Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

Deze methode maakt het mogelijk om de menselijke bloed-hersenbarrière te analyseren door het meten van bacteriële traversal op verschillende behandelingen. Het kan helpen om de pathogenese van bacteriële meningitis en postoperatieve delirium te ontdekken. Het is een eenvoudige methode en de effecten van de behandeling worden direct vertegenwoordigd door het aantal bacteriën.

Het kan worden gewijzigd om een hoge doorvoeranalyse van verbindingen op de endotheelcellen mogelijk te maken. Begin met het monteren van de 12-put plaat in een biologische veiligheidskast. Pak de plaat en elke insert, gebruik dan gesteriliseerde tangen om de inserts te grijpen aan hun basis en leg ze in de putten.

Bestrijk het poreuze membraan van elke wisselplaat met 90 microliter van 10 microgram per microliter collageen IV en fibronectinemengsel en broed de plaat gedurende 24 uur in een celkweekinator in een celkweekinator bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, was de inzetstukken twee keer door het pipetten van een milliliter PBS in elke insert en aspirating het met een vacuümpomp. Vervolgens equilibrate de membranen door pipet voorverwarmd DMEM F12 medium in de bovenste en onderste kamers en de plaat incuren op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Om de menselijke microvasculaire endotheelcellen te zaaien, het medium uit de celkweekkolf te halen en de cellen te wassen met 10 milliliter PBS. Bedek de cellen volledig met vijf milliliter trypsine EDTA en incuberen de kolf gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Breng vijf milliliter van de cellen in een 15 milliliter buis en voeg vijf milliliter FCS met medium om de enzymatische reactie te stoppen.

Centrifuge de suspensie gedurende drie minuten op 210 keer g, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in vijf milliliter van medium. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan 10 microliter van 0,4% trypanblauwe vlek en voeg vervolgens 10 microliter van het mengsel toe aan een telkamer. Zet de telkamer in de cel teller en start het juiste programma om ervoor te zorgen dat de teller is gericht.

Na het tellen, zaad 200,000 cellen in elke bovenste kamer op de 12-put plaat en broeden de plaat op 37 graden Celsius gedurende 14 dagen het veranderen van de media in de bovenste en onderste kamer om de twee tot drie dagen. Zorg er na 14 dagen voor dat de celvloeiing 100% is door ze met een microscoop te imaging. Een dag voor de permeabiliteitsmeting, zet een kolonie E.coli stam GM2163 in drie milliliter LB medium.

Kweek de cellen op 37 graden Celsius gedurende 24 uur in een incubatieshaker. Om cellen met een verbinding van belang te behandelen, verdun het aan zijn definitieve concentratie in DMEM F12 middel en voeg dit mengsel in de hogere en lagere kamers in de 12-goedplaat toe, dan de plaat in een celkweek incubator uitbroeden. Na de incubatie, uitwisseling van het volledige medium met antibiotica-vrij medium.

Bepaal de concentratie van de nachtelijke bacteriële cultuur door het meten van de optische dichtheid op 600 nanometer, dan verdunnen tot een OD600 van 0,5 in een 50 milliliter Falcon buis. Voeg in een biologische veiligheidskast 450 microliter van de bacteriële oplossing toe aan elke bovenste kamer van de 12-bronplaat en broed de plaat vervolgens zes uur uit bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijder de insert met tangen en monster 50 microliter van het medium uit elke onderste kamer zorg ervoor dat het medium niet morsen van de bovenste kamers in de onderste.

Het is belangrijk om de media van de bovenste en onderste kamer strikt te scheiden, omdat een overloop van bacteriën uit de bovenste kamer tot vals-positieve resultaten zou leiden. Laat elk monster op een aparte agarplaat vallen en streep de oplossing met een celspreader. Broed de platen 24 uur lang op 37 graden Celsius en tel de kolonies.

Om het effect van glycatie op microbiële traversale door de bloed-hersenbarrière te onderzoeken, werden cellen behandeld met een 0,5 en een 0,15 millimolar glyoxale oplossing gedurende een uur met onbehandelde cellen die als controle dienen. De glycatie werd vervolgens gedetecteerd via immunoblotting met anti-AGE antilichamen. De verkregen bacteriële kolonies werden geteld en werden vertegenwoordigd als het absolute aantal kolonies of het relatieve aantal kolonies dat aan de controle wordt genormaliseerd.

Monsters behandeld met glyoxal weergegeven een verhoogd aantal kolonies waaruit blijkt dat de behandeling een effect heeft op de cellulaire barrière dichtheid. Om glucose-geïnduceerde eiwitglycatie te onderzoeken, werden THBMECs gekweekt in normale glucose en hoog glucosemedium. Het absolute aantal kolonies en het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle gaf aan dat glucose geen significant effect op de integriteit van de bloed-hersenbarrière had.

Behandelde endotheelcellen kunnen verder worden geanalyseerd door proteomics benaderingen, bijvoorbeeld massaspectrometrie, om veranderingen in het proteoom te analyseren. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de menselijke bloed-hersenbarrière en bacteriële traversale. Het kan worden gebruikt om aspecten van veroudering en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer te ontdekken.