Name: Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer de gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en microglia uit muizenhersenen voor protozoa-infectiestudies. Deze methode optimaliseert diergebruik en vergelijkt gliale celreacties op Trypanosoma cruzi en Toxoplasma gondii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen professor Dr. Renato A. Mortara van de Federale Universiteit van São Paulo (UNIFESP) bedanken voor mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, subsidie 2017/25942-0 aan K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, subsidie 402100/2016-6 aan K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. ontvangt beurs van CNPq, A.L.O.P. ontvangt beurs van CAPES, en I.S.F en L.Z.M.F.B. ontvangt beurs van FAPESP.

Alle experimentele procedures waarbij muizen betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Braziliaanse nationale wet (11.794/2008) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) van de Federale Universiteit van São Paulo (UNIFESP).
1. Glial Cells Extractie, Onderhoud en Dissociatie
OPMERKING: Het aantal muizen dat wordt gebruikt voor de extractie van gliacellen is afhankelijk van de hoeveelheid cellen die nodig zijn om de gewenste experimenten uit te voeren. In dit protocol werden in totaal 2,7 x 107 astrocyten en 4 x 106 microglia verkregen uit zes neonatale C57BL/6 muizen. Alle procedures werden uitgevoerd onder steriele toestand in een klasse II biosafety kabinet.
<ol><li>Dag 1
	<ol>
<li>Bereid de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en HBSS van pure Hank + 10% van warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (zie Materiaaltafel).</li>
		<li>Bereid aangevuld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicilline + 0,09 mM Streptomycine + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbicarbonaat, pH 7.2) en filtreer het met een 0,22 μm filter (zie Materiaaltafel). OPMERKING: Alle kweekmedia moeten bij 4 °C worden opgeslagen, maar het is noodzakelijk om ze gedurende 20 minuten bij 37 °C voor te verwarmen voordat met het experiment wordt begonnen.</li>
		<li>Steriliseer alle chirurgische instrumenten (schaar, spatel en pincet) in een autoclave en gebruik 70% ethanol tijdens de procedure.</li>
		<li>Leg pasgeborenen (tot 3 dagen oud) muizen in een verzegelde kamer met katoen gedrenkt met isofluraan gedurende 5 minuten voor diepe anesthesie.</li>
		<li>Spray de muispup met 70% ethanol en onthoofd het dier met een schaar.</li>
		<li>Maak sagittale snede (achterste naar voorste) met een schaar langs de schedel om het te openen en bloot de hersenen. Scheid de schedel van de hersenen met behulp van een pincet. Verwijder de hersenen met behulp van een micro spatel om de integriteit van de hersenen te behouden.</li>
		<li>Plaats de hersenen in een droge petrischaal (6 cm diameter). Verwijder de olfactorische bol en cerebellum met behulp van een microspatel. Verplaats de cortex naar een andere petrischaal (6 cm diameter) met HBSS + 10% FBS (2 mL/petrischaal).</li>
		<li>Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes met steriele schaar en met behulp van een p1000 micropipet overdracht van elk hersenweefsel met HBSS + 10% FBS naar verschillende 15 mL conische buizen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 2 mL/buis is. Zo niet, compleet met HBSS + 10% FBS. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. In dat dan moeten conische buizen met CNS-weefsel tot 1 uur op ijs worden geplaatst.</li>
		<li>Was het gesneden hersenweefsel met 3 mL HBSS + 10% FBS (per buis) en na decantatie. Verwijder voorzichtig de supernatant. Herhaal deze stap 3 keer. OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het puin te verwijderen en het geëxtraheerde weefsel te herstellen.</li>
		<li>Was het gesneden hersenweefsel met 3 mL pure HBSS (per buis) en verwijder na decantatie voorzichtig het supernatant. Herhaal deze stap 3 keer. OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het resterende serum uit de vorige wasbeurten te verwijderen, omdat cellen in de volgende stap worden geprobeerd.</li>
		<li>Voeg 3 mL trypsine per buis toe en plaats in een waterbad op 37 °C gedurende 30 min, zachtjes schudden van de buizen om de 5 min. Vermijd bubbels door het omkeren of abrupt mengen van de buizen. OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het verzamelde weefsel te verteren.</li>
		<li>Om de trypsine te inactiveren, was het weefsel met 3 mL per buis HBSS + 10% FBS en verwijder na decantatie van het weefsel het supernatant voorzichtig. Herhaal deze stap 3 keer.</li>
		<li>Was het weefsel met 3 mL per tube pure HBSS en verwijder de supernatant voorzichtig. Herhaal deze stap 2 keer.</li>
		<li>Voeg 7 mL per buis pure HBSS toe en homogeniseer het weefsel via opeenvolgende passages in pipetten: eerst met de 10 mL serologische pipet, gevolgd door de 5 mL en tenslotte met de p1000 micropipet.</li>
		<li>Centrifugeerbuizen na homogenisatie op 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en stouw de pellet opnieuw met 4 mL HBSS + 10% FBS per buis.</li>
		<li>Cellen overbrengen naar een voorbehandelde T-75-kolf voor optimale hechting van de celkweek (zie Tabel van materialen). OPMERKING: Verwerk weefsel van elk dier per kolf.</li>
		<li>Plaats de kolf in de couveuse op 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min voor hechting.</li>
		<li>Voeg 10 mL aangevulde DMEM/F12 per kolf toe en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. LET OP: Het uiteindelijke volume is 14 mL per kolf.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3
	<ol>
<li>Verwijder 7 mL kweekmedium uit de T-75 kolf en voeg 7 mL vers aangevulde DMEM/F12 toe. LET OP: De kolven bevatten veel cellulair puin en een troebel uiterlijk.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 5
	<ol>
<li>Haal al het medium uit de T-75 kolf en voeg 14 mL verse aangevulde DMEM/F12 toe. OPMERKING: Medium wordt uit de kolven vervangen om vuil en niet-aanhangende cellen te verwijderen.</li>
		<li>Verwijder na elke 48 uur 6 mL van de supernatant en voeg 7 mL vers aangevuld DMEM/F12 medium toe tot dag 14 van cultuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 14
	<ol>
<li>Na het verwijderen van 6 mL van de supernatant en het toevoegen van 7 mL vers aangevuld DMEM/F12 medium, sluit de T-75 kolven stevig.</li>
		<li>Plaats ze in de vloer orbitale shaker bij 200 rpm en 37 °C 's nachts mechanisch scheiden microglia van astrocyten.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 15
	<ol><li>Neem de kolven van de shaker en was ze krachtig met hun eigen medium om de celdissociatie te optimaliseren en het maximale aantal microglia te oogsten. Verzamel vervolgens de supernatant (met microglia) en breng over op een conische buis van 50 mL.</li>
		<li>Voeg vervolgens 4 mL trypsine toe aan elke kolf en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C om de astrocyten los te maken.</li>
		<li>Voeg 5 mL per kolf van aangevulde DMEM/F12 toe om de trypsine te activeren. Was de kolven met hun eigen medium en breng de inhoud over op een conische buis van 50 mL.</li>
		<li>Centrifugeer alle buizen die gescheiden microglia en astrocyten bevatten bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg. Resuspend de microglia pellet in 1 mL en de astrocyten in 10 mL van aangevuld DMEM/F12.</li>
		<li>Ga naar celtelling in een Neubauer-kamer of een automatisch celteller. Plaat de cellen met aangevulde DMEM/F12 bij de gewenste dichtheid in een aangewezen vlakke bodemcelcultuurplaat (voorbehandeld voor optimale celgehechtheid; zie Lijst van Materialen). Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur om ze te kunnen hechten. OPMERKING: Reserveer 1,5 x 106 van elke celpopulatie om hun zuiverheid te bevestigen door stromingscytometrie.</li>
		<li>Voer een stroomcytometrische analyse uit om de zuiverheid van celpopulaties te verifiëren. OPMERKING: We beschouwen microglia CD11b+/CD45+/GFAP- en astrocyten CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 en TMEM119 kleuring kunnen worden overwogen om volledig te karakteriseren microglia22.</li>
		<li>Voeg een FMO (Fluorescentie Minus One)23 en een niet-bevlekt monster voor elke celpopulatie (astrocyten en microglia) als controles van flow cytometrie test.</li>
		<li>Reserveer voor elke celpopulatie 5 x 105 cellen voor elke bevlekte en niet-bevlekte monsters. Reserveer voor FMO twee andere buisjes microglia met elk 2,5 x 105 cellen en reserveer ook een andere buis van 5 x 105 astrocyten. OPMERKING: Aangezien microglia-getallen een beperkende factor kunnen zijn, is het mogelijk om minder cellen te gebruiken voor onbevlekte en FMO-besturingselementen.</li>
		<li>Centrifugeer alle microbuisjes op 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en stozweef de pellet opnieuw met 500 μL/microtube FACS-buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% runderserumalbumine (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).</li>
		<li>Centrifugeer alle microtubes op 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en stoof de pellet opnieuw op met 100 μL/microtube anti-CD16/CD32 (kloon 93) (1:50) verdund in FACS buffer. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 500 μL/microtube FACS buffer toe aan alle microtubes en centrifugeer bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. Gooi de supernatant weg. Resuspend astrocyten en microglia kleurbuizen en ook astrocyte FMO buis met 50 μL/microtube van oppervlakte markers mix: anti-CD45 (PE, kloon 30-F11) en anti-CD11b (eFluor 450, kloon M1/70) (beide verdund op 1: 100 in FACS buffer).</li>
		<li>Voor niet-gekleurde cellen, opnieuw onderbreken met hetzelfde volume van FACS buffer. Voor microglia FMO, incubeer elke microglia buis met anti-CD45 of anti-CD11b. Incubeer alle monsters op 4 °C gedurende 20 min in het donker.</li>
		<li>Voeg 500 μL FACS buffer per microtube toe. Centrifugeer bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en stoof de pellet opnieuw op met 100 μL/microtube fixatiebuffer (zie Materiaaltafel)gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Voeg 500 μL/microtube permeabilisatiebuffer 1x toe (zie Materiaaltafel)en incubeer bij 4 °C gedurende 5 min in het donker.</li>
		<li>Centrifugeer alle microtubes op 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. Resuspend astrocyten en microglia kleurbuizen en ook microglia FMO buizen met 50 μL/microtube van intracellulaire antilichaam anti-GFAP (APC, kloon GA5) in een 1:100 verdunning in 1x permeabilisatie buffer. Voor niet-bevlekte cellen en astrocyte FMO, resuspend de cellen met hetzelfde volume van FACS buffer. Incubeer alle monsters bij 4 °C gedurende 30 min in het donker.</li>
		<li>Was alle buizen door 500 μL/microtube van 1x permeabilisatiebuffer toe te voegen. Centrifugeer alle microtubes op 450 x g,gedurende 5 min bij 4 °C. Hang elke microbuis opnieuw op in 200 μL FACS-buffer. Verwerf 1 x 105 gebeurtenissen/sample op de flow cytometer.</li>
		<li>Voor analyse moeten cellen eerst worden afgesloten op CD11b x CD45 en vervolgens GFAP histogram. OPMERKING: Unstained en FMO-besturingselementen zijn handig om poorten te bepalen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Infectie en evaluatie van infectiepercentages
<ol><li>Infectie van gliacellen met T. gondii
	<ol>
<li>Plaat 3 x 104 microglia of astrocyten met aangevulde DMEM/F12 bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur in een voorbehandelde 96-put platte plaat (zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Infecteer elke celpopulatie met tachyzonieten van T. gondii RH-stam die geel fluorescerend eiwit (YFP) uitdrukt bij een veelheid aan infectie (MOI) van 1:1 (parasiet:cel) verdund in 200 μL/put van aangevulde RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicilline + 0,18 mM Streptomycine + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbicarbonaat, pH 7,2) (zie Tabel van materialen). Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.</li>
		<li>Gooi vervolgens de supernatant weg en bevestig de cellen door 100 μL/well van 1% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen die in PBS wordt verdund bij 4 °C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Vervang PFA door 100 μL/well van PBS bij pH 7.2.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de supernatant en vlekcellen kernen door 50 μL/well van DAPI (5 mg/mL) verdund in PBS pH 7.2 (1:1.000) gedurende 1 min bij kamertemperatuur in het donker te pipetteren.</li>
		<li>Vervang DAPI-kleuringsoplossing door 100 μL/well van PBS (pH 7.2) en analyseer deze door fluorescentiemicroscopie.</li>
	</ol></li>
	<li>Infectie van gliacellen met T. cruzi
	<ol>
<li>Plaat 3 x 104 microglia of astrocyten met aangevulde DMEM/F12 bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur in een voorbehandelde 96-put platte plaat (zie Tabel van materialen). OPMERKING: Gebruik voor elk moment van infectie een andere plaat.</li>
		<li>Infecteer de gliacellen met trypomastigoten van T. cruzi Y-stam bij een MOI van 5:1 (parasieten:cel) verdund in 200 μL/bron van aangevulde RPMI en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur. OPMERKING: Deze stap is belangrijk voor de celinvasie door de parasiet.</li>
		<li>Verwijder alle supernatant en was de putten door het toevoegen van 200 μL / goed van aangevuld RPMI om alle extracellulaire parasieten te verwijderen. Verwijder supernatant en voeg 200 μL/put van verse aangevuld RPMI toe. OPMERKING: Deze stap is bedoeld om alle parasieten te verwijderen die de aanhangende cellen niet hebben binnengevallen.</li>
		<li>Incubeer geïnfecteerde cellen gedurende 2 uur, 48 uur en 96 uur om T. cruzi-replicatie in gliacellen11te evalueren.</li>
		<li>Verwijder na elk tijdspunt de supernatant en bevestig de cellen met 100 μL/well methanol gedurende 15 min bij kamertemperatuur en vervang methanol vervolgens door 100 μL/well van PBS (pH 7.2).</li>
		<li>Bereid de cellen na fixatie als volgt voor op de immunofluorescentietest.<ol>
<li>Om autofluorescentie te voorkomen, behandel de cellen met 100 μL/well van 50 mM NH4Cl verdund in PBS (pH 8.0) gedurende 15 min. Was de cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer).</li>
			<li>Vervolgens permeabilize de cellen door toevoeging van 100 μL/goed van 0,5% Triton verdund in PBS voor 15 min. Was cellen door het toevoegen van 100 μL/ goed van PBS en onmiddellijk verwijderen (herhaal deze stap 3 keer).</li>
			<li>Incubeer vervolgens de celcultuur met 100 μL/goed van de blokkerende oplossing (5% vetvrije melk + 2% BSA verdund in PBS [pH 7,2]) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer).</li>
			<li>Om amastigoten te bevlekken, wordt incubeer met 30 μL/bron van niet-commercieel monoklonale antilichaam (mAb) 2C2 anti-Ssp-4-eiwit (1:200) verdund in blokkeringsoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Was cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer). Incubeer de plaat met 30 μL/well van secundair anti-muisantilichaam (1:500) verdund in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: De niet-commerciële mAb 2C2 anti-Ssp-4 eiwit was een vriendelijk geschenk van Prof. Dr. Renato A. Mortara van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Parasitologie van de Federale Universiteit van São Paulo.</li>
			<li>Verwijder voorzichtig de supernatant en vlekkernen door 50 μL/well van DAPI (5 mg/mL) verdund in PBS pH 7.2 (1:1.000) toe te voegen gedurende 1 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
			<li>Vervang DAPI-kleuringsoplossing door 100 μL/put van PBS pH 7.2 en analyseer deze door fluorescentiemicroscopie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>Jäkel, S., Dimou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Cells+and+Their+Function+in+the+Adult+Brain%3A+A+Journey+through+the+History+of+Their+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40 (2), 133-139 (2002).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVirchow%2C+R+%22Verlag+von+August+Hirschfeld%2C+Berlin%22">Verlag von August Hirschfeld, Berlin</a>. , (1858).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Samartino, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+abortus+induces+the+secretion+of+proinflammatory+mediators+from+glial+cells+leading+to+astrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).</li>
<li>Jamilloux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+restricts+Legionella+pneumophila+replication+in+primary+microglial+cells+through+flagellin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection.</a> Glia. 61 (4), 539-549 (2013).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Pacheco, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impairment+in+the+NLRP3-induced+NO+secretion+renders+astrocytes+highly+permissive+to+T.+cruzi+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication.</a> Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lian, H., Roy, E., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Primary+Microglial+Culture+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Primary Microglial Culture Preparation.</a> Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).</li>
<li>Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+in+primary+rat+CNS+cells%3A+Differential+contribution+of+neurons%2C+astrocytes%2C+and+microglial+cells+for+the+intracerebral+development+and+stage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation.</a> Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Chagas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nova+tripanozomiaze+humana%3A+estudos+sobre+a+morfolojia+e+o+ciclo+evolutivo+do+Schizotrypanum+cruzi+n.+gen.%2C+n.+sp.%2C+ajente+etiolojico+de+nova+entidade+morbida+do+homem%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).</li>
<li>Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+manifestations+of+the+neglected+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases.</a> Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).</li>
<li>Jones, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+HIV-infected+persons%3A+risk+factors+and+trends.+The+Adult%2FAdolescent+Spectrum+of+Disease+Group%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group.</a> AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).</li>
<li>Luft, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+Encephalitis+in+Patients+with+the+Acquired+Immunodeficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).</li>
<li>Madalosso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagasic+meningoencephalitis%3A+Case+report+of+a+recently+included+AIDS-defining+illness+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+do+Instituto+de+Medicina+Tropical+de+Sao+Paulo%22%5BJournal%5D)">Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).</li>
<li>Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+patients+with+Chagas%E2%80%99+disease+and+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).</li>
<li>Yasukawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+report%3A+Trypanosoma+cruzi+meningoencephalitis+in+a+patient+with+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).</li>
<li>Silva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+astrocytes+with+TNF+enhances+their+susceptibility+to+Trypanosoma+cruzi+infection+and+creates+a+self-sustaining+inflammatory+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+retinal+glial+cells+transform+glucose+and+supply+the+neurons+with+metabolic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).</li>
<li>Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-site+energy+supply+at+synapses+through+monocarboxylate+transporters+maintains+excitatory+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).</li>
<li>Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+astrogliosis+in+the+mouse+hypothalamus+in+response+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).</li>
<li>Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+role+of+astrocytes+in+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The active role of astrocytes in synaptic transmission.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).</li>
<li>Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathophysiological+Role+of+Microglia+in+Dynamic+Surveillance%2C+Phagocytosis+and+Structural+Remodeling+of+the+Developing+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+refined+CD11b+magnetic+isolation+of+primary+microglia+with+enhanced+purity+and+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belang van het bestuderen van geïsoleerde gliacellen functies in verschillende biologische contexten is uitgebreid in de afgelopen twee decennia. Inzicht in het CNS buiten neuronen is nog steeds een groeiend gebied in de celbiologie, vooral onder infecties of ontstekingsaandoeningen8,9,24. Gliacellen zijn niet alleen cruciaal voor de fysieke ondersteuning van neuronen (zoals voorheen bekend), maar ook in vele andere fysiolog...

Het CNS bestaat voornamelijk uit neuronen en gliacellen1,2,3. Microglia en astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het CNS. Microglia, de resident macrofaag, is de immunocompetente en de fagocytische glia cel in de CNS3,4, terwijl astrocyten zijn verantwoordelijk voor het behoud van homeostase en oefenen ondersteunende functies5.
Ondanks de klassieke gliacellen die verantwoordelijk zijn voor de ondersteuning en bescherming van neuronen6,7, zijn in de recente literatuur opkomende functies van deze cellen beschreven, inclusief hun reacties op infecties8,9,10,11. Zo is er een push om methoden te ontwikkelen om deze gliacellen te isoleren om hun functies individueel te begrijpen.
Er zijn een aantal alternatieve modellen om gliacellen te bestuderen in plaats van primaire culturen, zoals vereeuwigde cellijnen en in vivo modellen. Vereeuwigde cellen hebben echter meer kans op genetische drifting en morfologische veranderingen, terwijl in vivo studies beperkte manipulatievoorwaarden opleggen. Omgekeerd zijn primaire culturen gemakkelijk te hanteren, lijken we beter op in vivo cellen en stellen ons ook in staat om experimentele factoren12,13te beheersen. Hier beschrijven we richtlijnen voor het extraheren, onderhouden en scheiden van murine-astrocyten en microglia primaire cellen in hetzelfde protocol. Verder geven we ook voorbeelden over hoe te werken met protozoa-infectie in deze culturen.
CNS-cellen geëxtraheerd uit neonatale muizen (tot 3 dagen oud) werden gekweekt voor 14 dagen op differentiële media die de preferentiële groei van astrocyten en microglia cellen mogelijk maakt. Sinds microglia rust boven de bijgevoegde astrocyten, werden de celpopulaties mechanisch gescheiden in een orbitale incubator. Vervolgens verzamelden we alle supernatant met microglia en voegdetrypsine toe om astrocyten los te maken. Geïsoleerde gliacellen werden fenotypisch geëvalueerd door stromingscytometrie en verguld volgens het gewenste experiment.
We hebben ook voorbeelden gegeven over hoe deze geïsoleerde microglia en astrocyten te infecteren met protozoa parasieten. T. gondii is een zeer neurotrope protozoan die verantwoordelijk is voor toxoplasmose14, terwijl T. cruzi verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas die kan leiden tot de ontwikkeling van neurologische aandoeningen in de CNS15,16. Verder is ook gemeld dat infectie met T. gondii17,18 of T. cruzi19,20,,21 de vermoedelijke doodsoorzaak waren bij immuungecompromitteerde patiënten. Daarom is de opheldering van immunologische rol van gliacellen van het CNS bij het beheersen van protozoa-infecties van groot belang.

<table><tbody><tr><td>70% Ethanol</td><td>Din&acirc;mica Qu&iacute;mica Contempor&acirc;nea</td><td>Cat: 2231</td><td>Sterilize</td></tr><tr><td>75 cm2 Flask</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>96 well cell culture plate</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Ammonium Chloride (NH4Cl)</td><td>Din&acirc;mica Qu&iacute;mica Contempor&acirc;nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>Verwijder autofluorescentie</td></tr><tr><td>Anti-GFAP antibody</td><td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>Bottle Top Filter 0.22 &mu;mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>Cultuurmedium filter</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS Buffer voorbereiding</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>Flow cytometry antibody</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>Flow cytometry antibody</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td>Centrifugatie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Centrifugatie</td></tr><tr><td>Class II biosafety cabinet</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Biosafety cabinet voor steriele procedures</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 3110</td><td>Onderhoud primaire cellen</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>Conical tubes 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>Celteller</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>Beelden vastleggen op microscoop</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>Celcultuur medium</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: E9884</td><td>FACS Buffer voorbereiding</td></tr><tr><td>F12 Nutrient Mixture</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>Celcultuur medium</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Onbeschikbaar</td><td>Flow cytometer</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>Celcultuur medium supplement</td></tr><tr><td>Flow Jo (software)</td><td>Flow Jo</td><td>Versie: Flow Jo_9.9.4</td><td>Data analyse</td></tr><tr><td>Fluorescence intenselight</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>Fluorescentie bron</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Flow cytometry antibody</td></tr><tr><td>Goat - anti-mouse IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood&amp;Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Celcultuur medium</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Celcultuur medium supplement</td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Celfixatie voor Flow Citometry</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Model: ECLIPSE TS100</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aacute;lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>Geïnhaleerd anestheticum</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Synth</td><td>Cat: 01A1085.01.BJ</td><td>Fixatie voor Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Micro spatula</td><td>ABC stainless</td><td>Onbeschikbaar</td><td>Chirurgisch materiaal</td></tr><tr><td>Microtube 1.5 mL</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>Niet commercieel</td><td>Niet commercieel</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>Multichannel Pipette (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Pipetten reagentia</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>Versie 4.0</td><td>Beelden verwerven en analyseren</td></tr><tr><td>Non-fat milk</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>Blocking oplossing voor immunofluorescence</td></tr><tr><td>Orbital Shaker Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 481 Cat: 11</td><td>Microglia losmaken van astrocyten</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P6148</td><td>Fixatie voor Immunofluorescence</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Niet commercieel</td><td>Niet commercieel</td><td>Neutraal buffer</td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P-7794</td><td>Celcultuur medium supplement</td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>Celpermeabilisatie voor Flow Citometry</td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>pH oplossing kalibreren</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>Celcultuur medium</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>ABC stainless</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>Chirurgisch materiaal</td></tr><tr><td>Serological pipette 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>Serological pipette 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>Kunststof materiaal</td></tr><tr><td>Single Channel Pipette (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>Pipetten reagentia</td></tr><tr><td>Single Channel Pipette (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>Pipetten reagentia</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>Celcultuur medium supplement</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>Celcultuur medium supplement</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>Permeabilisatie voor immunofluorescence</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>Digestief enzym</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>ABC stainless</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>Chirurgisch materiaal</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Novatecnica</td><td>Model: 09020095</td><td>Weefsel verteren bij 37 &deg;C met trypsin</td>

gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en microglia voor protozoa-parasietinfectie

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocyten en microglia zijn de meest voorkomende gliacellen. Zij zijn verantwoordelijk voor fysiologische ondersteuning en homeostase onderhoud in het centrale zenuwstelsel (CNS). De toenemende bewijzen van hun betrokkenheid bij de bestrijding van infectieziekten rechtvaardigen de opkomende interesse in de verbetering van methodologieën om primaire astrocyten en microglia te isoleren om hun reacties op infecties die het CNS beïnvloeden te evalueren. Gezien de impact van Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Toxoplasma gondii (T. gondii) infectie in het CNS, hier bieden we een methode om murine astrocyten en microglia-parasieten te extraheren, te onderhouden, te scheiden en te infecteren. Geëxtraheerde cellen uit pasgeboren cortices worden gedurende 14 dagen in vitro onderhouden met periodieke differentiële mediavervanging. Astrocyten en microglia worden verkregen uit hetzelfde extractieprotocol door mechanische dissociatie. Na fenotypering door stromingscytometrie zijn cellen besmet met protozoaparasieten. Het infectiepercentage wordt bepaald door fluorescentiemicroscopie op verschillende tijdspunten, waardoor de evaluatie van het differentieelvermogen van gliacellen om protozoan invasie en replicatie te controleren. Deze technieken vertegenwoordigen eenvoudige, goedkope en efficiënte methoden om de reacties van astrocyten en microglia op infecties te bestuderen, waardoor het veld wordt geopend voor verdere neuroimmunologie-analyse.

Op de14e dag onderging de glialcellscultuur (figuur 1A)mechanische dissociatie. Geïsoleerde celpopulaties werden geanalyseerd door stromingscytometrie volgens CD11b-, CD45- en GFAP-markers. We konden een zuiverheid van 89,5% waarnemen voor de astrocytenpopulatie en 96,6% voor de microgliapopulatie (Figuur 1B). Na isolatie, cellen werden verguld in een 96-goed platte plaat en na 24 uur waren ze klaar om te worden besme...

Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.

Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Dit protocol beschrijft een methode die is gericht op het extraheren in parallel de twee meest voorkomende gliacel populaties, astrocyten en microglia, uit postnatale muizen. Onze methode verschilt van andere eerder beschreven protocollen voor astrocyten en microglia isolatie, omdat we ons richten op het verkrijgen en isoleren van beide celtypen in dezelfde extractie in dezelfde voorwaarde, waardoor het gebruik van experimentele dieren wordt geoptimaliseerd en de studie van relatieve rollen voor deze cellen in immunologische contexten wordt verbeterd. Dit protocol kan nuttig zijn voor een beter onderzoek microglia en astrocyten rollen in vele contexten en ziekten in het centrale zenuwstelsel, zoals Alzheimer, Parkinson, en infecties door bijvoorbeeld protozoa parasieten of virussen.Het verkrijgen en isoleren van beide celtypen uit dezelfde extractie is wenselijk om de vergelijkende rol van elke celsubset immunologische contexten zoals infectie of ontsteking te evalueren. Mensen moeten voorzichtig zijn vooral tijdens de verwijdering van de hersenen en zenuwweefsel wast, maar ik denk dat met dit protocol en de video geschoten, mensen zullen niet worstelen. Dit protocol kan lang zijn, afhankelijk van het aantal dieren om de cortices te extraheren, dus wees bereid om ongeveer vier uur of meer door te brengen.Bereid op dag één pure HBSS en HBSS plus 10% warmte-geïnactiveerde FBS. Bereid de aangevulde DMEM F12 voor en filter deze met een filter van 0,22 micron. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclave en gebruik 70% ethanol tijdens de procedure.Zet pasgeboren muizen in een verzegelde kamer met katoen gedrenkt met isoflurane gedurende vijf minuten voor diepe anesthesie. Spuit de muizenpup met 70% ethanol en onthoofd het dier met een schaar. Maak een sagittale snede met een schaar langs de schedel om het te openen en bloot de hersenen.Verwijder de hersenen met behulp van een micro spatel om de integriteit van de hersenen te behouden. Plaats de hersenen in een droge zes centimeter diameter Petri schotel. Verwijder met behulp van een microspatel de reukbol en het cerebellum.Verplaats de cortex naar een andere petrischaal met twee milliliter HBSS plus 10%FBS. Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes met steriele schaar en met behulp van een P1000 micropipet, breng elk hersenweefsel met HBSS plus 10% FBS naar verschillende 15 milliliter conische buizen. Gebruik indien nodig HBSS plus 10%FBS om het uiteindelijke volume op twee milliliter te vullen.Was het gesneden hersenweefsel met drie milliliter HBSS plus 10%FBS voor elke buis. Verwijder na decantatie voorzichtig de supernatant. Herhaal de wasbeurt met HBSS plus 10%FBS drie keer.Dan wassen met drie milliliter pure HBSS drie keer. Verwijder na decantatie voorzichtig de supernatant. Voeg vervolgens drie milliliter trypsine toe en plaats de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zachtjes schudden van de buizen om de vijf minuten.Dit verteert het verzamelde weefsel. Vermijd bubbels. Om de trypsine te inactiveren, was het weefsel met drie milliliter HBSS plus 10%FBS en verwijder na decantatie van het weefsel het supernatant voorzichtig.Herhaal deze was drie keer. Was vervolgens het weefsel met drie milliliter pure HBSS en herhaal twee extra keren. Na decantatie van het weefsel, verwijder voorzichtig de supernatant.Voeg zeven milliliter pure HBSS toe en homogeniseer het weefsel door opeenvolgende passages in pipetten, eerst met een 10 milliliter serologische pipet, gevolgd door een pipet van vijf milliliter en ten slotte met een P1000 micropipet. Na homogenisatie, centrifugeren de buizen op 450 keer g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet met vier milliliter HBSS plus 10%FBS voor elke buis.Breng de cellen over naar een commercieel voorbehandelde T75-kolf voor een optimale hechting van de celkweek. Plaats de kolf in een couveuse op 37 graden Celsius op 5%kooldioxide gedurende 30 minuten voor de hechting. Voeg vervolgens 10 milliliter aangevulde DMEM F12 toe aan de kolf en incubbaat bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee nachten.Verwijder op dag drie zeven milliliter kweekmedium uit de T75-kolf en voeg zeven milliliter verse aangevulde DMEM F12 toe. Breng de kolf terug naar de couveuse. Op dag vijf, om puin en niet-loodhoudende cellen te verwijderen, wissel alle medium uit de T75-kolf met 14 milliliter verse aangevulde DMEM F12.Verwijder vervolgens elke 48 uur zes milliliter van de supernatant en voeg zeven milliliter vers aangevuld DMEM F12 medium toe tot dag 14 van de cultuur. Op dag 14, na het verwijderen van zes milliliter supernatant en het toevoegen van zeven milliliter vers aangevuld DMEM F12 medium, sluit de T75 kolven strak met plastic verpakking. Plaats ze 's nachts in de vloer orbitale shaker bij 200 RPM en 37 graden Celsius om microglia mechanisch te scheiden van astrocyten.Neem op dag 15 de kolven van de shaker en was ze krachtig met hun eigen medium om de celdissociatie te optimaliseren en het maximale aantal microglia te oogsten. Verzamel dan de supernatant en breng het over naar een 50 milliliter conische buis. Voeg vervolgens vier milliliter trypsine toe aan elke kolf en broed gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de astrocyten los te maken.Voeg vervolgens vijf milliliter van de aanvullende DMEM F12 toe om de trypsine te inactiveren. Was de kolven met hun eigen medium en breng de inhoud over op een conische buis van 50 milliliter. Centrifuge alle buizen met gescheiden microglia of astrocyten op 450 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg. Resuspend de microglia pellet in een milliliter van de aangevulde DMEM F12 en de astrocyten in 10 milliliter van de aangevulde DMEM F12. Ga naar celtelling in een Neubauer kamer of een automatische celteller.Plaat de cellen met aangevuld DMEM F12 op de gewenste dichtheid in een voorbehandelde platte bodemcel kweekplaat. Broed de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur om ze te laten hechten. Op de 14e dag onderging de gliacelcultuur mechanische dissociatie.Het werd waargenomen met een zuiverheid van 89,5% voor de astrocytenpopulatie en 96,6% voor de microglia-populatie. Astrocyten en microglia van C57BL6 muizen waren besmet met T.cruzi Y.After two hours, 48 hours, and 96 hours, chambers were fixed with methanol and betained with cell nuclease marker DAPI and anti-GFAP. Het gebruik van genetisch gemodificeerde parasieten die fluorescerende verslaggevers of parasieten uitdrukken met specifieke fluorescerende antilichamen verbeterde de immunofluorescentiemicroscopie omdat ze zich beter onderscheiden van de celkern.Hier worden twee voorbeelden gepresenteerd. T.gondii RH-stam die constitutief YFP en T.cruzi Y-stam uitdrukt met niet-commercieel monoklonal antilichaam 2C2 anti-SSP4-eiwit. Het is belangrijk om de cellen zorgvuldig te wassen om geen celaggregaten te verliezen.Na gliacellen infectie, andere parameters kunnen worden geëvalueerd, zoals ELISA voor cytokine productie aanwezig in de supernatant, westerse blotting voor eiwitexpressie, en real-time kwantitatieve PCR voor RNA transcriptie evaluatie. Veel vragen met betrekking tot de functie van gliacellen, bijvoorbeeld hun metabolisme, immuunrespons en celbiologie zelf kunnen worden aangepakt en geprofiteerd door deze techniek. Alle protozoa parasieten zijn in staat om menselijke cellen en cultuurmuiscellen te infecteren, dus het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het hanteren van deze parasiet.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen...

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC's) hebben krachtige immunomodulerende eigenschappen die nuttig zijn voor de behandeling van ziekten die verband houden met ontstekingen. We demonstreren hoe AdMSC's van muizen en primaire gemengde glia kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, AdMSC's kunnen worden gestimuleerd om ontstekingsremmende genen en groeifactoren te reguleren, migratie van AdMSC's kunnen worden beoordeeld en AdMSC's kunnen worden gekweekt met primaire gemengde...

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Leer de gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en microglia uit muizenhersenen voor protozoa-infectiestudies. Deze methode optimaliseert diergebruik en vergelijkt gliale celreacties op Trypanosoma cruzi en Toxoplasma gondii.

Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Meer video's verkennen