Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

Staphylococcus aureus is een gram-positieve bacterie die een breed scala van virulentie factoren die pathogenese bevorderen produceert. Deze omvatten bi-component leukotoxinen die de membraanintegriteit van polymororische leukocyten verstoren, ook wel PMNs of neutrofielen genoemd. Deze video illustreert de isolatie van PMN's van menselijk volbloed en twee verschillende tests voor het kwantificeren van S.aureus cytotoxiciteit tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen.

Deze tests kunnen allemaal worden bereikt met standaard laboratoriumapparatuur en zijn gemakkelijk aanpasbaar om andere aspecten van de interactie met gastheerpathogen te onderzoeken. Deze experimenten zullen gebruik maken van volbloed afkomstig van menselijke donoren en zal goedkeuring van de bevoegde institutionele commissie of beoordelingscommissie, evenals een verklaring dat geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers. De eerste stap van deze procedure is de isolatie van neutrofielen door het gebruik van centrifugatie en dichtheidgradiënten.

Breng eerst 50 milliliter van 3%dextran 0,9%natriumchloride, 35 milliliter natriumchloride, 20 milliliter natriumchloride, 20 milliliter natriumchloride van 1,8%, 12 milliliter van 1,077 gram per milliliter ficoll-oplossing en 20 milliliter water op kamertemperatuur. Breng 25 milliliter vers getrokken heparinized hele menselijke bloed in twee conische centrifuge buizen. Combineer 25 milliliter vers getrokken gehepariniseerd volbloed met 25 milliliter equivalent volume van kamertemperatuur, 3%dextran, 0,9% natriumchloride in een één-op-één verhouding.

Meng door zachtjes schommelen elke 50 milliliter conische buis en laat staan op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na incubatie bij kamertemperatuur verschijnen er twee afzonderlijke lagen. Breng de bovenste laag van elk dextran bloedmengsel over in nieuwe 50 milliliter conische buizen.

Centrifuge op 450 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen pauzes. Zorgvuldig aanzuigen zowel supernatants en weggooien zonder verstoring van de cel pellets. Voorzichtig resuspend elke cel pellet in twee milliliter van 0,9% natriumchloride.

Combineer de geresuspended pellets in een enkele, 50 milliliter conicale voeg de resterende 0,9% natriumchloride aan een uiteindelijk volume van 35 milliliter. Voorzichtig onderlay 10 milliliter van 1.077 gram per milliliter ficoll oplossing onder de cel suspensie met behulp van een handpipet. Na het draaien op 450 g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, met lage of geen pauzes, zachtjes aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet, zoals eerder getoond.

Lyse de rode bloedcellen door resuspending de cel pellet in 20 milliliter kamertemperatuur water. Meng zachtjes door te rocken gedurende 30 seconden. Voeg onmiddellijk 20 milliliter natriumchloride van 1,8% en centrifugemonster toe bij 450 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Zorgvuldig aanzuigen supernatant zoals eerder getoond. Voorzichtig resuspend de cel pellet in twee milliliter kamertemperatuur RPMI en plaats op ijs. Tel cellen met behulp van een hemacytometer.

Resuspend gezuiverde PMN's met een concentratie van één keer 10 tot de 7e cel per milliliter met ijskoude RPMI en houd op ijs. Combineer 100 microliter gezuiverde PMN's met 300 microliter DPBS, met één microliter propidium jodidevlek in twee replicerende stroomcytometriebuizen. Voor een positieve controle, voeg 40 microliters van 0,5%Triton X-100 oplossing in een van de stroom cytometrie buizen en meng grondig.

Gebruik stroomcytometrie om de voorwaartse spreiding, zijverstrooiing en propidium jodide-kleuring te meten om de zuiverheid en integriteit van geïsoleerde PMN's te bepalen. Alleen PMN-preparaten die meer dan 98% zuiver en meer dan 95% propidiumjodide negatief zijn, mogen worden gebruikt. Voor het protocol waarin de isolatie van normale menselijke serum, verwijzen naar het volledige manuscript.

Bereid een 96-put plaat voor PMN cytotoxiciteit testen door het toevoegen van 100 microliter van 20% geïsoleerd menselijk serum verdund met DPBS aan individuele putten die zullen worden gebruikt in deze test. Zorg ervoor dat ten minste een negatieve controle goed die alleen media ontvangen en ten minste een positieve controle goed die 0,05% Triton X.Incubate de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zal ontvangen. Na de incubatie, was de gecodeerde putten twee keer met 100 microliters van ijskoude DPBS en plaats plaat op ijs.

Verwijder alle resterende DPBS uit de plaat putten en voorzichtig toe te voegen 100 microliter van gezuiverde menselijke PMN's op een keer 10 tot de 7e cellen per milliliter om elke gecodeerde goed. Laat vergulde neutrofielen zich vestigen door ze ten minste vijf minuten op ijs te laten liggen voordat ze in de volgende cytotoxiciteitstesten worden gebruikt. Deze sectie beschrijft een test die de cytotoxiciteit kwantificeert van extracellulaire eiwitten geproduceerd door staph aureus tegen menselijke PMNs.

Cultuur S.aureus 's nachts in de juiste media met behulp van een schudden incubator ingesteld op 37 graden Celsius de dag voorafgaand aan het experiment. Subcultuur S.aureus door het uitvoeren van een een tot 100 verdunning van 's nachts bacteriën culturen met verse media. Incubeer bij 37 graden Celsius met schudden tot bacteriën vroege stationaire groeifase bereiken.

Breng na vijf uur groei een milliliter subcultuur S.aureus over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifuge bij 5.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, aspirate supernatants. Pass opgezogen supernatants door een 0,22 micron spuitfilter in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis en plaats op ijs.

Uitvoeren van seriële verdunningen van supernatants met ijskoude media gebruikt om de cultuur Staph aureus. Voeg voorzichtig supernatant monsters of media uitgeleend voor negatieve en positieve controles aan individuele putten van een 96-put plaat met PMN's op ijs, zoals eerder beschreven. Voorzichtig rock plaat te verdelen supernatants in putten en incubeer bij 37 graden Celsius.

Verwijder op de gewenste tijdstippen de plaat uit de couveuse en plaats op ijs. Voeg 300 microliters ijskoude DPBS toe met één microliter propidiumjodide aan elke stroomcytometriebuis. Breng de monsters over om cytometriebuizen op ijs te laten stromen.

Voor de positieve controle goed, voeg 20 microliter van 10%Triton X aan het monster voorafgaand aan de overdracht naar een stroom cytometrie buis. Analyseer propidium jodide kleuring van dronken PMN's met behulp van stroomcytometrie. Deze sectie beschrijft een test die de cytotoxiciteit van S.aureus na fagocytose door menselijke PMNs kwantificeert.

Groeicurven gedefinieerd door de optische dichtheid op 600 nanometer en de concentratie van bacteriën moeten worden bepaald voor de relevante Staph aureus stammen voorafgaand aan het gebruik in deze test. Start 's nachts culturen van S.aureus stammen en subcultuur bacteriën, zoals eerder beschreven. Zodra subcultuur Staph aureus heeft bereikt mid-exponentiële groei, breng een milliliter van de cultuur bacteriën tot 1,5 milliliter microcentrifuge buis en centrifuge op 5,000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Was S.aureus door zijn supernatant te aspireren zonder de pellet te verstoren en de pelleted bacteriën opnieuw op te stellen bij één milliliter DPBS. Vortex de monsters voor 30 seconden. Centrifugeren de monsters op 5,000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om Staph aureus te oxideren, wordt de bacteriële pellet eerst opnieuw opgetrokken in één milliliter van 20% menselijk serum. Dan incubeer monsters op 37 graden Celsius met agitatie gedurende 15 minuten. Was geoxideerde Staph aureus na centrifugatie zoals eerder getoond.

Verdun geoxideerde Staph aureus stammen tot één keer 10 tot de 8e kolonievormende eenheden, CFUs per milliliter, met ijskoude RPMI. Vortex het monster voor 30 seconden en plaats op ijs. Bevestig de concentraties van Staph aureus gebruikt voor deze tests door plating een tot 10 seriële verdunningen van bacteriën op agar.

Voeg voorzichtig 100 microliter per put van elke Staph aureus-stam, of RPMI voor positieve en negatieve controles, toe aan PMN's in een 96-putplaat op ijs vanaf stap 1.14. Voorzichtig rock plaat te verdelen Staph aureus in putten. Synchroniseer fagocytose door middel van centrifuging plaat op 500 g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius en incubeer plaat op 37 graden Celsius onmiddellijk na centrifugatie als tijd nul.

Op de gewenste tijdstippen, zet de plaat op ijs en voeg 200 microliter ijs DPBS met een microliter propidium jodide aan elke stroom cytometrie buis dan de overdracht monsters naar hun overeenkomstige buis. Analyseer monsters voor propidium jodide kleuring met behulp van stroomcytometrie zoals beschreven in 2.8 en 2.9. De transcriptie van bi-component leukotoxinen die zich richten op menselijke PMN's door Staph aureus vereist dat het SA- of S2-componentensysteem het nut van de beschreven tests aantoont voor het kwantificeren van Staph aureus cytotoxiciteit tegen menselijke PMN's.

Deze experimenten werden uitgevoerd met een klinisch relevant Staph aureus isolaat geïdentificeerd als USA300 in een isologenische verwijdering mutant van SA of S in deze stam. Het linkerpaneel toont gezuiverde PMN's en het rechterpaneel toont opzettelijk verontreinigde monsters als voorbeeld. PMN geïsoleerd met behulp van de procedures beschreven in sectie een van dit protocol werden bevlekt met propidium jodide en onderzocht met behulp van stroom cytometrie.

Voorwaartse en zijverstrooiende percelen werden gebruikt om besmetting van gezuiverde PMN's door monocyten of lymfocyten jarenlang op te sporen 1A en 1B. De integriteit van PMN werd bepaald met behulp van propidium jodide-kleuring. Door gebruik te maken van de beschreven methode van menselijke PMN zuivering, kunnen we consequent isoleren vijf keer 10 tot de 7e tot een keer 10 tot de 8e PMN die meer dan 98% zuiver en zijn meer dan 95% propidium iodide negatief.

De cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 en de AsaeR/S mutant werden getest tegen gezuiverde PMN's. Deze experimenten tonen een concentratieafhankelijke toename aan van de propidium jodide kleuring van gezuiverde PMN's na 30 minuten intoxicatie met extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300, maar niet met de AsaeR/S mutant. Verdere experimenten toonden een gestage toename van het aandeel van propidium jodide positieve PMN's na intoxicatie door USA300 extracellulaire eiwitten die plateaued na ongeveer 30 minuten.

Minimale propidium jodide kleuring van menselijke PMN's werd opgemerkt op alle tijdstippen na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door de AsaeR / S mutant. Ten slotte werd de cytotoxiciteit van USA300 en AsaeR/S mutant tegen PMN's na gesynchroniseerde phagocytose getest, een concentratieafhankelijke toename van het aandeel propidium jodide positieve PMN's werd 90 minuten na de phagocytose van USA300 waargenomen. Aanzienlijk minder PMN's waren propidium jodide positief na de fagocytose van de AsaeR/S mutant.

In elk van deze experimenten werd gebruik gemaakt van de opsomming van de VS300 en AsaeR/S mutanten enpoeculum dat het contrast in cytotoxiciteit tussen deze stammen niet te wijten was aan verschillen in de concentratie van gebruikte bacteriën. Dit protocol beschrijft de zuiveringen van PMN's uit menselijk bloed in twee verschillende technieken voor het kwantificeren van de cytotoxiciteit van S.aureus tegen deze aangeboren immuuncellen. Het succes van deze procedures zal afhangen van de kwaliteit van de gezuiverde PMN's en de juiste voorbereiding van Staph aureus bacteriën of supernatants.

Raadpleeg het volledige manuscript voor belangrijke punten om te overwegen tijdens het uitvoeren van deze procedures. USA300 is een virulente MRSA isolaat en het verlies van AsaeR / S drastisch vermindert transcriptie van virulentie factoren die gericht zijn op menselijke PMN's, waardoor deze stammen ideale modellen voor het vergelijken van cytotoxiciteit met behulp van de beschreven assays. Het afstemmen van de groeiomstandigheden, de toegevoegde volumes van supernatants of de verhouding van bacteriën tot PMN's kan nodig zijn bij het gebruik van andere stammen van Staph aureus.