Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Dit protocol beschrijft een methode die is gericht op het extraheren in parallel de twee meest voorkomende gliacel populaties, astrocyten en microglia, uit postnatale muizen. Onze methode verschilt van andere eerder beschreven protocollen voor astrocyten en microglia isolatie, omdat we ons richten op het verkrijgen en isoleren van beide celtypen in dezelfde extractie in dezelfde voorwaarde, waardoor het gebruik van experimentele dieren wordt geoptimaliseerd en de studie van relatieve rollen voor deze cellen in immunologische contexten wordt verbeterd. Dit protocol kan nuttig zijn voor een beter onderzoek microglia en astrocyten rollen in vele contexten en ziekten in het centrale zenuwstelsel, zoals Alzheimer, Parkinson, en infecties door bijvoorbeeld protozoa parasieten of virussen.

Het verkrijgen en isoleren van beide celtypen uit dezelfde extractie is wenselijk om de vergelijkende rol van elke celsubset immunologische contexten zoals infectie of ontsteking te evalueren. Mensen moeten voorzichtig zijn vooral tijdens de verwijdering van de hersenen en zenuwweefsel wast, maar ik denk dat met dit protocol en de video geschoten, mensen zullen niet worstelen. Dit protocol kan lang zijn, afhankelijk van het aantal dieren om de cortices te extraheren, dus wees bereid om ongeveer vier uur of meer door te brengen.

Bereid op dag één pure HBSS en HBSS plus 10% warmte-geïnactiveerde FBS. Bereid de aangevulde DMEM F12 voor en filter deze met een filter van 0,22 micron. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclave en gebruik 70% ethanol tijdens de procedure.

Zet pasgeboren muizen in een verzegelde kamer met katoen gedrenkt met isoflurane gedurende vijf minuten voor diepe anesthesie. Spuit de muizenpup met 70% ethanol en onthoofd het dier met een schaar. Maak een sagittale snede met een schaar langs de schedel om het te openen en bloot de hersenen.

Verwijder de hersenen met behulp van een micro spatel om de integriteit van de hersenen te behouden. Plaats de hersenen in een droge zes centimeter diameter Petri schotel. Verwijder met behulp van een microspatel de reukbol en het cerebellum.

Verplaats de cortex naar een andere petrischaal met twee milliliter HBSS plus 10%FBS. Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes met steriele schaar en met behulp van een P1000 micropipet, breng elk hersenweefsel met HBSS plus 10% FBS naar verschillende 15 milliliter conische buizen. Gebruik indien nodig HBSS plus 10%FBS om het uiteindelijke volume op twee milliliter te vullen.

Was het gesneden hersenweefsel met drie milliliter HBSS plus 10%FBS voor elke buis. Verwijder na decantatie voorzichtig de supernatant. Herhaal de wasbeurt met HBSS plus 10%FBS drie keer.

Dan wassen met drie milliliter pure HBSS drie keer. Verwijder na decantatie voorzichtig de supernatant. Voeg vervolgens drie milliliter trypsine toe en plaats de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zachtjes schudden van de buizen om de vijf minuten.

Dit verteert het verzamelde weefsel. Vermijd bubbels. Om de trypsine te inactiveren, was het weefsel met drie milliliter HBSS plus 10%FBS en verwijder na decantatie van het weefsel het supernatant voorzichtig.

Herhaal deze was drie keer. Was vervolgens het weefsel met drie milliliter pure HBSS en herhaal twee extra keren. Na decantatie van het weefsel, verwijder voorzichtig de supernatant.

Voeg zeven milliliter pure HBSS toe en homogeniseer het weefsel door opeenvolgende passages in pipetten, eerst met een 10 milliliter serologische pipet, gevolgd door een pipet van vijf milliliter en ten slotte met een P1000 micropipet. Na homogenisatie, centrifugeren de buizen op 450 keer g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet met vier milliliter HBSS plus 10%FBS voor elke buis.

Breng de cellen over naar een commercieel voorbehandelde T75-kolf voor een optimale hechting van de celkweek. Plaats de kolf in een couveuse op 37 graden Celsius op 5%kooldioxide gedurende 30 minuten voor de hechting. Voeg vervolgens 10 milliliter aangevulde DMEM F12 toe aan de kolf en incubbaat bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee nachten.

Verwijder op dag drie zeven milliliter kweekmedium uit de T75-kolf en voeg zeven milliliter verse aangevulde DMEM F12 toe. Breng de kolf terug naar de couveuse. Op dag vijf, om puin en niet-loodhoudende cellen te verwijderen, wissel alle medium uit de T75-kolf met 14 milliliter verse aangevulde DMEM F12.

Verwijder vervolgens elke 48 uur zes milliliter van de supernatant en voeg zeven milliliter vers aangevuld DMEM F12 medium toe tot dag 14 van de cultuur. Op dag 14, na het verwijderen van zes milliliter supernatant en het toevoegen van zeven milliliter vers aangevuld DMEM F12 medium, sluit de T75 kolven strak met plastic verpakking. Plaats ze 's nachts in de vloer orbitale shaker bij 200 RPM en 37 graden Celsius om microglia mechanisch te scheiden van astrocyten.

Neem op dag 15 de kolven van de shaker en was ze krachtig met hun eigen medium om de celdissociatie te optimaliseren en het maximale aantal microglia te oogsten. Verzamel dan de supernatant en breng het over naar een 50 milliliter conische buis. Voeg vervolgens vier milliliter trypsine toe aan elke kolf en broed gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de astrocyten los te maken.

Voeg vervolgens vijf milliliter van de aanvullende DMEM F12 toe om de trypsine te inactiveren. Was de kolven met hun eigen medium en breng de inhoud over op een conische buis van 50 milliliter. Centrifuge alle buizen met gescheiden microglia of astrocyten op 450 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de supernatant weg. Resuspend de microglia pellet in een milliliter van de aangevulde DMEM F12 en de astrocyten in 10 milliliter van de aangevulde DMEM F12. Ga naar celtelling in een Neubauer kamer of een automatische celteller.

Plaat de cellen met aangevuld DMEM F12 op de gewenste dichtheid in een voorbehandelde platte bodemcel kweekplaat. Broed de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur om ze te laten hechten. Op de 14e dag onderging de gliacelcultuur mechanische dissociatie.

Het werd waargenomen met een zuiverheid van 89,5% voor de astrocytenpopulatie en 96,6% voor de microglia-populatie. Astrocyten en microglia van C57BL6 muizen waren besmet met T.cruzi Y.After two hours, 48 hours, and 96 hours, chambers were fixed with methanol and betained with cell nuclease marker DAPI and anti-GFAP. Het gebruik van genetisch gemodificeerde parasieten die fluorescerende verslaggevers of parasieten uitdrukken met specifieke fluorescerende antilichamen verbeterde de immunofluorescentiemicroscopie omdat ze zich beter onderscheiden van de celkern.

Hier worden twee voorbeelden gepresenteerd. T.gondii RH-stam die constitutief YFP en T.cruzi Y-stam uitdrukt met niet-commercieel monoklonal antilichaam 2C2 anti-SSP4-eiwit. Het is belangrijk om de cellen zorgvuldig te wassen om geen celaggregaten te verliezen.

Na gliacellen infectie, andere parameters kunnen worden geëvalueerd, zoals ELISA voor cytokine productie aanwezig in de supernatant, westerse blotting voor eiwitexpressie, en real-time kwantitatieve PCR voor RNA transcriptie evaluatie. Veel vragen met betrekking tot de functie van gliacellen, bijvoorbeeld hun metabolisme, immuunrespons en celbiologie zelf kunnen worden aangepakt en geprofiteerd door deze techniek. Alle protozoa parasieten zijn in staat om menselijke cellen en cultuurmuiscellen te infecteren, dus het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het hanteren van deze parasiet.