Name: Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer een snelle screeningsmethode voor RNA-silencing-suppressoren bij plantpathogenen met Nicotiana bethamiana. Deze techniek verbetert de efficiëntie en nauwkeurigheid van identificatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het "Shuguang Program" van Shanghai Education Development Foundation en Shanghai Municipal Education Commission, het National Key Research and Development Program van China National Key R & D Program of China ( 2018YFD0201500), de National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 en 31660510), het Thousand Talents Program for Young Professionals of China, en de Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

OPMERKING: Alle stappen van de procedure moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: Stort alle media die pathogene microben bevatten, evenals de planten en plantenweefsel die in de test worden gebruikt, in de juiste afvalcontainers en autoclave voordat ze worden weggegooid.
1. Bereiding van plasmidconstructies die putavestoffen bevatten
<ol><li>Selecteer putative gescheiden effectoren die sterk worden uitgedrukt tijdens infectie, zoals bepaald door RNA sequencing (RNA-Seq), en verder door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) techniek.</li>
	<li>Bepaal het signaal peptide splitsing site van elke effector met behulp van een software tool zoals SignalP18.</li>
	<li>Ontwerp primers en voer PCR uit om de gencodering van de effector van belang te versterken met behulp van high fidelity DNA polymerase. Voer agarose gel elektroforese uit om het PCR-product te controleren en kloon vervolgens de amplicon in Gateway entry vector pQBV3 met behulp van de ligatievrije kloonkit(Tabel met materialen), en vervolgens in de doelexpressievector pEG100 met behulp van de LR-recombinatiereactie19.</li>
	<li>Transformeer 3−5 μL LR-reactiemengsel in 100 μL competente E. coli-cellen (bijvoorbeeld TOP10, DH5α), verdeel de getransformeerde bacteriële cellen op Luria-Bertani (LB) agarmedium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en incubeer bij 37 °C gedurende 16-20 uur. OPMERKING: Positieve transformatoren kunnen worden geïdentificeerd door kolonie PCR20 en verder geanalyseerd door plasmid miniprep en sequencing.</li>
	<li>Introduceer 50−100 ng recombinant plasmiden die effector-eiwit dragen in 100 μL chemisch competente A. tumefaciens cellen (bijvoorbeeld GV3101 of C58C1), meng zachtjes en vries vervolgens in vloeibare stikstof gedurende 1 min. Ontdooi de cellen in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Voeg 500 μL LB-bouillon toe en incubeer bij 30 °C gedurende 4−6 uur met zacht schudden, en breng vervolgens alle agrobacteriëncellen over en spreid ze uit op LB agar medium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en 50 μg/mL rifampicin bij 30 °C gedurende 2 dagen. OPMERKING: Positieve klonen kunnen worden geverifieerd door kolonie PCR.</li>
	<li>Gebruik een enkele getransformeerde kolonie voor agro-infiltratie experimenten, tenzij anders gericht. OPMERKING: In het huidige onderzoek bevatte geen van de geteste effectorgenen voorspelde introns; elk van de genen werd direct versterkt uit genomic DNA van een Phytophthora sojae isolaat. Een Gateway plant expressie vector zonder tag wordt aanbevolen, maar niet nodig.</li>
</ol>2. Bereiding van N. benthamiana 16c planten
<ol><li>Bereid potgrondmixen bestaande uit (in volume) 50% veenmos, 30% perliet en 20% vermiculiet en autoclave bij 120 °C gedurende 20 min.</li>
	<li>Week autoclaved bodemmengsels met plantaardige meststofoplossing (1 g/L) en verpak ze in kleinere potten (80 mm x 80 mm x 75 mm) opgeslagen in een grotere lade (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Zaai een of twee zaden van N. benthamiana 16c op het bodemoppervlak van elke pot. Bedek de lade met een plastic koepel en laat zaden ontkiemen.</li>
	<li>Plaats de lade onder licht en temperatuurgestuurd groeikamers met een temperatuur van 23−25 °C, 50−60% relatieve vochtigheid en een lange-daagse fotoperiode (14 uur licht/10 uur donker, met verlichting bij 130−150 μE·m-2s-1).</li>
	<li>Neem de plastic koepel af nadat de zaden ontkiemen (3−4 dagen) en laat de zaailingen groeien onder dezelfde omstandigheden die worden gebruikt voor de kiemstap.</li>
	<li>Voeg elke 2−3 dagen een passende hoeveelheid water toe, waarbij de grond vochtig blijft, maar niet wekend; voeg elke 10 dagen kunstmest toe om verdere groei te bevorderen. Handhaven N. benthamiana 16c planten onder normale omstandigheden totdat ze klaar zijn voor gebruik; in dit stadium moet de plant ten minste vijf volledig ontwikkelde echte bladeren en geen zichtbare axillaire of bloemknoppen hebben, en de bladeren moeten een gezonde groene uitstraling hebben).</li>
	<li>Gebruik 3−4 week oude bladeren van N. benthamiana 16c voor lokale RNA-uitschakelingstesten, en jonge N. benthamiana 16c planten (10−14 dagen oud) voor systemische RNA-uitschakelingstesten. OPMERKING: De groeiomstandigheden en faciliteiten van planten verschillen per laboratoria; kies gezonde, goed ontwikkelde en volledig uitgebreide bladeren voor infiltratie.</li>
</ol>3. Voorbereiding van de Agrobacterium cultuur voor infiltratie
<ol><li>Kies een positieve kolonie uit de LB-plaat en inenten de cellen in glazen buis met 5 mL LB medium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en 50 μg/mL rifampicin. Laat de cellen groeien bij 30 °C met schudden bij 200 tpm gedurende 24−48 uur.</li>
	<li>Breng 100 μL cultuur over in 5 mL LB-medium aangevuld met dezelfde antibiotica, 10 mM 2-(N-morpholino) ethaanzuur (MES; pH 5.6) en 20 μM acetosyringone (AS). Kweek bacteriën bij 30 °C met schudden bij 200 tpm gedurende 16−20 uur.</li>
	<li>Centrifugecellen bij 4.000 x g gedurende 10 min. Giet de supernatant af en breg de pellet opnieuw op in 2 mL van 10 mM MgCl2 buffer.</li>
	<li>Herhaal stap 3.3 om ervoor te zorgen dat antibiotica volledig worden verwijderd.</li>
	<li>Bepaal de dichtheid van de Agrobacterium cultuur door de optische dichtheid op 600 nm (OD600)te meten. Pas aan op een OD600 van 1,5−2.0 met 10 mM MgCl2 buffer.</li>
	<li>Voeg 10 mM MES (pH 5.6) en 150 μM AS toe aan de uiteindelijke suspensieculturen en incubeer de cellen bij RT gedurende ten minste 3 uur zonder te schudden. LET OP: Laat de laatste schorsingsculturen niet van de ene op de andere dag achter.</li>
</ol>4. Co-infiltratie N. benthamiana bladeren
<ol><li>Meng gelijke volumes van een Agrobacterium cultuur die 35S-GFP bevat met een Agrobacterium cultuur met 35S- komkommer mozaïek virussuppressor 2b (CMV2b), putative effector, of lege vector (EV).</li>
	<li>Voorzichtig en langzaam infiltreren in de gemengde agrobacterium suspensusspen aan de abaxiale zijden van N. benthamiana 16c bladeren met behulp van een 1 mL naaldloze spuit.</li>
	<li>Verwijder de resterende bacteriële suspensie van de bladeren met zachte weefselruitenwissers en omcirkel de marges van de geïnfiltreerd patches met een makerpen.</li>
	<li>Laat de geïnfiltreerd planten in de groeikamer onder dezelfde groeiomstandigheden. OPMERKING: Om veiligheidsredenen moeten beschermende oogbrillen en een masker worden gedragen tijdens infiltratie. Om kruisbesmetting te voorkomen, moeten handschoenen worden vervangen of gesteriliseerd met ethanol tussen infiltraties. Normaal gesproken is ten minste 1 mL agrobacterium suspensingen per blad nodig voor infiltratie. Voor systemische uitschakeling zijn ten minste twee bladeren nodig voor infiltratie.</li>
</ol>5. GFP-beeldvormingsanalyse
<ol><li>Visueel detecteren GFP fluorescentie in nieuw geteelde bladeren van hele planten 2 weken na de infiltratie (voor systemische RNA silencing) of geïnfiltreerd patches van bladeren 3−4 dpi met behulp van een lange golf ultraviolet (UV) lamp zonder bladeren collectie.</li>
	<li>Fotografeer verzamelde planten en/of vrijstaande bladeren met een digitale camera voorzien van zowel UV- als gele filters. OPMERKING: Voor tests van lokale uitschakeling onderdrukking, onderzoeken geïnfiltreerd patches van N. benthamiana 16c bladeren, terwijl voor systemische uitschakeling onderdrukking activiteit, onderzoeken nieuw geteelde bladeren. RNA-uitschakelingsonderdrukkingsactiviteit kan variëren tussen individuele effectoren. Daarom, let op de patches of bladeren over een paar dagen vanaf 3 dpi. Gebruik CMV2b en EV als respectievelijk positieve en negatieve controles.</li>
</ol>6. Noordelijke vlekanalyse van GFP mRNA-niveaus in geïnfiltreerd blad
<ol><li>Isolatie van totaal RNA van bladweefsel met behulp van het RNA isolatiereagen(Tabel met materialen)<ol>
<li>Verzamel bladweefsels van geïnfiltreerd N. benthamiana 16c patches op 4−7 dpi, verpulver in vloeibare stikstof naar een fijn poeder en breng het poeder over naar een steriele 2 mL buis.</li>
		<li>Voeg het RNA isolatiereagen (1 mL/100 mg weefsel) onmiddellijk toe aan de bemonsterde buis in een kap, schud krachtig om te homogeniseren en uitbroed bij RT gedurende 5 min.</li>
		<li>Voeg chloroform (200 μL/1 mL RNA isolatiereagen) toe aan elke buis in een kap, schud krachtig gedurende 15 s en en broed bij RT gedurende 5 min. Centrifugeer het homogenaat bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
		<li>Breng de supernatant over in een nieuwe RNase-vrije buis en gooi de pellet weg. Voeg 0,7 volume isopropanol toe aan de supernatant, omkeer meerdere keren zachtjes en incubeer het mengsel bij RT gedurende 10 min.</li>
		<li>Stort de RNA-pellet neer door centrifugeren op 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg, was de pellet met 70% ethanol en droog de pellet in een kap. Los het RNA op in diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water door gedurende 10-20 min in een waterbad van 65 °C uit te broeden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Noordelijke vlekanalyse van GFP mRNA niveau in de geïnfiltreerd bladeren<ol>
<li>Bereid een 1,2% formaldehyde denatureren agarose gel in 1x MOPS lopende buffer.</li>
		<li>Meng RNA 1:1 met RNA laden kleurstof en denature door incubatie op 65 °C gedurende 10 min, onmiddellijk chill de gedenatureerde monsters op ijs voor 1 min.</li>
		<li>Laad de monsters op de gel en elektroforrese bij 100 V gedurende 50 minuten tot het RNA goed gescheiden is.</li>
		<li>Spoel de gel in 20x zout-natriumcitrate (SSC) buffer om formaldehyde te verwijderen en breng de gel over naar nylon membraan door capillaire overdracht in 20x SSC buffer 's nachts. Week het membraan in 2x SSC en bevestig het RNA aan het membraan door het natte membraan bloot te stellen aan UV-kruiskoppeling.</li>
		<li>Voeg de juiste hoeveelheid hybridisatiebuffer (10 mL per 100 cm2 membraan) toe; Materiaaltabel) in een hybridisatiebuis en ageert bij 60 °C in een hybridisatieoven.</li>
		<li>Doe het membraan in de hybridisatiebuis en incubeer gedurende 60 min bij 60 °C. Verdun een 5'DIG-gelabelde DNA-sonde (eindconcentratie, 50 ng/mL) in de hybridisatieoplossing die vooraf verwarmde hybridisatiebuffer bevat.</li>
		<li>Gooi de prehybridisatiebuffer weg en vervang onmiddellijk door vooraf verwarmde hybridisatieoplossing met de DIG-gelabelde sonde. Incubeer de vlek met sonde bij 60 °C 's nachts, met zachte agitatie.</li>
		<li>Na hybridisatie, was het membraan twee keer in buffers van toenemende strengheid bij 60 °C gedurende 20 min elk. Veeg het membraan voorzichtig af om extra wasbuffer te verwijderen en voeg reagentia toe zoals voorgesteld in de chemiluminescenthybridisatie- en detectiekit(Tabel met materialen).</li>
		<li>Detecteer gehybridiseerde signalen door chemiluminescente reactie in combinatie met het beeldvormingssysteem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Virulence+Annotation+%28RVA%29%3A+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li>
<li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+pathogen+effector+functions%3A+of+pathogens%2C+hosts+and+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li>
<li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+stage%3A+effectors+in+the+spotlight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li>
<li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li>
<li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-Pathogen+Effectors%3A+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li>
<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li>
<li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens%3A+defence%2C+counter-defence+and+counter-counter-defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li>
<li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+silencing+suppressors%3A+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li>
<li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li>
<li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li>
<li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li>
<li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li>
<li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li>
<li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li>
<li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SignalP+4.0%3A+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li>
<li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodman%2C+ME+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li>
<li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li>
<li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+and+its+suppression%3A+novel+insights+from+in+planta+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li>
<li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

RNA-uitschakeling is een belangrijk afweermechanisme dat door planten wordt gebruikt om virale, bacteriële, oomycete- en schimmelpathogenen te bestrijden. Op hun beurt hebben deze microben ontwikkeld uitschakeling suppressor eiwitten tegen te gaan antivirale uitschakeling, en deze RSSs interfereren met verschillende stappen van de RNA silencing pad22,23. Verschillende screeningtests zijn ontwikkeld om RSSs te identificeren10.
<p class=...

In de afgelopen twee decennia heeft versnelling van genoomsequencing van micro-organismen die plantenziekten veroorzaken geleid tot een steeds grotere kenniskloof tussen sequentie-informatie en de biologische functies van gecodeerde eiwitten1. Onder de moleculen onthuld door sequencing projecten zijn effector moleculen die aangeboren immuniteit te onderdrukken en te vergemakkelijken gastheer kolonisatie; deze factoren worden afgescheiden door destructieve plantenpathogenen, waaronder bacteriën, aaltjes en filamenteuze microben. Om op deze bedreigingen te reageren, hebben waardplanten nieuwe receptoren ontwikkeld die deze effectoren herkennen, waardoor herstel van de immuunrespons mogelijk is. Effectoren zijn dus onderhevig aan verschillende selectieve druk, wat leidt tot diversificatie van effectorrepertoires onder pathogene lijnen2. In de afgelopen jaren is aangetoond dat putatieve effectoren van plantenpathogenen de immuniteit van planteningeboren en ontkracht door druk te maken tot cellulaire processen van de gastheer om de microben op verschillende manieren ten goede te komen, waaronder dysregulatie van signaleringstrajecten, transcriptie, intracellulair vervoer, cytoskeletstabiliteit, blaashandel en RNA-uitschakeling3,4,5. De overgrote meerderheid van de pathogene effectoren, met name die van filamenteuze ziekteverwekkers, is echter raadselachtig gebleven.
RNA-uitschakeling is een homologie-gemedieerde geninactivatiemachines die worden bewaard onder eukaryoten. Het proces wordt geactiveerd door lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) en richt zich op het homologe single-stranded RNA (ssRNA) op een sequentiespecifieke manier, en het manipuleert een breed scala aan biologische processen, waaronder antivirale verdediging6. Om aangeboren immuunreacties van de gastheer te overwinnen, zijn sommige virussen geëvolueerd om RNA-uitschakeling te compenseren, inclusief de mogelijkheid om te repliceren in intracellulaire compartimenten of te ontsnappen aan het gereorganiseerde signaal. Niettemin is de meest algemene strategie waarmee virussen hun genoom beschermen tegen RNA-uitschakelingsafhankelijk verlies van genfunctie, het coderen van specifieke eiwitten die RNA-uitschakelingonderdrukken 7,8. Verschillende benaderingen zijn vastgesteld om virale suppressors van RNA-uitschakeling (VSRs) te screenen en te karakteriseren, waaronder de co-infiltratie van Agrobacterium tumefaciens culturen, transgene planten die putatieve suppressors, enting en celcultuur9,10,11,12,13.
Elk van deze tests heeft voor- en nadelen, en identificeert VSRs op zijn eigen verschillende manier. Een van de meest voorkomende benaderingen is gebaseerd op de co-infiltratie van individuele A. tmuefaciens culturen herbergen de potentiële virale eiwit en een reporter gen (typisch groene fluorescerende eiwit [GFP]) op de Nicotiana benthamiana 16c planten constitutief uitdrukken GFP onder de controle van de bloemkool mozaïek virus 35S promotor. Bij afwezigheid van een actieve virale uitschakelingsuppressor wordt GFP door de gastheercellen als exogene geïdentificeerd en wordt het binnen 3 dagen na infiltratie het zwijgen opgelegd (dpi). Als het virale eiwit daarentegen onderdrukkingsactiviteit bezit, blijft het expressieniveau van GFP stabiel boven 3−9 dpi9. Deze co-infiltratie test is eenvoudig en snel; het is echter niet zeer stabiel of gevoelig. Niettemin heeft de test tal van VSR's geïdentificeerd met diverse eiwitsequenties en structuren in veel RNA-virussen7,8.
Onlangs zijn verschillende effector eiwitten die de cellulaire RNA-uitschakelingsactiviteit kunnen remmen, gekenmerkt door bacteriële, oomycete- en schimmelplantenpathogenen14,15,16. Deze bevindingen impliceren dat RNA-uitschakelingsonderdrukking een gemeenschappelijke strategie is voor het vergemakkelijken van infectie die door ziekteverwekkers in de meeste koninkrijken wordt gebruikt. In theorie zouden veel, zo niet alle, van de effectoren RNA-uitschakelingsonderdrukkenden (RSS'en) kunnen coderen; tot op heden zijn er echter slechts enkele geïdentificeerd, voornamelijk als gevolg van het tekort aan de betrouwbare en algemene screeningstrategie. Bovendien zijn suppressors van RNA-uitschakeling niet onderzocht in de overgrote meerderheid van de plantenpathogenen17.
In dit rapport presenteren we een geoptimaliseerd en algemeen protocol voor het identificeren van plantenpathogene effectoren die lokale en systemische RNA-uitschakeling kunnen onderdrukken met behulp van de agro-infiltratietest. Het belangrijkste doel van deze studie was om de belangrijkste aspecten van het protocol te benadrukken en de stappen in detail te beschrijven, waardoor een screeningtest werd verstrekt die geschikt is voor bijna alle effectoren van plantenpathogenen.

<table><tbody><tr><td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Acetosyringone (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Inductie van Agrobacterium</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB-medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Elektroforese</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Afbeelding</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB-medium</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB-medium</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografie</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescente detectiemodule onderdeel van dafa-kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Luminescentiedetectie</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Ligatie</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Hybridisatiebuffer</td></tr><tr><td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Plasmidextractie</td></tr><tr><td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Gelextractie</td></tr><tr><td>EDTA dinatriumzout dihydraat</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS-buffer</td></tr><tr><td>Elektroforese-voeding</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Nucleïnezuurelektroforese.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Vectordigestie</td></tr><tr><td>Gel Image System</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Afbeelding</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>LR Clonase II-enzym</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>LR-reactie</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Blotting-membraan 0,45um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south biotin random prime dna-labeling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Biotinelabeling</td></tr><tr><td>PCR Thermal Cyclers</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Veenmos</td><td>PINDSTRUP</td><td>Dark Gold + klei</td><td>Planten</td></tr><tr><td>Peters Wateroplosbare Meststof</td><td>ICE</td><td>Peter Professional 20-20-20</td><td>Meststof</td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Rifamycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>RNA Gel Loading Dye</td></tr><tr><td>Natriumacetaat Hydraat</td><td>Amresco/VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS-buffer</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB-medium</td></tr><tr><td>Tri-Natriumcitraat</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC-buffer</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>RNA-isolatiereagens</td></tr><tr><td>UV-lamp</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>Observatie</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Oven</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Northern</td></tr></tbody></table>

screening en identificatie van rna silencing suppressors van secreted effectors of plant pathogens

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA-uitschakeling is een evolutionair geconserveerd, sequentiespecifiek genregulatiemechanisme in eukaryoten. Verschillende plantenpathogenen hebben eiwitten ontwikkeld met de mogelijkheid om de gastheer plant RNA uitschakeling pad remmen. In tegenstelling tot virus effector eiwitten, slechts een aantal uitgescheiden effector eiwitten hebben aangetoond dat de mogelijkheid om RNA-uitschakeling te onderdrukken in bacteriële, oomycete, en schimmelpathogenen, en de moleculaire functies van de meeste effectors blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we in detail een enigszins gewijzigde versie van de co-infiltratietest die kan dienen als een algemene methode voor het observeren van RNA-uitschakeling en voor het karakteriseren van effector-eiwitten die worden afgescheiden door plantaardige pathogenen. De belangrijkste stappen van de aanpak zijn het kiezen van de gezonde en volledig ontwikkelde bladeren, het aanpassen van de bacteriecultuur aan de juiste optische dichtheid (OD) op 600 nm, en het observeren van groene fluorescerende eiwitten (GFP) fluorescentie op het optimale moment op de geïnfiltreerd bladeren om te voorkomen dat effectoren met een zwakke onderdrukkingsactiviteit worden weggenomen. Dit verbeterde protocol zal bijdragen aan een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening van RNA-uitschakelingssuppressors en dient als een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van de moleculaire functies van deze eiwitten.

Hierboven beschrijven we de stapsgewijze procedure voor een verbeterde screening test voor het beoordelen van de RSS-activiteit van P. sojae RxLR effectors. In totaal duurt het experiment 5−6 weken. Vervolgens kunnen de RSS'en die door de test worden geïdentificeerd, verder worden gekarakteriseerd in termen van functie en moleculair mechanisme. Als voorbeeld van onze aanpak gebruikten we de P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor van RNA silencing 1 (PSR1), die wor...

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over het screenen van de RNA-onderdrukkingsonderdrukkingen die worden afgescheiden door plantenpathogenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het bieden van een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening test voor RNA silencing suppressors identificatie. Bereid potgrondmengsels voor bestaande uit 50%veenmos, 30% perliet en 20% vermiculiet en autoclave bij 120 graden Celsius gedurende 20 minuten.Week de autoclaved grond mengt met plantaardige meststof oplossing op een gram per liter en subpackage ze in kleinere potten opgeslagen in een grotere lade. Zaai een of twee zaden van Nicotiana bethamiana 16c op het bodemoppervlak van elke pot. Bedek de lade met een plastic koepel en laat de zaden ontkiemen.Plaats de lade onder licht- en temperatuurgecontroleerde groeikamers met een temperatuur van 23 tot 25 graden Celsius, 50 tot 60% relatieve vochtigheid en een lange dag fotoperiode. Na drie tot vier dagen ontkiemen de zaden. Neem de plastic koepel uit en laat de zaailingen groeien onder dezelfde omstandigheden die worden gebruikt voor de kiemstap.Om de twee tot drie dagen, voeg een passende hoeveelheid water houden van de bodem vochtig, maar niet weken. Elke 10 dagen, voeg kunstmest toe om verdere groei te bevorderen. Onderhoud Nicotiana bethamiana 16c planten onder normale omstandigheden totdat de planten ten minste vijf volledig ontwikkelde echte bladeren hebben zonder zichtbare oksel of bloemknoppen en de bladeren hebben een gezonde groene uitstraling.Gebruik 10 tot 14-dagen oude Nicotiana bethamiana 16c planten voor systemische RNA silencing assays en drie tot vier weken oude bladeren van Nicotiana bethamiana 16c voor lokale RNA silencing assays. Gebruik een tip om een positieve kolonie uit de LB-plaat te halen en inenting van de cellen in een glazen buis met vijf milliliter LB-medium aangevuld met 50 microgram per milliliter Kanamycine en 50 microgram per milliliter Rifampicin. Laat de cellen groeien op 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM gedurende 24 tot 48 uur.Breng 100 microliter van de cultuur over in vijf milliliter LB-medium aangevuld met dezelfde antibiotica, 10 millimolar MES bij pH 5.6 en 20 micromolar AS. Laat de bacteriën groeien op 30 graden Celsius met schudden op 200 RPM gedurende 16 tot 20 uur. Centrifugeren de cellen op 4,000 keer g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in twee milliliter van 10 millimolar magnesiumchloridebuffer.Herhaal de was om de volledige verwijdering van antibiotica te garanderen. Bepaal de dichtheid van de Agrobacteriumcultuur door de optische dichtheid op 600 nanometer te meten. Pas de celkweek aan met een magnesiumchloridebuffer van 10 millimolar op een OD 600 van 1,5 tot 2,0.Voeg 10 millimolar MES bij pH 5.6 en 150 micromolar AS toe aan de uiteindelijke suspensiecultuur en broed de cellen bij kamertemperatuur minstens drie uur zonder te schudden. Meng gelijke volumes van een Agrobacteriumcultuur die 35S groen fluorescerend eiwit bevat met een Agrobacteriumcultuur die 35S komkommermozaïekvirusonderdrukker 2b, putative effector of lege vector bevat. Met behulp van een een milliliter naaldloze spuit, zorgvuldig en langzaam infiltreren in de gemengde Agrobacterium suspensies aan de abaxiale zijden van Nicotiana bethamiana 16c bladeren.Verwijder de resterende bacteriële suspensie van de bladeren met zachte weefseldoekjes en omcirkel de marges van de geïnfiltreerde patches met een markerpen. Drie tot vier dagen na infiltratie, gebruik maken van een lange golf ultraviolette lamp om visueel te detecteren GFP fluorescentie in de geïnfiltreerde patches van bladeren. Twee weken na infiltratie, gebruik de lamp om nieuw geteelde bladeren van de hele plant te detecteren voor systemische RNA-uitschakeling.Om het totale RNA van het bladweefsel te isoleren op vier tot zeven dagen na infiltratie, verzamel de bladweefsels van de geïnfiltreerde Nicotiana bethamiana 16c patches in een mortier. Plaats vloeibare stikstof in de mortel en maal het weefsel in een fijn poeder met een slijpstaaf en breng het poeder over naar een steriele twee milliliter buis. Voeg onmiddellijk het RNA isolatiereagens toe bij het volume van één milliliter per 100 milligram weefsel aan de monsterbuis in een kap, vortex krachtig om te homogeneren en vijf minuten lang bij kamertemperatuur uit te broeden.Voeg chloroform toe bij het volume van 200 microliter per één milliliter RNA-isolatiereagens aan elke buis in de kap, schud krachtig gedurende 15 seconden en broed vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het homogenaat op 12.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant in een nieuwe RNase-vrije buis en gooi de pellet weg.Voeg 0,7 volume isopropanol toe aan de supernatant, draai het mengsel voorzichtig meerdere keren om en broed het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur uit. Precipitate de RNA pellet door centrifugatie op 12,000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg.Was de pellet met 70% ethanol en droog de pellet in een kap. Los het RNA op in met diethyl pyrocarbonaat behandeld water door 10 tot 20 minuten in een waterbad van 65 graden Celsius uit te broeden. Om noordelijke blot-analyse van GFP messenger RNA-niveaus uit te voeren, bereidt u een 1,2% formaldehyde-denatureringsagarosegel voor in 1X MOPS-runbuffer.Meng het RNA een-op-een met RNA laden kleurstof en denatureren het RNA door incubatie op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Onmiddellijk chill de gedenatureerde monsters op ijs voor een minuut. Laad met een pipet de monsters in de putten van de gel en elektroforens op 100 volt gedurende 50 minuten totdat het RNA goed gescheiden is.Spoel de gel in 20x zout natriumcitraatbuffer om de formaldehyde te verwijderen. Voer capillaire overdracht 's nachts door het opzetten van 20X zout natrium citraat buffer, een laag papieren handdoek, twee lagen natte Whatman papier, een laag gel, een laag nylon membraan, twee lagen nat Whatman papier, twee lagen droog Whatman papier, een glazen plaat, en een gewicht. In de ochtend wordt het RNA in de gel overgebracht naar het nylon membraan.Week het membraan in 2x zout natriumcitraat en bevestig het RNA aan het membraan door het natte membraan bloot te stellen aan UV-crosslinking. Ga verder volgens het manuscript. Volledig ontwikkelde bladeren van drie tot vier weken oude Nicotiana bethamiana 16c planten werden mede-geïnfiltreerd in patches met Agrobacterium mengsels die 35S GFP.Op vier dagen na infiltratie, GFP fluorescentie van het geïnfiltreerde gebied werd afgebeeld onder natuurlijk licht en lange golf UV-licht. Noordelijke vlek bleek dat GFP messenger RNA hoger geaccumuleerd in de bladeren uitdrukken 35S GFP plus 35S CMV2b of 35S GFP plus 35S PSR1 dan in de bladeren uitdrukken 35S GFP plus EV. Agroinfiltratie test werd uitgevoerd om de verspreiding van het geluiddempende signaal in de bladeren van twee weken oude Nicotiana bethamiana 16c zaailingen te evalueren. Na 14 dagen na infiltratie vertoonde meer dan 98% van de EV geen duidelijke GFP-signalering in systemische bladeren.Terwijl zowel CMV2b als PSR1 de systemische verspreiding van het geluiddemende signaal efficiënt remden. GFP fluorescentie werd waargenomen in ongeveer 80% van de co-geïnfiltreerde planten en in de resterende 20% van de geïnfiltreerde planten met slechts een paar rode aderen verscheen in nieuw opgedoken bladeren. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe RNA-onderdrukkingsonderdrukkingsonderdrukkers te identificeren die door veel plantenpathogenen worden afgescheiden.De combinatie van planten en de juiste OD is het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure. Na deze procedure kan de functionele karakterisering van de RNA-onderdrukkingsonderdrukker worden gedaan om het mechanisme te onderzoeken van hoe deze suppressors op de hostRNA-uitschakeling drukken en wat de output is. Draag de veiligheidsbril wanneer u planten infiltreert en draag ook de latex handschoenen tijdens alle experimentstappen.

screening-identification-rna-silencing-suppressors-from-secreted

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Source: Shi, J., et al. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a co-infiltration assay for identifying pathogen effector proteins that suppress RNA silencing in Nicotiana benthamiana 16c. A fluorescent reporter and a candidate effector gene are delivered into plant leaves via Agrobacterium. Normally, RNA silencing degrades reporter transcripts, reducing fluorescence. Suppressor effectors...

Co-Infiltration Assay for Screening Pathogen Effectors that Suppress Plant RNA Silencing

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Hier beschrijven we een methode om een ​​gerichte siRNA "ubiquitome" scherm om nieuwe ubiquitine en ubiquitine-achtige regulatoren van de-HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren voeren. Dit kan worden aangepast aan elke biologische weg wanneer een robuuste uitlezing van reporter-activiteit beschikbaar.

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Een bioinformatica-pijpleiding, namelijk miRDeep-P2 (kortweg miRDP2), met bijgewerkte plant miRNA-criteria en een gereviseerd algoritme, kan microRNA transcriptomes nauwkeurig en efficiënt analyseren in planten, vooral voor soorten met complexe en grote Genomes.

Een bioinformatica-pijpleiding om de MicroRNA Transcriptomes in fabrieken nauwkeurig en efficiënt te analyseren

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het op aardappelvirus X (PVX) gebaseerde microRNA-uitschakelingssysteem (VbMS) om endogene microRNA's (miRNA's) in aardappelen functioneel te karakteriseren. Target mimic (TM) moleculen van miRNA van belang worden geïntegreerd in de PVX-vector en tijdelijk uitgedrukt in aardappel om de doel miRNA- of miRNA-familie tot zwijgen te brengen.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.

Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus

We beschrijven een eenvoudige maar zeer reproduceerbare methode om extracellulair RNA te isoleren van het bladoppervlak en de apoplast van Arabidopsis-planten.

Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

Leer een snelle screeningsmethode voor RNA-silencing-suppressoren bij plantpathogenen met Nicotiana bethamiana. Deze techniek verbetert de efficiëntie en nauwkeurigheid van identificatieonderzoek.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Meer video's verkennen