Name: Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring voor proteomics en biochemie. Deze methode identificeert en kwantificeert specifieke ubiquitin-ketentopologieën nauwkeurig.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Céline Jeanty bedanken voor haar hulp bij het maken van cellulaire pellets met behandeling van MG-132 zoals beschreven in de representatieve resultaten en Elise Mommaerts voor haar levering van E. coli pellets die in het protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van een zware peptidestandaard
<ol><li>Afhankelijk van de leverancier en kwaliteit van de gekochte zware peptiden, moeten de zware peptiden worden verdund. Dit protocol gebruikte de peptidesequenties gerapporteerd in tabel 1, waarbij het C-terminale aminozuur werd gewijzigd in Lysine (13C615N2-lysine) of Arginine (13C615N4-arginine).<ol>
<li>Meng de zware peptiden en verdun de mix met 50% acetonitril (ACN) om een peptidemix te creëren met elk peptide bij 10 μM.</li>
		<li>Maak aliquots van de peptidemix en bewaar bij -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Monstervoorbereiding
<ol><li>Monsterlysis OPMERKING: Bij de bereiding van het monster moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van de ubiquitineketens. Houd biologische monsters en buffers gekoeld bij 4 °C en voeg monsters zo snel mogelijk toe aan de ubiquitin stabilisatiebuffer.<ol>
<li>Bereid een oplossing van 1 M NH4HCO3 (ammoniumbicarbonaat) in water en stel de pH in op 8 met 1 M NaOH.</li>
		<li>Bereid een oplossing van 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) in water.</li>
		<li>Bereid de ubiquitin stabilisatiebuffer voor met 8 M ureum in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. De Ubiquitin stabilisatiebuffer moet elke keer opnieuw worden bereid. OPMERKING: Een oplossing van 5 ml van 8 m ureum vereist aanzienlijk minder dan 5 ml water, gezien de uitzetting van water in een verzadigde oplossing met ureum. LET OP: Bereid de buffer niet voor boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen.</li>
		<li>Het biologisch monster dat in een ubiquitin stabilisatiebuffer moet worden onderzocht, waarbij 0,5 μg/μL eiwit wordt gebruikt, wordt geresuspendeerd en de cellen met een geschikte methode voor het monster worden gelyseerd. Een sonicatiemethode bestaande uit drie pulsen van 10 s met een SFX 150 Branson sonifier ingesteld op 70% intensiteit met 10 s breuken op ijs tussen elke puls, werd gebruikt voor de cellijnen in dit protocol.</li>
		<li>Centrifugemonster bij 18.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C in een tafelcentrifuge.</li>
		<li>Breng supernatant over in een verse eiwitarme microcentrifugebuis. Monsters kunnen op dit punt indien nodig bij -20 °C worden opgeslagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van monster en controles
	<ol>
<li>Als de monsters bevroren zijn, mengt u ze (bijv. met een thermomixer) terwijl ze ontdooid zijn om het ureum snel op te lossen. LET OP: Gebruik geen temperaturen boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen.</li>
		<li>Centrifugemonster bij 18.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C in een tafelcentrifuge.</li>
		<li>Breng 20 μg monster over in een verse microcentrifugebuis met lage binding en stel het volume in op 50 μL met ubiquitin stabilisatiebuffer.</li>
		<li>Creëer een negatieve regeling met behulp van een genormaliseerd volume van de ubiquitin stabilisatiebuffer (50 μL). In dit monster mag geen lichte versie van elk peptide aanwezig zijn, waardoor elke lichte verontreiniging als gevolg van de piek-in zware peptiden kan worden waargekoppeld. Deze negatieve controle werd ook gebruikt voor de retentietijdplanning van de PRM zoals beschreven in punt 3.1.</li>
		<li>Er werd ook een positieve controle gecreëerd met ubiquitin stabilisatiebuffer en de toevoeging van commercieel beschikbare kettingtypes aan het genormaliseerde volume van de ubiquitin stabilisatiebuffer (50 μL). Gewoonlijk zijn K63, K48 en M1 beschikbaar. In de representatieve resultaten werden 20 ng K48, K63 en M1 gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Reductie, alkylering en spijsvertering
	<ol>
<li>Bereid een oplossing van 50 mM ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) in water en stel het monster in op pH = 8 met 1 M NaOH.</li>
		<li>Een kweek van E. coli gekweekt in LB bouillon werd 5.000 x g gecentrifugeerd gedurende 5 min om een pellet te vormen, die vervolgens 2x met PBS werd gewassen voordat resuspensie in ubiquitine stabilisatiebuffer bij 5 μg/μL.</li>
		<li>Voeg 1 μg E. colilysaat toe aan elk monster en controleer. Dit protocol maakt gebruik van E. coli (DH10B), maar elk complex lysaat zonder ubiquitin kan worden gebruikt. Merk op dat ubiquitin gemeenschappelijk is voor alle eukaryoten. OPMERKING: Het gebruik van een E. coli lysaatmatrix vermindert het verlies van peptiden als gevolg van niet-specifieke hechting aan plasticgoed. Dit is met name merkbaar in de negatieve controle of monsters met een beperkt eiwitgehalte en heeft een sterke invloed op de waarneming van K6312.</li>
		<li>Bereid een oplossing van 500 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) in MS-water (DTT kan als alternatief worden gebruikt).</li>
		<li>Verminder de monsters en controles door TCEP toe te brengen tot een eindconcentratie van 50 mM. Vortex kort voor incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Bij gebruik van DTT moet de temperatuur worden verhoogd tot 50 °C. LET OP: Gebruik geen temperaturen boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen.</li>
		<li>Bereid een oplossing van 550 mM chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Bewaren in het donker.</li>
		<li>Alkylaat de monsters en controles door CAA toe te voegen aan een eindconcentratie van 55 mM. Vortex kort voor incubatie gedurende 20 minuten bij RT in het donker. OPMERKING: CAA wordt gebruikt in plaats van iodoacetamide als reductiemiddel om de kans op een dubbele carbamidomethylmodificatie (114.0429) te verminderen op een lysineresidu dat wordt verward met een -GG-modificatie (114.0429)13.</li>
		<li>Voeg endopeptidase LysC toe aan de monsters in verhouding van 1:25 (m/w) tot het eiwitgehalte. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Verdun de monsters en controles met 200 μL van 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Voeg trypsine toe aan de monsters in verhouding van 1:25 w/w tot het eiwitgehalte. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg 10% mierenzuuroplossing (FA) in MS-water met een verhouding van 1:10 v/v toe aan elk monster en controleer het monster. Controleer of de pH <3) vóór de C18-opruiming is en voeg indien nodig meer mierenzuur toe.</li>
		<li>Voeg aan elk monster en elke controle 0,5 μL van de zware peptidestandaard toe die in rubriek 1 is gemaakt.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptide opruimen
	<ol>
<li>Verschillende fabrikanten bieden C18 opruimtips of platen aan. Volg de instructies van de fabrikant voor het gebruikte product en droog geëuteerde peptiden in een vacuümcentrifuge, klaar voor MS-analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse door LC-MS/MS
<ol><li>Voer de eerste PRM-analyse uit op de zware peptidestandaard op een ongeplande manier.<ol>
<li>Resuspend de gedroogde monsters in 10 μL MS-belastingsbuffer 2% ACN/0,05% trifluorazijnzuur (TFA).</li>
		<li>Rust een HPLC uit met een omgekeerde fase C18 analytische kolom (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 kralen) ontworpen voor nanoflow MS. Vorm lineaire gradiënten die MS-grade water uitwisselen aangevuld met 0,1% FA met ACN met 0,1% FA. Hier werd een opofferende valkolom (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 kralen) gebruikt om de levensduur van de analytische kolom te behouden, maar is niet vereist.</li>
		<li>Koppel de output van de analytische kolom aan een nano-ESI-bron op een massaspectrometer met hoge resolutie.</li>
		<li>Gebruik een geschikte gerichte proteomics-methode voor de massaspectrometer. Op een Q-Exactive plus een methode met twee experimenten wordt bijvoorbeeld gefietst tussen een Full MS- en een PRM-experiment. Voor het Full MS-experiment werd een resolutie van 120.000 gebruikt met een AGC-doel van 1e6 en 240 ms als maximale IT. Voor het PRM-experiment werd hetzelfde AGC-doel en maximale IT gebruikt met een lagere resolutie van 60.000 en een isolatievenster van 1,2 m/z.</li>
		<li>Injecteer 200 ng van de negatieve controle op de analytische kolom met behulp van de HPLC autosampler. Breng een lineaire gradiënt aan op het monster op de analytische kolom, waardoor de ACN-concentratie van 2-25% over een periode van ~ 45 min. OPMERKING: De 25% ACN-concentratie is lager dan normaal voor proteomica vanwege de lage hydrofiele aard van typische ubiquitin topologie-karakteristieke peptiden. Als andere peptiden moeten worden gekwantificeerd, kan een hogere ACN-concentratie worden gewenst om een goede doelscheiding te bereiken.</li>
		<li>Analyseer de resultaten van de planningsrun zoals beschreven in sectie 4.2 om een geplande opnamelijst te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse van de monsters<ol>
<li>Voer de resterende voor beelden uit zoals beschreven voor de planning in 3.1, afgezien van het gebruik van de geplande opnamelijst die is gemaakt in sectie 4.2. OPMERKING: Na de positieve controle moet een blanco worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er in de volgende monsters geen overdracht van de vorige run wordt gedetecteerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Software analyse
<ol><li>Maak een opnamelijst met de juiste opmaak voor de gebruikte MS. Dit protocol maakte gebruik van de open source software Skyline (versie 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die goed gedocumenteerde ondersteuning en hulp biedt. Er kan een opnamelijst worden gemaakt voor verschillende massaspectrometers met behulp van de exportisolatielijstfaciliteit.<ol>
<li>Open een nieuw Skyline-document.</li>
		<li>Selecteer zware isotoopmodificaties, indien van toepassing op zware topologie-karakteristieke peptiden. In Instellingen| Peptide-instellingen onder het tabblad Wijziging, klik op het naamveld om de mogelijke wijziging te zien. Selectie is gebaseerd op de isotopentoestand van de gekochte zware peptiden. In dit voorbeeld werden synthetische peptiden gebruikt die ofwel een zware Lysine (13C615N2-lysine) of een zware Arginine (13C615N4-arginine) aan het C-eindpunt droegen. Passende labels zijn: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" en "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selecteer Instellingen| Overgang. Onder het tabblad Filter staan precursorkosten 2, 3, 4.</li>
		<li>Voeg peptiden in door Bewerken te selecteren| Invoegen| Peptiden.</li>
		<li>Vul de relevante velden in, waaronder de topologie-karakteristieke peptidesequentie en een eiwitnaam (bijv. "Chain–K63").</li>
		<li>Vouw elk peptide uit dat nu wordt weergegeven in het deelvenster Doelen. Ongewenste laadstatussen verwijderen. De voorkeursladingstoestand en botsingsenergie, die kunnen verschillen op basis van de gebruikte massaspectrometer, voor elk topologie-karakteristiek peptide is weergegeven in tabel 1.</li>
		<li>Voor elk topologie-karakteristiek peptide (behalve M1 waar de GG in de reeks is opgenomen) klikt u met de rechtermuisknop op de reeks en selecteert u Wijzigen. Voeg een GG toe als structurele wijziging door op het naamveld te klikken en <Alle... > voordat u "GlyGly (K) "selecteert.</li>
		<li>De isolatielijst Bestand exporteren| Exporteren| Isolatielijst, selecteert u het instrumenttype en stelt u het methodetype in op Standaard. Als u OK selecteert, wordt een prompt geopend om een *.csv bestand op te slaan dat kan worden gebruikt om een PRM-methode te maken.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak een geplande inclusielijst op basis van een zware peptideplanningsrun die hier wordt uitgelegd met behulp van de open source Skyline-software.<ol>
<li>Maak een doellijst zoals beschreven in paragraaf 4.1.</li>
		<li>Importeer de planning in 3.1 door Bestand te selecteren| Importeren| Resultaten.</li>
		<li>Controleer de identificaties. Het zware signaal voor elk peptide is waarneembaar door op de massa voor elke zware peptidevermelding te klikken. De juiste herkenning van de piek wordt vaak automatisch bepaald, maar de software kan handmatige curatie vereisen door de piek te selecteren met klik en sleep onder de x-as.</li>
		<li>Bewaartijden die zijn geselecteerd voor de zware varianten worden ook toegepast op de lichte versies, waardoor een schema voor de PRM wordt gecreëerd. Het planningsvenster kan worden gewijzigd onder Instellingen| Peptide-instellingen met behulp van het tabblad Voorspelling door het tijdvenster tewijzigen.</li>
		<li>Een geplande opnamelijst kan nu worden geëxporteerd met Bestand| Exporteren| Isolatielijst en het selecteren van het juiste instrumenttype en het juiste instellingsmethodetype op Gepland.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de gegevens.<ol>
<li>Importeer de monsters op dezelfde manier als voor de analyse van de planningsrun in punt 4.2.</li>
		<li>Na de volledige invoer van alle monsters wordt curatie van overgangen aanbevolen. Dit is het proces waarbij overgangen met interferentie of slechte signaal-ruisverhoudingen worden verwijderd. Een voorbeeld van een chromatogram voor en na curatie is weergegeven in figuur 4.</li>
		<li>Gegevens kunnen nu worden geëxporteerd door met de rechtermuisknop op relevante grafieken te klikken en Gegevens kopiëren te selecteren of door Bestand te selecteren| Exporteren| Resultaten.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+Destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+structures%2C+functions%2C+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li>
<li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li>
<li>Borràs, E., Sabidó, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+targeted+proteomics%3F+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li>
<li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li>
<li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+%28SRM%29+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Analyse van de alomtegenwoordige toestand binnen een proteoom is van toenemend belang voor een breed scala aan biologische vragen. De beschrijving van de alomtegenwoordigheidstoestand van een monster moet zich niet alleen richten op het profiel van eiwitten die alomtegenwoordig zijn, maar ook op de topologie van een dergelijke alomtegenwoordigheid. De beoordeling van deze topologie door gerichte MS, zoals hier beschreven, speelt een rol in een breed scala aan biologische onderzoeken.
Het moet ...

De nauwe regulering van de eiwitfunctie en -stabiliteit is van het grootste belang, omdat ze belangrijke aanjagers zijn van fenotypische controle van de biologie. De functie van een eiwit is opgebouwd uit twee componenten: de intrinsieke polypeptidesequentie en eventuele posttranslationele modificaties (PTM's). Er zijn verschillende chemische PTM's geïdentificeerd, waaronder glycosylatie, fosforylering, acetylatie en methylatie1. In 1975 identificeerden Goldstein et al.2 een klein eiwit en noemden het alomtegenwoordig vanwege zijn alomtegenwoordige aard. Ubiquitin bleek belangrijk te zijn bij eiwitafbraak3. Sindsdien is echter vastgesteld dat de functie van alomtegenwoordigheid als signaalmolecuul veel verder reikt dan de regulering van eiwitstabiliteit. Ubiquitin-signalering is betrokken bij een breed scala aan andere biologische functies, zoals eiwitstabilisatie, autofagie, celcycluscontrole en eiwithandel4.
Terwijl andere PTM's over het algemeen binair zijn (d.w.z. het eiwit wordt gewijzigd of ongewijzigd gelaten) voor een bepaalde site, kan ubiquitin een eiwit zowel als monomeer als als polymere keten wijzigen, waarbij de bijgevoegde ubiquitin zelf wordt alomtegenwoordig. Verder kan deze polyubiquitinatieketen zich in verschillende topologieën ontwikkelen met de alomtegenwoordigheid van de vorige ubiquitin die zich hecht aan een van de acht koppelingsplaatsen5,6. Ubiquitin wordt overgedragen door een multistep enzymatisch proces (Figuur 1) waarbij het C-eindpunt van ubiquitin is gekoppeld aan een van de zeven lysineresiduen (K06, K11, K27, K29, K33, K48 of K63) of de N-terminal van de vorige ubiquitin (aangeduid als de M1 of lineaire ubiquitinatie)5,6. Deze ketentopologie is de sleutel tot het lot van het eiwit onder modificatie. De modificatie met een K48- of K11-gekoppelde keten leidt bijvoorbeeld tot de afbraak van het gemodificeerde eiwit bij het proteasoom, terwijl een lineaire keten nodig is voor de activering van NF-kB-signalering. De relatieve verdeling van deze ketentopologieën is dus relevant voor een breed scala aan biologische vragen.
Het gebruik van massaspectrometrie (MS) is van bijzonder belang voor de analyse van de ubiquitinketentopologie, omdat het niet afhankelijk is van op antilichamen gebaseerde of op affiniteit gebaseerde interacties7,8, waarvan er vele een beperkte specificiteit hebben en geen onderscheid maken tussen de verschillende ketentypen. Een andere detectiemogelijkheid is het gebruik van genetisch gemodificeerde ubiquitin mutanten. Hier wordt een specifieke lysine ingeruild voor arginine, die de modificatie door ubiquitin niet kan ondersteunen. Het gebrek aan ubiquitin ketenvorming op het substraateiwit wordt vervolgens geïnterpreteerd als bewijs voor een specifieke topologie9.
Ms-gebaseerde identificatie van alomtegenwoordige eiwitten is gebaseerd op het feit dat het C-eindpunt van ubiquitin een arginineresidu in positie 74 bevat dat door trypsine wordt herkend tijdens de proteolytische bereiding van de monsters voor MS-analyse, waarbij de C-terminale dubbele glycine wordt gescheiden. Deze GlyGly (-GG) blijft verbonden met de ε-aminogroep van het lysineresidu van het substraateiwit. Voor ubiquitin topologie analyse, de wijziging vindt plaats op een van de zeven lysine residuen van ubiquitin. Hierdoor ontstaat een set van zeven belangrijke peptiden die een lysineresidu bevatten dat wordt gewijzigd door GG, specifiek voor elk van de topologieën (Figuur 2). Bijvoorbeeld, met K06 topologie, de lysine op positie 6 op de aminozuur volgorde zal worden beschermd tegen tryptische spijsvertering met een -GG modificatie van 114 Da toegevoegd aan deze lysine.
Identificatie van specifieke vooraf bepaalde peptiden door MS wordt aangeduid als gerichte proteomics, of meer specifiek, gerichte peptide acquisitie10. Afhankelijk van de prestaties van de gebruikte massaspectrometer zijn twee methoden ontwikkeld. Dit zijn selected reaction monitoring (SRM), ook wel multiple reaction monitoring (MRM) en parallel reaction monitoring (PRM) genoemd. SRM omvat de selectie van overgangen bestaande uit de precursor m/z en het product ion m/z. Omgekeerd vereist PRM alleen de voorloper m/z. Na de selectie wordt een volledige enquêtescan van de productionen uitgevoerd. Dit heeft als voordeel dat vóór de meting geen geschikte productionen voor kwantificering op de specifieke massaspectrometer nodig zijn. Zowel SRM als PRM kunnen, afhankelijk van het instrument, worden ingepland. Planning is de praktijk van het toewijzen van een tijdvenster waarin een bepaald ion zal worden opgenomen voor analyse, omdat peptiden eluting op gedefinieerde retentietijden van het chromatografische systeem. Het verminderen van het aantal ionen dat op een bepaald moment wordt ondervraagd, verhoogt de frequentie van ondervraging van die ionen die op dat moment zijn gepland, waardoor de nauwkeurigheid van de gegevens wordt verbeterd.
Over het algemeen is de toepassing van gerichte proteomica voor alomtegenwoordige topologie hetzelfde als elk ander gericht proteomics-experiment. Twee belangrijke verschillen zijn echter belangrijk: ten eerste moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van alomtegenwoordige ketens. Er zijn meerdere krachtige deubiquitinerende enzymen (DUBs) die snel ketens afbreken bij cellysis. De alomtegenwoordige proteasen vallen in twee categorieën, de thioesterases en metalloproteases. De meeste ubiquitin-hydrolasen zijn thioesterases en dragen een cysteïneresidu in hun actieve centrum. Door dit cysteïneresidu te alkyleren, kunnen ze worden geactiveerd. Als zodanig is het gebruik van ubiquitin stabilisatiebuffers die alkylerende middelen bevatten, zoals N-ethylmaleimide (NEM), en sterk denaturerende chemicaliën, en het gekoeld houden van monsters van vitaal belang voor een succesvolle analyse. Ten tweede, in tegenstelling tot andere gerichte experimenten, is de peptidekeuze vast. In een typisch gericht experiment kan een proteotypisch peptide worden geselecteerd voor goede chromatografische en ionisatieprestaties. Voor sommige topologie-karakteristieke peptiden zoals K48 zijn deze eigenschappen goed, terwijl ze voor anderen minder wenselijk zijn. K33-chromatografie in een typische omgekeerde fase-instelling is bijvoorbeeld slecht vanwege de vorming van een uitgerekt elutieprofiel en de slechte ionisatie-eigenschappen van het K27-peptide verminderen de zichtbaarheid met MS12.
In dit protocol beschrijven we hoe we een alomtegenwoordige topologiebeoordeling van een biologisch monster door PRM kunnen uitvoeren. Voorbeeldgegevens voor de procedure worden gepresenteerd met behulp van een verstoring van het proteasoom met behulp van MG-132-remmerbehandeling in verschillende celtypen.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &mu;Elution C18 plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Beoordeling van het globale profiel van ubiquitin ketentopologieën binnen een proteoom is van belang om een breed scala aan biologische vragen te beantwoorden. Het hier geschetste protocol maakt gebruik van de di-glycine (-GG) modificatie die overblijft na de tryptische vertering van ubiquitin opgenomen in een keten. Door deze topologie-karakteristieke peptiden te kwantificeren kan de relatieve overvloed van elke ubiquitin ketentopologie worden bepaald. De stappen die nodig zijn om deze peptiden te kwantificeren door middel van een experiment voor parallelle reactiemonitoring worden gerapporteerd rekening houdend met de stabilisatie van alomtegenwoordige ketens. Voorbereiding van zware controles, cellyse en spijsvertering worden beschreven, samen met de juiste workflow voor het instellen van massaspectrometers en gegevensanalyse. Een voorbeeld van een dataset met verstoringen in de ubiquitin topologie wordt gepresenteerd, vergezeld van voorbeelden van hoe optimalisatie van het protocol de resultaten kan beïnvloeden. Door de beschreven stappen te volgen, kan een gebruiker een globale beoordeling uitvoeren van het alomtegenwoordige topologielandschap binnen hun biologische context.

Om het gebruik van een ubiquitinketenanalyse door PRM aan te tonen, werden drie cellijnen geselecteerd: een muismelanoomcellijn B16 en de twee gemeenschappelijke menselijke cellijnen A549 (adenocarcinomic alveolaire basale epitheelcellen) en HeLa (baarmoederhalskankercellen). Deze culturen groeiden tot de midexponentiële fase in geschikte media voordat ze vóór de oogst gedurende 4 uur met 0, 10 of 100 mM MG-132 werden behandeld. MG-132 is een proteasoomremmer die de afbraak van met alomtegenwoordige geconjugeerde eiwitte...

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Aangezien verschillende ubiquitine-ketenuitlijningen een breed scala aan biologische effecten hebben, is het begrijpen van veranderingen in hun abundantie relevant voor een grote verscheidenheid aan biologische toestanden. Het toepassen van parallelle reactiebewaking op ubiquitineketenanalyse maakt de specifieke identificatie en kwantificering van de ubiquitineketenuitlijningen mogelijk. In tegenstelling tot typische PRM-experimenten, is de analyse van ubiquitineketenuitlijning beperkt tot specifieke gemodificeerde peptiden, waarvan er vele niet ideaal zijn voor MS-analyse.Visuele demonstratie van deze techniek benadrukt de aanpassingen en de verwachte resultaten die voor deze niet-ideale peptiden worden waargenomen. Begin met het bereiden van een ammoniumbicarbonaat-oplossing, n-ethylmaleïmide-oplossing en ubiquitinestabilisatiebuffer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Resuspendeer het biologische monster in de ubiquitinestabilisatiebuffer en lyseer de cellen met een geschikte methode.Na cellyse centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 18.000 keer G bij vier graden Celsius en breng het supernatant over naar een verse microcentrifugebuis met lage eiwitbinding. Bewaar

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Dit protocol legt uit hoe het effect van genetische variatie geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen op de deubiquitylerende enzymactiviteit kan worden gemeten door recombinante eiwitzuivering te combineren met ubiquitineketensplitsingstesten.

Het meten van enzymatische activiteit van met neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerde deubiquitylerende enzymen via een in vitro ubiquitineketensplitsingstest

Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met sondetechnologieën om de interactie tussen kleine moleculen van de traditionele Chinese geneeskunde en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.

Screening van traditionele Chinese geneeskundige verbindingen op remming van UCHL3-activiteit op basis van moleculaire docking en deubiquitinerende enzymsondetechnologie

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Leer ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring voor proteomics en biochemie. Deze methode identificeert en kwantificeert specifieke ubiquitin-ketentopologieën nauwkeurig.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Meer video's verkennen