LINE-1 MethylatieAnalyse in Mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes

DNA-methylatie is een van de meest bestudeerde epigenetische handtekeningen. Veel kankers worden gekenmerkt door veranderingen in DNA-methylatieniveaus, die worden geassocieerd met afwijkende genexpressie en andere genomische afwijkingen. Lange gestrooide kernelementen zijn repetitieve omslagbare genomische sequenties die normaal gesproken hoge niveaus van methylatie hebben.

Echter, ze worden vaak hypermethylated bij kanker, wat resulteert in hun activering en leidt tot chromosomale instabiliteit. In deze studie behandelden we mesenchymale stamcellen met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire vesicles om te zien of kanker-EV's LINE-1-methylatie in MEC's kunnen beïnvloeden. Foetaal runderserum, dat een integraal onderdeel is van media voor de celkweek van zoogdieren, bevat een groot aantal ev's die van runderen zijn afgeleid.

Deze EV's zullen interfereren met de analyse van EV's uit cellen van ons belang, daarom is het bij het kweken van cellen voor EV-isolatie belangrijk om EV-uitgeputte FBS te gebruiken. Neem FBS in ultracentrifugebuizen en plaats ze in ultracentrifugemmers. Breng de emmers in balans tot binnen 10 milligram van elkaar voordat ze op een slingerende rotor worden geladen.

Plaats de rotor in de ultracentrifuge en ren op 100,000 G gedurende 19 uur op vier graden Celsius. Verzamel na de run voorzichtig de lichtgekleurde bovenste laag van de supernatant en breng deze over naar een buis van 50 milliliter. Stoor de donkerbruine pellet niet, want deze bevat EV's van FBS.

Geef de supernatant door een 0,22 micron filter in een nieuwe 50 milliliter buis. Deze filter-gesteriliseerde, EV-uitgeputte FBS kan nu worden toegevoegd aan celkweek media bij het kweken van cellen voor EV isolatie. Verzamel geconditioneerde media van osteosarcoomcellen gekweekt in EV-uitgeputte media.

Om cellen en celpuin te verwijderen, centrifugeren de geconditioneerde media op 2500 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over op ultracentrifugebuizen en breng ze in balans zoals eerder. Centrifugeren de buizen op 100,000 G gedurende twee uur op vier graden Celsius.

Gooi voorzichtig de supernatant verlaten ongeveer een milliliter aan de onderkant. Voeg ongeveer 20 milliliter PBS toe aan de buis en pipet voorzichtig om de EV-pellet te wassen en opnieuw op te schorten. Breng de buizen in balans en voer nog een ronde ultracentrifugatie uit met dezelfde instellingen.

Verwijder voorzichtig de supernatant en hang de EV-pellet opnieuw op in 200 microliter PBS door zachte pipetting. Bewaar de EV's in laagbandige buizen. Gezuiverde EV's worden gekenmerkt door westerse blotting, nanodeeltjes tracking analyse, en transmissie elektronen microscopie.

Plaat 15.000 MSCs per put in een 24 putplaat. Na 24 uur, verwijder oude media, was de cellen met PBS, en over te schakelen naar EV-uitgeputte media. Behandel cellen met OS-EV's op de geplande tijdstippen.

Na het stoppen van de EV-behandeling, extract DNA uit de cellen met behulp van een geschikte methode. Voor methylatieanalyse gebruikten we een op maat gemaakte methylatiespecifieke sondeversterkingsmethode. Ontwerp de aangepaste LINE-1 sondes, zoals eerder gedaan, door Pavicic en anderen.

Selecteer voor methylatiesondes drie sequenties met de HhaI-beperkingsplaats binnen het promotorgebied. Voor controlesondes selecteert u zeven sequenties die de HhaI-beperkingsplaats missen uit de rest van de LINE-1-reeks. Verdun 70 nanogram DNA-monster in TE-buffer tot vijf microliter.

Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius en koel af tot 25 graden Celsius. Voeg drie microliters van sonde hybridisatie mix aan elk monster en voer de thermocycler om de sondes te hybridiseren naar DNA. Voeg bij kamertemperatuur 30 microliter post-hybridisatiemix toe aan elk monster.

Breng 10 microliter naar een tweede buis. Plaats beide sets buizen in de thermocycler en incubeer op 48 graden Celsius gedurende ten minste een minuut. Terwijl de monsters zijn op 48 graden Celsius, voeg 10 microliter van ligatie mix aan de eerste set van buizen en 10 microliters van ligatie-spijsvertering mix aan de tweede set van buizen.

Voer het volgende thermocylcer programma uit. Draai vervolgens de buizen naar beneden en stel tegelijkertijd de thermocycler in op 72 graden Celsius. Voeg vijf microliter polymerase mix toe aan elke buis en plaats de buizen in de thermocycler.

Voer het PCR-programma uit. Terwijl het PCR-programma wordt uitgevoerd, bereidt u een oplossing voor van één milliliter formamide met 2,5 microliter groottestandaard. Pipet 10 microliter van deze oplossing aan elke rij van een optische 96 putplaat.

Verdun na PCR de onverteerde en verteerde monsters tot respectievelijk één tot honderd en één tot tweehonderd, respectievelijk in ultrazuiver water. Voeg twee microliters van verdund PCR product aan de 96 put plaat. Centrifugeren de plaat op 200 G gedurende 15 tot 20 seconden om luchtbellen te verwijderen.

Uitvoeren fragment analyse van monsters door capillaire elektroforese. Open de capillaire elektroforese resulteert in een elektroferogram analyse software. Selecteer een voorbeeld en stel het deelvenster in op MLPA in het menu.

Klik op het paneel en druk op control D om deze instelling toe te passen op alle monsters. Stel op een vergelijkbare manier de analysemethode in op microsatellietstandaard voor alle monsters. Selecteer alle voorbeelden en klik op de groene afspeelknop om analyse uit te voeren, selecteer vervolgens alle monsters en klik op de grafiekknop om de sondepieppen te visualiseren.

Zoom in op het piekgebied voor een hogere resolutie van de afzonderlijke pieken. Zorg ervoor dat alle 10 pieken die overeenkomen met de sondes van de LINE-1 sonde mix zijn gelabeld. Exporteer de resultaten op het tabblad genotypen in de CSV-indeling.

Open het CSV-bestand in een software voor gegevensanalyse en sorteer de gegevens in kolommen. Label de drie methylatie site pieken op basis van hun maten. De resterende zeven pieken komen overeen met de controlesondes.

Hier gebruiken we de LINE-1 2M sonde pieken die een grootte van ongeveer 117 basisparen hebben. Bereken voor elk monster het sompiekgebied van alle zeven controlepieken. Verdeel het piekgebied van elke LINE-1 sonde door deze som.

Verdeel voor elk monster de waarde van het verteerde monster door die van het onverteerd monster om de methylatiedosatleerverhouding te verkrijgen. Westerse blotting analyse bevestigde de aanwezigheid van OS-EV's met signalen waargenomen voor TSG101, HSP70, en CD63. Afwezigheid van calnexin signaal aangegeven dat de EV monster zuiver was.

Aanvullende indicatie van zuiverheid werd waargenomen met TEM met intacte piepjes van verschillende grootte aanwezig in het OS-EV monster. De OS-EV deeltjesconcentratie en grootteverdeling werd gemeten door NTA. 80% van de EV's waren in het bereik van 50 tot 200 nanometer.

Hier kunnen we de methylatie doseringsverhoudingen van LINE-1 van MSCs op verschillende tijdstippen van de EV-behandeling zien. De grijze lijn vertegenwoordigt het methylatieniveau van de basislijn vanaf tijdpunt nul. Op tijdpunt drie is er een afname van de gemiddelde methylatiedoseringsverhouding na toediening van EV's, wat wijst op hypermethylatie.

Dit hypermethyleende effect van de EV's is minder uitgesproken op tijdpunt zeven. Hier hebben we een eenvoudige, zeer gevoelige en robuuste techniek voor methylatieanalyse laten zien. Het vereist een lage hoeveelheid DNA zonder bisulfite conversie betrokken en het is ook geschikt voor DNA geïsoleerd van paraffine-embedded monsters.

De hele methode, met de experimentele en analytische onderdelen, duurt ongeveer twee dagen. Door een hoog exemplaaraantal LINE-1 in het genoom is de uitgangsmethylatie van LINE-1 hoog in normale monsters. Daarom kunnen de verschillen in methylatieniveaus van monsters, zoals waargenomen met deze methode, subtiel zijn.