en CBF verhoogt20,21. De studie van dit mechanisme leidde ons tot het ontwikkelen van een onder druk staande capillaire-parenchymale Arteriole (CaPA) voorbereiding voor het meten van de arteriollaire diameter tijdens capillaire stimulatie met vasoactieve agentia. De capa preparaat is samengesteld uit een gecanuleerde intracerebrale Arteriole segment met een intact, downstream capillaire vertachting. De capillaire uiteinden worden gecomprimeerd tegen de kamer glazen bodem door een micro Pipet, die de gehele vasculaire vorming20,21occludeert en stabiliseert.
Eerder maakten we instrumentale innovaties door Imaging Capa-preparaten uit de muis cortex20,21 en arteriolen van de rat amygdala13 en Hippocampus16,17. Aangezien de hippocampal therapieën meer aandacht krijgt vanwege de gevoeligheid voor pathologische omstandigheden, bieden we hier een stapsgewijze methode voor Capa-bereiding van de muis Hippocampus (hicapa) die niet alleen kan worden gebruikt in functionele NVC-studies, maar ook in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie.

```html
<table><tbody><tr><td>0,22&micro;m Spuitfilters</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Zwart</td><td>Microsurgery Instruments, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Automatische temperatuurregelaar</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas O.D.: 1,2 mm, I.D.: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie Scope</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pomp met Drive en MS/CA 4-12 pomp-kop</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar - scherp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Inline Waterverwarming</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Miltex&trade; weefseltang</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Intracellulaire Micro-injectie Dispenser Systemen, 2-kanaals</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Druk Servo Controller met Peristaltische Pomp</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Super Fijne Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - Scherp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Verticale Micropipet Puller</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>
```

ex vivo onder druk hippocampal capillaire-parenchymale arteriole voorbereiding voor functionele studie

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Van subtiele gedragsveranderingen tot laattijdige dementie ontwikkelt vasculaire cognitieve stoornissen zich meestal na cerebrale ischemie. Beroerte en hartstilstand zijn opmerkelijk seksueel dimorfe ziekten, en beide induceren cerebrale ischemie. Echter, vooruitgang in het begrijpen van de vasculaire cognitieve stoornissen, en vervolgens het ontwikkelen van seks-specifieke behandelingen, is deels beperkt door uitdagingen bij het onderzoeken van de hersenen microcirculatie van Muismodellen in functionele studies. Hier presenteren we een benadering om de capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken in een ex vivo hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole (hicapa) voorbereiding van muizenhersenen. We beschrijven hoe de microcirculatie te isoleren, te cannuleren en onder druk te zetten om de arteriolaire diameter te meten als reactie op capillaire stimulatie. We laten zien welke geschikte functionele controles kunnen worden gebruikt om de integriteit van de voorbereiding van de HiCaPA te valideren en typische resultaten weer te geven, waaronder het testen van kalium als een neurovasculaire koppelings agent en het effect van de recentelijk gekarakteriseerde remmer van de Kir2 actieve gelijkrichter kaliumkanaal familie, ML133. Verder vergelijken we de reacties in preparaten die zijn verkregen van mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel deze gegevens functioneel onderzoek weerspiegelen, kan onze aanpak ook worden gebruikt in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie studies.

Endotheliale Small-conductance (SK) en intermediaire-conductance (IK) CA2 +-gevoelige K+ kanalen oefenen een dilatorische invloed uit op de diameter van de PAs. Bad toepassing van 1 μM NS309, een synthetische IK en SK kanaal agonist, veroorzaakt in de buurt van maximale verwijding (Figuur 2a, B). Echter, capillaire endotheliale cellen missen IK en SK kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op NS3092...

Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Onze methode maakt het mogelijk om bloedvaten te bestuderen in structuren die anders moeilijk in vivo te beeld krijgen, zoals de hippocampus. Omdat de bloedvaten uit het hersenweefsel worden verwijderd, kan de signalering tussen de haarvaten en de arteriole worden bestudeerd zonder off-target effecten op het omliggende weefsel. Om de hippocampus te isoleren, gebruik je een kleine dissectieschaar om de huid langs de middellijn aan de bovenkant van het hoofd van de muis te snijden en de huid naar de zijkanten te verplaatsen.Vanaf de staartzijde van de schedel snijdt u de schedel langs de middellijn totdat de reukbollen zijn bereikt en verwijder delen van de schedel totdat de cerebrum wordt blootgesteld. Beginnend in de buurt van de neus van de muis, langzaam verwijderen van de hersenen, met behulp van de schaar te snijden door de olfactorische bollen, craniale zenuwen, en ruggenmerg. Dompel de hersenen onder, ventrale kant naar beneden in MOPS Gebufferd Saline, in het midden van een dissectie plaat, en plaats de plaat onder een dissectie microscoop.Houd de scherpe rand parallel aan de bodem van de schotel, gebruik scheermesje om de hersenen in de helft langs de longitudinale fissuur in een slag te snijden. Plaats een halfrond in het midden van de plaat met de middellijn naar beneden en duw het scheermesje dwars door het weefsel langs de dwarse spleet om het cerebellum en de hersenstam te verwijderen. Draai het halfrond, zodat de mediale kant naar boven gericht en gebruik een spatel om de hersenen op zijn plaats te houden.Steek het puntje van een tweede spatel onder het corpus callosum, scheppen onder het weefsel om de thalamus, septum, en hypothalamus te verwijderen uit de hippocampus. De hippocampus moet nu zichtbaar zijn als een gebogen structuur in de buurt van de achterste kant van de cerebrum. Met behulp van een spatel om de cerebrum op zijn plaats te houden, gebruik de tweede spatel om de hippocampus uit de cerebrum te scheppen.Breng de hippocampi vervolgens over naar een nieuwe dissectieplaat, ongeveer halverwege gevuld met een verse MOP-oplossing. Voor hippocampal arteriole isolatie, plaats kleine pinnen aan elk uiteinde van een hippocampus om het monster hippocampal slagader kant omhoog te beveiligen. Met behulp van zeer scherpe tangen, voorzichtig strekken kleine delen van de hippocampi om het weefsel rond de arterioles los te maken.En zoek door de rug hippocampal weefsels om de externe dwarse slagaders te identificeren. Wanneer de slagader is gelokaliseerd, pak de externe dwarsslagader van de hippocampus en trek het langzaam weg van het weefsel om de slagaders en haarvaten te verzamelen. De slagader van elke hippocampus wordt apart verwijderd.Wanneer er geen vaten meer verwijderd moeten worden, plaatst u de monsters op ijs en gooi u het resterende hippocampale weefsel weg. Voor cannulation van de arterioles, lokaliseren en arteriole met een tak die eindigt met haarvaten en plaats de arteriole in een orgelkamer. Duw de canulepunt voorzichtig door de arteriole wand onder het doelgebied om het bloedvat te monteren.Schuif het vat vervolgens voorzichtig op de canule totdat er voldoende weefsel is waarop de das kan worden gevonden. Gebruik 12-0 nylon hechtingen om een losse knoop te maken die over het bloedvat en canule past, en gebruik een halve kink in de kabel om de banden te beveiligen, trek de uiteinden om de knoop aan te scherpen om de arteriole aan de canule te beveiligen. Zet een andere das aan de andere kant van de arteriole om het te verzegelen.Aan de andere kant van de kamer, lager een tweede canule tot het punt van de canule pinnen vaststelling van de das aan het einde van de arteriole. Gebruik vervolgens een derde canule om de haarvaten aan de coverslip te vastpinnen, waarbij de punt dicht bij het einde van de tak wordt plaatsgelegd, terwijl de uiteinden van de haarvaten worden blootgesteld. Als de hersenen microcirculatie is prachtig kwetsbaar, zorg ervoor dat het uitrekken en hanteren van de vaten te minimaliseren tijdens de cannulation procedure om de overleving van de arterioles te garanderen.Voor druk myografie analyse, breng de kamer naar een lichtmicroscoop stadium met opnamesoftware en sluit de in- en uitstroom buizen aan de kamer voor overvloed. Start de overvloed met 37 graden Celsius Kunstmatige cerebrospinale vloeistof op een vier milliliter per minuut stroomsnelheid, en bevestig de druk canule aan peristaltische pomp in combinatie met een druktransducer. Breng de interne druk op 20 millimeter Mercurius en start de opnamesoftware.Pas de microscoop en de beeldinstellingen aan om een zo duidelijk mogelijk beeld te bereiken. En gebruik de Edge Detection-software om te controleren of de arteriole ongeveer 15 tot 30 micrometer in diameter is wanneer deze volledig verwijd is. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, begint u met de opname en verhoogt u de intravasculaire druk in het vat tot 40 millimeter Mercurius, terwijl u de arteriooldiameter registreert met de Edge Detection-software.Maak vervolgens 15 tot 20 minuten gebruik van de kamer om de MOP-oplossing uit te wassen. Om de levensvatbaarheid van het vat te testen, breng een micromolar NS309-oplossing aan op de badoverdaad, moet het arteriolarsegment verwijden, wat een myogene tint van 30 tot 40% aantoont. Zodra de basistoon voor de arteriole is vastgesteld, gebruik een glazen trekker om canules te maken met een fijn punt aan de ene kant, en gebruik tangen om de punt van elke canule te breken, zodat de drug van belang soepel kan stromen door de tip op vijf pond druk per vierkante inch.Vul de canule met het medicijn van belang. En laad de canule op een drieassige micromanipulator aan de microscoop. Sluit de slang van het drukuitwerpsysteem aan op de canule en laat de canule langzaam in het bad in de buurt van de haarvaten zakken, waarbij u ervoor zorgt dat het schip of de kamer niet wordt geraakt.Om de haarvaten te stimuleren, laat u de canule naar de coverslip net naast de haarvaten zakken en activeer het drukuitwerpsysteem met de gewenste uitwerptijd. Verhoog aan het einde van de stimulatie de canule iets om verdere stimulatie te voorkomen. Om te bevestigen dat alleen de haarvaten werden gestimuleerd, vul de nieuwe canule met één micromolar NS309-oplossing en stimuleer de haarvaten zoals aangetoond.Verkrijg vervolgens de maximale vaatverwijding door het preparaat te baden met de calciumvrije oplossing. De toepassing van het bad van één micromolar NS309 veroorzaakt een dichtbijgelegen maximale dilatatie van arteriole toe te schrijven aan Calcium-gevoelige Kaliumkanalen in het endothhelium. Capillaire endotheelcellen echter, gebrek aan tussenliggende en kleine geleiding kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op de agonist, als gevolg daarvan, het stimuleren van haardolelijke uiteinden met NS309, veroorzaakt geen upstream arteriolar dilatatie, dit geeft aan dat NS309 niet de arteriole bereikt, en kan worden gebruikt als een controle om toegang te krijgen tot de ruimtelijke beperking van de verbinding op toegepaste op toegepaste haarvaten door middel van druk ejection.Met behulp van de hippocampal capillaire parenchymale arteriole voorbereiding zoals aangetoond, de toepassing van een kunstmatige hersenvocht aangevuld met 10 millimolar Kalium op de capillaire uiteinden, resulteert in een upstream arteriolar dilatatie die niet verschilt tussen preparaten van mannelijke en vrouwelijke muizen. Verder, de toevoeging van de Kir2 remmer ML 133, vrijwel schaft de capillaire geïnduceerde arteriolar dilatatie, in reactie op 10 millimolar Kalium in preparaten van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Bij het monteren van de bloedsssel, beperken directe interacties met het bloedvat om de schade aan te minimaliseren, en verhoging van de levensvatbaarheid van het vat.Zodra het bloedvat is geïsoleerd, verschillende geneesmiddelenverbindingen kunnen worden getest of het bloedvat kan verder worden verwerkt voor oleculaire biologie, immunochemie, of elektrofysiologie studies.

ex-vivo-pressurized-hippocampal-capillary-parenchymal-arteriole

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Een protocol voor entorhino-hippocampus organotypische slice culturen, die het mogelijk maakt het reproduceren vele aspecten van ischemisch hersenletsel, wordt gepresenteerd. Door het bestuderen van veranderingen in de neurovasculatuur naast veranderingen in de neuronen, dit protocol is een veelzijdig gereedschap plastic veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging.

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van intracerebrale arteriolen (een groep bloedvaten die omvat parenchymale arteriolen, penetrerende arteriolen en precapillaire arteriolen) van muizen, te gebruiken in drukmyografafie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Terwijl multifotonenbeeldvorming alleen effectief is op beperkte diepten van het weefseloppervlak, is het mogelijk om via pCLE op elke diepte beeldvorming met een resolutie van 3 μm te bereiken. Hier presenteren we een protocol om pCLE-beeldvorming uit te voeren om de microvasculaire dynamiek in de hippocampus van ictale en wildtype muizen te meten.

In vivo vezelgekoppelde preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE) van hippocampuscapillairen bij wakkere muizen

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Het protocol hier biedt een gedetailleerde real-time dynamische bemonstering van extracellulaire vloeistof uit de hippocampus van wakkere ratten met behulp van een microdialysesysteem.

Real-time dynamische verzameling van hippocampale extracellulaire vloeistof van bewuste ratten met behulp van een microdialysesysteem

Leer een ex vivo methode voor het isoleren van hippocampale arteriolen en capillairen uit muizenhersenen voor drukmyografie. Deze techniek maakt gedetailleerde studies van vasculaire signalering mogelijk zonder storende effecten van omliggend weefsel.

Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie

Meer video's verkennen