Name: Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor eilandjestransplantatie in de lies onderhuidse witte vetweefsel van muizen. Dit model helpt onderzoekers bij het bestuderen van Type I diabetes en het verbeteren van klinische transplantatie-uitkomsten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van national key R&D Program of China (2017YFC103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medische Discipline Bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisch Scientific Research Foundation van de Chinese provincie Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle procedures in dit protocol volgden de principes van dierenwelzijn van de Ethics Review Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Islet graft ontvangers en donoren waren 8- tot 10-week oude C57BL / 6 mannelijke muizen gekocht van het Medisch Dier Centrum van de provincie Guangdong. De procedure van het oogsten, isoleren, cultuur of toediening van de geoogste cellen werd uitgevoerd in aseptische omstandigheden.
1. Voorbereiding van het aantal van de hoogte
<ol><li>Bereid een collageentype V-werkoplossing voor. Weeg collageentype V af en los op met de buffer van D-Hank tot een eindconcentratie van 1 mg/mL, filter met behulp van een 0,22 μm spuitgestuurde filterunit en een 60 mL-spuit en precool in ijs. Voor elke donorontvanger is een volume van 5 mL vereist.</li>
	<li>Euthanaser een 10 weken oude C57BL/6 mannelijke muis (23 ± 2 g) door cervicale dislocatie en spuit het externe deel van de muis met 75% ethanol gedurende een paar seconden. Vul ondertussen een 5 mL-spuit met collageenachtige oplossing en verander de spuitnaald met een buigende stomppuntige perfusienaald (32 G).</li>
	<li>Zet de donormuis in de supine positie op een ijszak onder de ontleden de scope, snijd een dwarse opening met behulp van rechte puntige oogheelkundige schaar in de huid van de schaamstreek, en volledig snijden de huid naar het hoofd. Open vervolgens de buik volledig via een V-incisie van het schaamgebied naar het xiphoid-proces.</li>
	<li>Stel de galblaas en de gehele lengte van de gemeenschappelijke galkanaal door het herpositioneren van de lever. Klem vervolgens de duodenale opening van de gemeenschappelijke galbuis met een vasculaire klem en snijd een kleine opening in de galblaas. OPMERKING: Optimale naaldplaatsing is belangrijk om terugstroom in de lever en galblaas te voorkomen.</li>
	<li>Cannulate de gemeenschappelijke galkanaal van de galblaas opening met behulp van de perfusie naald in stap 1.2, dan injecteren ~ 2 mL van collageen oplossing in de alvleesklier. Daarna, scheiden de geperfundeerde alvleesklier van de darmen, maag, en milt met behulp van twee paar niet-invasieve microtweezers, en zet het in een 50 mL conische buis op ijs. LET OP: Herhaal het proces voor alle donormuizen. Drie achtereenvolgens geperfundeerde alvleesklieren (niet meer dan 40 min uit elkaar) kunnen worden gecombineerd tot een 50 mL conische buis voorgevuld met 3 mL collageenoplossing voor elke alvleesklier.</li>
	<li>Voeg 100 μL DNase I (10 mg/mL) per alvleesklier toe aan de conische buizen van 50 mL en verteer de alvleesklieren in een waterbad bij 37 °C door de conische buizen 3-5 min te schudden. OPMERKING: Schud de buizen krachtig 40x in 10 s intervallen om het weefsel te distantiëren voorafgaand aan de spijsvertering in het waterbad, en schud vervolgens matig de buizen tijdens de spijsvertering.</li>
	<li>Voeg stopoplossing (2,5 mg/mL BSA-HBSS-oplossing) toe tot een eindvolume van 50 mL om de spijsvertering te blokkeren en centrifugeer de buizen tot een snelheid van 750 x g bij 4 °C en stop snel.</li>
	<li>Giet de supernatant af en was de pellets 2x door zachtjes op te schorten in 15-25 mL BSA-HBSS. Pulse centrifugeer de buis met dezelfde snelheidscondities als beschreven in stap 1.7 voor 1 min.</li>
	<li>Giet de supernatant af en bundel de pellets van de drie conische buizen in een kegelbuis van 50 mL. Resuspend de pellets in een totaal volume van 10 mL histopaque-1119. Meng homogeen, en geleidelijk voeg 5 mL histopaque-1077 en 5 mL HBSS door pipetteren langzaam langs de zijkant van de buis.</li>
	<li>Draai de monsters in de centrifuge op 750 x g bij 4 °C gedurende 10 min zonder remmen.</li>
	<li>De eilandjes uit de HBSS/histopaque-1077-interface aanzuigen in een conische buis van 50 mL met behulp van een bbeseurpipet van 5 mL, BSA-HBSS toevoegen aan een eindvolume van 50 mL en pulscentrifuge bij 750 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Giet de supernatant af en was de eilandjes met 30 mL BSA-HBSS. Centrifugeer gedurende 1 min bij 750 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspend de eilandjes met behulp van 30 mL kweekmedium (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) per buis en giet in een lichtdichte kweekschaal met een diameter van 10 cm. Onder een stereomicroscoop, met behulp van 200 μL gel-loading pipet tips, kies de eilandjes uit de oplossing op basis van hun morfologie (dat wil zeggen, sferoïdaal, wit). Zet in een onbehandelde celkweekschotel met 10 mL kweekmedium. LET OP: Een tweede handpicking kan worden uitgevoerd als de zuiverheid van de eerste gezuiverde eilandjes niet optimaal is na de eerste picking.</li>
	<li>Controleer de zuiverheid van de met de hand geplukte eilandjes door dithizone vlekken onder een lichtmicroscoop en detecteer de levensvatbaarheid van eilandjes door fluoresceindiacetaat (FDA)-propidiumjodide (PI) kleuring onder een fluorescerende microscoop.</li>
	<li>Kweek de geïsoleerde eilandjes in kweekmedium (zoals in stap 1.13) in een incubator bij 37 °C, 95% lucht-5% CO2 voor transplantatie.</li>
</ol>2. ISWAT-eilandjestransplantatie
<ol><li>Induceren van diabetes bij de 8 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen (22 ± 2 g) door een enkele injectie van streptozotocine (STZ). Op dag -4, snel de muizen voor ~ 4-6 uur, dan bereiden een 2% STZ oplossing met behulp van 0,1 M citrate buffer (pH 4.4). Weeg, bretel opnieuw in buffer en injecteer de muizen intraperitoneally bij een dosis van 180 mg/kg. OPMERKING: STZ-oplossing moet voor gebruik vers worden bereid en bedekt met aluminiumfolie vanwege de lichtgevoeligheid. Het moet onmiddellijk worden gebruikt, omdat het activiteit binnen 15-20 min zal verliezen.</li>
	<li>Doorboor de staartaderen van de Door STZ geïnjecteerde muizen om rond 10 uur van dag -1 en dag 0 wat bloed te verzamelen en meet de niet-vastende bloedglucosespiegel met behulp van een teststrip en een basisbloedglucosebewakingsinstrument. De muizen zullen worden gebruikt als ontvangers van eilandjetransplantatie als de bloedsuikerspiegel van de 2 opeenvolgende testdagen beide ten minste 20 mmol/l zijn.</li>
	<li>Weeg en markeer op dag 0 alle ontvangende muizen. Verdoven elke ontvanger door het injecteren van 60 mg/kg pentobarbital natrium intraperitoneally. OPMERKING: Toeeensknijpen om de diepte van anesthesie te controleren. Als de ontvanger muis heeft geen opnamereflex, het niveau van anesthesie is genoeg voor een operatie. Zo niet, toedienen een extra 10 mg/kg pentobarbital natrium. Het gebruikte pentobarbitalnatrium werd verdund in steriele fysiologische zoutlijn bij een concentratie van 2% (m/v).</li>
	<li>Haal de hydrogel uit een vriezer van -20 °C en houd deze op ijs om ontdooien mogelijk te maken. De hydrogel is vloeibaar bij 4-10 °C en zal stollen bij een hogere temperatuur.</li>
	<li>Kies ~450-500 eilandequivalenten (IEQ) voor elke ontvanger in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL onder de stereomicroscoop (zoals in stap 1.13) met 200 μL kweekmedium en blijf op ijs tot ze klaar zijn voor transplantatie.</li>
	<li>Wattenstaafje het linkeringuinale gebied van de ontvanger met behulp van 75% ethanol. Plaats het in de supine positie en bevestig de vier ledematen met behulp van chirurgische tape. Scheer het haar rond de chirurgische site met elektrische tondeuses en wattenstaafje het gebied met Iodophor.</li>
	<li>Maak een verticale huidincisie in dit gebied met behulp van de oogheelkundige schaar en niet-invasieve microtweezers, identificeer de inferieure epigastrische slagader en ader in de ISWAT en creëer een klein zakje boven de bloedvaten.</li>
	<li>Draai de eilandjesbuis voor 30 s op 200 x g en verwijder de supernatant zoveel mogelijk. Aanzuiging 20 μL volledig ontdooide hydrogel en laad het in de buis met de eilandjes. Zet de eilandjes voorzichtig op en vermijd bellen.</li>
	<li>Lever het volledige mengsel van het islet-hydrogel in de buis in de zak (stap 2.7) van de ontvanger met een pipettip van 200 μL. OPMERKING: Dit proces vereist twee technici, een voor het oppakken van de randen van de zak met behulp van niet-invasieve microtweezers, en de andere voor het leveren van het levenmeemengsel in de zak.</li>
	<li>Voeg 20 μL cefalosporine (~5-10 mg) toe aan de transplantatieplaats nadat het eilandje-hydrogelmengsel volledig is gestold en gebruik vervolgens een 5-0 chirurgische hechting om de spier en huid te sluiten met de continue hechtingsmethode. LET OP: De hydrogel heeft ongeveer 3 min nodig om te stollen vanwege de lichaamstemperatuur.</li>
	<li>Plaats de ontvanger in een schone kooi en warm te houden met behulp van een thermische pad. Houd de bewaking totdat de ontvanger volledig herstelt en autonoom begint te bewegen. Dan toedienen 0,03 mg/ml Buprenorfine met steriele fysiologische zoutzout intraperitoneally, volgens 0,1 mg/Kg dosis.</li>
	<li>Herhaal stap 2.3–2.11 voor elke muis van de ontvanger.</li>
	<li>Meet de niet-vastende bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen (zoals in stap 2.2) 3-4x per week voor de eerste maand, en 1x per week daarna.</li>
	<li>Aan het einde van de follow-up (100 dagen na transplantatie), onder anesthesie (uitgevoerd zoals in stap 2.3) accijns de ISWAT met het transplantaat van de ontvangers na de steriele stappen beschreven in stap 2.6. Fix het weefsel in formaline en paraformaldehyde volgens de histologische protocollen voor hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en immunofluorescentie van insuline en glucagon.</li>
	<li>Voeg cefalosporine toe en sluit de incisie van de ontvangers zoals in stap 2.10 en bereid je voor op herstel zoals in stap 2.11.</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+Diabetes+Atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+Type+1+Diabetes%3A+Current+Scenario+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+Insights%3A+Endocrinology+and+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521(2019).</li>
<li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202(2018).</li>
<li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li>
<li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li>
<li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li>
<li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+islet+transplantation%3A+is+the+future+finally+now%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li>
<li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation%3F+Review+article%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li>
<li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li>
<li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li>
<li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+alternative+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li>
<li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160(2019).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096(2011).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Alvleeskliereilandjetransplantatie is een veelbelovende therapie voor de behandeling van T1DM. Het effect van deze therapie wordt beïnvloed door vele factoren en het kiezen van een optimale plaats voor het implanteren van het aantal bezoekers is uiterst belangrijk. De ideale anatomische plaats voor eilandjetransplantatie moet de volgende kenmerken hebben: toegankelijkheid voor eenvoudige transplantatie,biopsie en procedures voor het ophalen van grafts; verminderde complicaties; hoge slagingspercentage van de bloedglucose...

De wereldwijde incidentie en prevalentie van type 1 diabetes mellitus (T1DM) nemen snel toe, volgens de statistische gegevens van de International Diabetes Federation (IDF)1. Eilandjestransplantatie is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van T1DM4. Aangezien de grote doorbraak in klinische eilandjetransplantatie met behulp van het Edmonton protocol2 werd gemeld, functioneert het overleven van eilandjes bij T1DM-ontvangers na 5 jaar nu ongeveer 50%3.
In het verleden werden verschillende transplantatielocaties onderzocht, zoals de lever, niercapsule, milt, intramusculaire regio, onderhuidse ruimte, beenmerg en een omental zakje voor experimentele eilandjetransplantatie5,6,7. Sommige van de bovenstaande sites zijn getest in klinische instellingen8. Hoewel eilandjetransplantatie in de lever de meest gebruikte methode blijft in klinische toepassing op dit moment9,zijn er verschillende belangrijke problemen aan te pakken bij het gebruik van deze site. Bijvoorbeeld, hoe vroeg verlies van de getransplanteerde eilandjes veroorzaakt door de instant bloed gemedieerde ontstekingsreactie (IBMIR) en slechte oxygenatietoevoer10,11 te verminderen en hoe de eilandjegrafts terug te halen indien nodig, omdat ze diffuus lokaliseren in de lever. De niercapsule kan een ideale plek zijn voor knaagdierontvangers. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende allogene eilandjes bij de mens, hoewel het beter geschikt kan zijn voor eilandje xenotransplantatie als gevolg van de sterk gezuiverde varkenseilandletpreparaten die klinisch worden gebruikt5,12. Daarom is de zoektocht naar een meer geschikte site voor eilandjetransplantatie in volle gang.
De onderhuidse ruimte kan worden gebruikt als een klinisch toepasbare locatie voor eilandjetransplantatie vanwege de toegankelijkheid ervan. De efficiëntie van eilandjetransplantatie in de onderhuidse ruimte is echter extreem laag, waardoor een relatief groot aantal eilandjes nodig is om hyperglykemie te keren13. Onlangs vond een Japans onderzoeksteam de ISWAT, een nieuwe onderhuidse site superieur voor eilandjetransplantatie in een murine model in vergelijking met de lever14. De ISWAT bevat de epigastrische slagader en ader, dus de rijke bloedtoevoer kan zorgen voor het revascularisatie van het levene ent. In dit manuscript stellen we een eenvoudige implantatiemethode voor met behulp van een keldermembraanmatrixhydrogel om synogenische urineeilandjes in de ISWAT te fixeren. Dit protocol blijkt effectief voor eilandjetransplantatie.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu;m Syringe-driven Filter Unit</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pasteur pipette</td><td>JingAn Biological, China</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>Szboon, China</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 surgical suture</td><td>sh-Jinhuan, China</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL syringe</td><td>Szboon, China</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td>LIRCON, China</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Verdunning (1:200)</td></tr><tr><td>anti-mouse Glucagon antibody</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>Verdunning (1:100)</td></tr><tr><td>anti-mouse insulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3014s</td><td>Verdunning (1:100)</td></tr><tr><td>blunt-pointed perfusion needle</td><td>Oloey, China</td><td>005</td><td>32G, geel</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune, China</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td><td></td><td>8~10 weken</td></tr><tr><td>cell culture dish</td><td>BIOFIL, China</td><td>TCD000100</td><td>Algemeen,Niet-behandeld,87.8 mm diameter</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>cephalosporine</td><td>Lukang medical, China</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>Codos Pet Clipper</td><td>Szcodos, China</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>collageenase Type V</td><td>Sigma</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-hank's buffer</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Eosin staining media</td><td>Beyotime Biotech, China</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>fluorescein diacetaat (FDA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>fluorescente microscoop</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>gel-loading pipet tips</td><td>Corning</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>hematoxyline staining media</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Basement Membrane Matrix</td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>LIRCON, China</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>light-tight culture dish</td><td>DVS, China</td><td>AN-5058548</td><td>zelf gemaakt, glazen schaal besprenkeld met zwarte verf</td></tr><tr><td>Medical Adhesive Tape</td><td>Cofoe, China</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>non-invasief microtweezers</td><td>RWD Life Science</td><td>F11033-11 en F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Basic bloedglucose monitoring systeem</td><td>Johnson &amp; Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmische schaar</td><td>RWD Life Science</td><td>S12012-12 en S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P/S (penicilline / streptomycine)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (streptozotocine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Test Strip</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-geconjugeerd geit anti-konijn IgG(H+L)</td><td>proteintech</td><td>SA00007-2</td><td>Verdunning (1:200)</td></tr><tr><td>vaasculaire klem</td><td>RWD Life Science</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

inguinal subcutane white adipose tissue (iswat) transplantatie model van murine eilandjes

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Alvleeskliereilandje transplantatie is een gevestigde therapeutische behandeling voor type 1 diabetes. De niercapsule is de meest gebruikte site voor eilandjetransplantatie in knaagdiermodellen. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende eilandjes bij grote dieren en mensen. Het inguinal onderhuidse witte vetweefsel (ISWAT), een nieuwe onderhuidse ruimte, bleek een potentieel waardevolle locatie voor eilandjetransplantatie. Deze site heeft een betere bloedtoevoer dan andere onderhuidse ruimtes. Bovendien, de ISWAT herbergt een grotere eilandje massa dan de niercapsule, en transplantatie in het is eenvoudig. Dit manuscript beschrijft de procedure van muiseilandjeisolatie en transplantatie op de ISWAT-site van synogene diabetische muisontvangers. Met behulp van dit protocol, murine pancreaseilandjes werden geïsoleerd door standaard collagenase spijsvertering en een kelder membraan matrix hydrogel werd gebruikt voor de vaststelling van de gezuiverde eilandjes in de ISWAT site. De bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen werden gedurende meer dan 100 dagen gecontroleerd. Eilandjegrafts werden op dag 100 na transplantatie teruggevonden voor histologische analyse. Het protocol voor eilandjestransplantatie op de ISWAT-site die in dit manuscript wordt beschreven, is eenvoudig en effectief.

In dit protocol worden twee procedures ingevoerd: murineeilandvoorbereiding en eilandjestransplantatie op de ISWAT-site. In de eerste procedure, na het doornemen en verteren met type V collagenase oplossing, zuiveren met Histopaque-1119 en Histopaque-1077 en een extra stap met het plukken van de hand, zullen de geïsoleerde murineeilandjes voldoende zuiver zijn voor transplantatie (zoals weergegeven in figuur 1) en de geïsoleerde eilandjes die een hoge levensvatbaarheid hebben, zullen worden ...

In dit protocol wordt een methode van murineeilandisolatie en transplantatie in het inguinal onderhuids wit vetweefsel beschreven. Geïsoleerde synogenische murine eilandjes worden getransplanteerd in een murine ontvanger met behulp van een kelder membraan hydrogel. De bloedsuikerspiegel van de ontvangers wordt gecontroleerd en de histologieanalyse van de levensperie-transplantaties wordt uitgevoerd.

Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Eilandje transplantatie is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van type I diabetes mellitus. En de zoektocht naar een geschikte locatie voor eilandjestransplantatie is aan de gang. Eilandjetransplantatie in het inguinale onderhuidse witte vetweefsel is een eenvoudige maar effectieve methode die klinische implicaties kan hebben.Extrapolatie van deze procedure naar de kliniek kan leiden tot de ontwikkeling van een remedie voor type I diabetici. Deze methode kan inzicht geven in klinische eilandjestransplantatie, omdat de linguale is vastgesteld dat het geen ideale locatie is voor eilandjes. Het is belangrijk om zorgvuldig te volgen elke stap van de procedure, met name belangrijke stappen, zoals de alvleesklier spijsvertering.Visuele demonstratie zal onderzoekers helpen die nieuw zijn in de techniek om beter te bepalen hoe ze de eilandjesisolatie en de transmutatie moeten uitvoeren. Voor eilandje oogst, eerst spuiten de vacht van een 10 weken oude C57 zwarte zes muis met 75%ethanol, en vul een vijf milliliter spuit met vers bereide collagenase oplossing. Rust de spuit uit met een 32-gauge buigende stompe puntige perfusienaald en plaats de muis in de supinepositie op een ijszak.Gebruik rechte puntige oogheelkundige schaar om een dwarse opening in de huid van de schaamstreek te maken en de incisie uit te breiden naar het hoofd van het dier. Open de buik volledig via een V-incisie van het schaamstreek naar het xiphoidproces en verplaats de lever om de galblaas en de volledige lengte van het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen. Gebruik vervolgens een vasculaire klem om de duodenale opening van de gemeenschappelijke galbuis te sluiten en een kleine opening in de galblaas te snijden.Kannuleert de gemeenschappelijke galkanaal door de opening met de eerder voorbereide perfusienaald, en injecteer ongeveer twee milliliter collagenase oplossing in de alvleesklier. Wanneer alle collagenase is geleverd, gebruik maken van twee paar niet-invasieve micro pincet om de geperfundeerde alvleesklier te scheiden van de darmen, maag en milt, en plaats de alvleesklier in een 50 milliliter conische buis op ijs. Wanneer alle monsters zijn verzameld, voeg 100 microliter Dnase I per alvleesklier aan de 50 milliliter buizen en krachtig schudden elke buis ongeveer 40 keer over een periode van 10 seconden voor het plaatsen van de weefsels in een 37 graden Celsius waterbad gedurende drie tot vijf minuten met matige schudden.Aan het einde van de incubatie, optellen tot een laatste volume van 50 milliliter van Stop Solution om de spijsvertering te arresteren. En puls centrifuge de buizen tot een snelheid van 750 keer G bij vier graden Celsius voordat snel stoppen met de centrifuge. Na het weggooien van de supernatants, was de pellets twee keer in 15 tot 25 milliliter Stop Solution per wasbeurt onder dezelfde centrifugatieomstandigheden als net aangetoond.Na de tweede wasbeurt, zwembad drie pellets per buis in nieuwe 50 milliliter conische buizen. En resuspend de alvleeskliercellen in een totaal volume van tien milliliter van Histopaque 1119. Voeg vervolgens voorzichtig vijf milliliter Histopaque 1077 aan de zijkant van elke buis toe, gevolgd door vijf milliliter HBSS.Scheid de cellen door centrifugatie en gebruik een vijf milliliter Pasteur pipet om de eilandjes te verzamelen van de HBSS Histopaque 1077 interface. Pool de eilandjes in een nieuwe conische buis van 50 milliliter in een uiteindelijk volume van 50 milliliter Stop Solution voor pulscentrifugatie en gooi de supernatant weg. Resuspend de pellet in 30 milliliter verse Stop Solution voor een minuut centrifugatie, en resuspend de eilandjes in 30 milliliter van cultuur medium.Decanteer de eilandjes in één 10 centimeter lichtdichte kweekschotel per buis. En leg het gerecht onder de stereomicroscoop. Met behulp van 200 microliter gel-loading pipet tips, met de hand pick de witte sferoïdale eilandjes uit de oplossing.Het plaatsen van de eilandjes in een onbehandelde celkweek schotel met 10 milliliter van cultuurmedium als ze worden geoogst. Controleer de zuiverheid van de met de hand geplukte eilandjes door dithizone vlekken onder een lichtmicroscoop. En detecteer de levensvatbaarheid van de eilandjes door fluoresceïne diacetaat propidium jodide kleuring onder een fluescent microscoop.Dan cultuur de geïsoleerde eilandjes in verse cultuur medium op 37 graden Celsius in 95% lucht en 5% kooldioxide tot transplantatie. Vanaf dag drie en vier na diabetes inductie, punctie de caudale ader van elke streptozotocine geïnjecteerd acht weken oude mannelijke C57 zwarte zes muis rond 10:00 a.m. om een bloedmonster te verzamelen van elk ontvangend dier.Gebruik een basis bloedglucose monitoring instrument om de niet-nuchtere bloedsuikerspiegel van elke muis te bepalen en voeg vervolgens het bloed op individuele teststrips. Wanneer een dier twee dagen achter elkaar een bloedglucosegehalte van ten minste 20 millimol per liter heeft aangetoond, weegt en markeert u de ontvangende muis en bevestigt u een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij de verdoofde dieren. Plaats een aliquot van hydrogel van min 20 graden Celsius opslag op ijs voor ontdooien.En breng 450 tot 500 eilandjequivalenten per ontvanger over in een steriele 1,5 milliliter centrifugebuis met 200 microliter medium per buis op ijs. Swab het linker inguinale gebied van de ontvanger met 75%ethanol en plaats de muis in de supine positie. Fix de ledematen met chirurgische tape, en gebruik tondeuse om het haar te verwijderen rond de chirurgische site.Neem het chirurgische gebied met iodophor en maak een verticale incisie in de gedesinfecteerde huid. Identificeer de inferieure epigastrische slagader en ader in de ISWAT en maak een kleine zak boven de vaten. Sediment de eilandjes door centrifugatie en verwijder zoveel mogelijk supernatant mogelijk.Voeg 20 microliter ontdooide hydrogel toe aan elke buis en zet de eilandjes voorzichtig opnieuw op, waarbij ze zorgen voor bellen. Wanneer een homogene suspensie is verkregen, gebruik dan een 200 microliter pipetpunt om het hele eilandje hydrogelmengsel voorzichtig van één buis in de zak te leveren. Wanneer de hydrogel volledig gestold is, voeg dan 20 microliter cefalosporine toe aan de transplantatieplaats en sluit de spier en huid met een 5-0 continue chirurgische hechting.Plaats vervolgens de ontvanger in een schone kooi op een thermische pad met monitoring tot volledige recumbency. Na murine eilandje verwerking zoals aangetoond, de geïsoleerde murine eilandjes zal voldoende zuiver zijn voor transplantatie. Alleen geïsoleerde eilandjes met een hoge levensvatbaarheid mogen worden gebruikt voor transplantatie.Na het grondig mengen van de eilandjestransplantaten met hydrogel, kan het transplantaat worden geïmplanteerd in de ISWAT-site. Na ongeveer een maand van transplantatie in de ISWAT, het eilandje grafts omgekeerde hyperglykemie, terwijl het lichaamsgewicht van de ontvanger muizen geleidelijk toeneemt. Na 100 dagen na transplantatie resulteert verwijdering van de grafts in een onmiddellijke toename van de 10:00 a.m.niet-nuchtere bloedsuikerspiegel. Histologische analyse op dit moment, blijkt dat het eilandje grafts intact zijn gebleven. En insuline en glucagon immunofluorescente kleuring geven aan dat de getransplanteerde eilandjes ook functioneel zijn na 100 dagen na transplantatie.Wees voorzichtig niet te schudden de verende alvleesklier cellen te robuust of anders het vermogen van de verkregen eilandjes zal worden aangetast. Geïsoleerde eilandjes kunnen worden getransplanteerd onder de niercapsule als een controle om de effecten van de geïsoleerde transplantatie te vergelijken in het inguinale onderhuidse witte vetweefsel ter plaatse. De procedure zal de initiatie van klinische proeven van eilandjetransplantatie toevoegen aan andere plaatsen naast de lever.

inguinal-subcutaneous-white-adipose-tissue-iswat-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een ​​potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.

Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

Deze met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode is geschikt voor de detectie van geënte eilandjes in de intraperitoneale holte. Met name vereist het niet het gebruik van biobindingsmiddelen of hechten.

Met vet bedekte eilandjestransplantatie met behulp van epididymaal wit vetweefsel

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

Dit protocol presenteert het gebruik van CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in adipocyten (AdipoSPH) als een alternatieve strategie voor adeno-geassocieerd virus (AAV) voor het onderzoeken van beige vetbiologie. In vivo injectie van AAV-dragend sgRNA gericht op het endogene Prdm16-gen is voldoende om de ontwikkeling van beige vet te induceren en het thermogene genprogramma te verbeteren.

Onderzoek naar beige vetbiologie en metabolisme met behulp van het CRISPR SunTag-p65-HSF1-activeringssysteem

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier presenteren we een transplantatieprotocol voor wit en bruin vetweefsel dat een veelbelovende strategie biedt om subfertiliteit, obesitas en hyperglykemie om te keren en tegelijkertijd de nierfunctie bij diabetische en zwaarlijvige BTBR-muizen te verbeteren.

Witte en bruine vettransplantaten: een benadering om reproductieve, metabole en niertekorten te corrigeren bij zwarte en bruine brachyury (BTBR) zwaarlijvige muizen

Een beschrijving van de chirurgische inductie van endometriose bij muizen en ratten door auto-transplantatie van baarmoeder weefsel om de arteriële cascade van de intestinale mesenterium.

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

Leer een eenvoudige methode voor eilandjestransplantatie in de lies onderhuidse witte vetweefsel van muizen. Dit model helpt onderzoekers bij het bestuderen van Type I diabetes en het verbeteren van klinische transplantatie-uitkomsten.

Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes

Meer video's verkennen