3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

3D multicolor DNA FISH maakt het mogelijk om meerdere genomische loci binnen bewaarde kernen te visualiseren om hun wederzijdse interactie en lokalisatie op eencellig niveau te definiëren. 3D multicolor DNA FISH maakt het directe onderzoek van de nucleaire architectuur mogelijk. In het algemeen werkt het in combinatie met op chromosoom vastgelegde technologieën die de techniek een beschikbaar hulpmiddel maken voor C-gegevensvalidatie binnen enkele cellen.

Het aantonen van de procedure zal Federica Marasca zijn. Ze is postdoc in mijn laboratorium. Begin met het uitbroeden van de nick vertaling mix in een thermische mixer op 16 graden Celsius volgens de lengte van het beginnende DNA-materiaal.

Controleer aan het einde van de incubatie de grootte van de sondes op een 2,2%agarose gel. Voor elk DNA FISH-experiment moet de juiste hoeveelheid sonde worden neergeslagen volgens het uitgangs-DNA-materiaal waaruit de sondes zijn geproduceerd in 150 microliters dubbel gedestilleerd water; 20 microgram ongelabeld zalm sperma DNA, 3,5 microgram soort specifieke Cot-1 DNA, drie volumes van 100% ethanol, en een 1/10e volume van drie molar natriumacetaat gedurende een uur bij min 80 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren het monster op maximale snelheid gedurende een uur op vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, was de pellet twee keer met 500 microliters van 70% ethanol. Na de tweede wasbeurt, resuspend de pellet in twee microliters van 100%formamide en schud de sonde gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius alvorens een gelijk volume van 4x zout natriumcitraat toe te voegen in 20% dextranulfaat. Voor de fixatie voorbehandeling en permeabilisatie van kleine cellen met kleine kernen en een lage hoeveelheid cytoplasma, voeg eerst twee keer 10 aan de zesde cellen in 200 microliters van PBS direct op glaskappen in individuele putten van een 24-put plaat en laat de cellen om zich te vestigen voor 30 minuten bij kamertemperatuur.

Vervang aan het einde van de incubatie snel de PBS door 300 microliter vers bereide 4%paraformaldehyde aangevuld met 0,1%Tween 20. Na 10 minuten was je de vaste cellen drie keer in 300 microliters van 0,05%TPBS gedurende vijf minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, permeabiliseren de T-cellen met 300 microliters van 0,5%TPBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur voor de behandeling van de cellen met 250 microliters per put van RNAse cocktail verdund 1:100 in PBS gedurende een uur op 37 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, spoel de cellen in 300 microliter van PBS en voeg 300 microliters van 20%glycerol in PBS aan elke put met een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, plaats het glas op droog ijs voor 15 tot 30 seconden om de cellen te bevriezen alvorens geleidelijk ontdooien van de monsters bij kamertemperatuur en weken ze in 300 microliters van 20%glycerol in PBS gedurende 30 seconden. Na het bevriezen/ontdooien van de cellen nog drie keer zoals net aangetoond, was de monsters in 300 microliters van 0,5%TPBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in 300 microliter van 0,05%TPBS gedurende vijf minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur.

Behandel de cellen na de laatste wasbeurt gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur met 300 microliter van 0,1 normaal zoutzuur, gevolgd door twee spoelingen in 300 microliter zoutnatriumcitraat. Bevestig vervolgens de monsters 's nachts in 300 microliters van 50% formamide in 2X zout natriumcitraat bij kamertemperatuur. Voor de fixatie, voorbehandeling en permeabilisatie van grote cellen met een hoge hoeveelheid cytoplasma, fix, pre-treat en permeabilize de cellen op dezelfde manier als aangetoond voor menselijke primaire T-cellen en behandelen de monsters met 300 microliter van 0,0025%pepsine in 0,01 normale zoutzuur gedurende een paar seconden tot vijf minuten.

Observeer de cellen onder een optische microscoop en stop de reactie met twee vijf minuten wasbeurten in 300 microliter van 50 millimolar magnesiumchloride zodra de kernen vrij zijn van het cytoplasma, maar de kernen zijn nog steeds zichtbaar en intact. Voor 3D multicolor DNA FISH, denature de hybridisatie sondes op 80 graden Celsius gedurende vijf minuten en onmiddellijk plaats de sondes op ijs. Laad de sondes op een schone microscoopdia en plaats één coverslip van cellen op elke druppel sonde.

Verzegel de randen van de coverslip met rubbercement. Wanneer het cement volledig is gedroogd, denatureren de monsters op een 75 graden Celsius verwarming blok. Na vier minuten, hydridize de monsters op 37 graden Celsius 's nachts in een metalen doos drijvend in een waterbad.

De volgende ochtend, schil het rubbercement en met de glijbanen ondergedompeld in 2X zout natrium citraat voorzichtig til de coverslips. Plaats elke coverslip in individuele putten van een zes-put plaat met twee milliliter verse zout natrium citraat per put voor twee vijf minuten wast op 37 graden Celsius met schudden op 90 omwentelingen per minuut. Spoel de covers aan het einde van de incubatie kort in twee milliliters van 0,2%Tween 20 in 4X zout natriumcitraat.

Voor 3D multicolor DNA FISH detectie, breng de coverslips in individuele putten van een nieuwe 24-well plaat en blokkeer elke niet-specifieke binding in 300 microliters van het blokkeren buffer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 20 omwentelingen per minuut. Behandel de monsters aan het einde van de incubatie met de juiste concentratie anti-digoxigenine en/of streptavidin die gedurende 35 minuten in een donkere en natte kamer bij 37 graden Celsius wordt verdund in een blokkeerbuffer. Breng aan het einde van de incubatie de monsters over op afzonderlijke putten van een zesputige plaat en was de monsters drie keer in twee milliliters van 0,2% Tween 20 en 4X zout natriumcitraat gedurende vijf minuten per wasbeurt met schudden bij 90 omwentelingen per minuut.

Na de laatste wasbeurt, equilibrate de monsters in twee milliliter PBS alvorens de covers over te brengen naar een nieuwe 24-well plaat voor nabevestigen in 300 microliters van 2% formaldehyde in PBS per put gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen vijf keer kort in 300 microliter pbs, gevolgd door vlekken met DAPI verdund op een nanogram per milliliter in 300 microliter PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de covers nog vijf keer in PBS en monteer de monsters met een geschikt montagemedium.

Dan verwerven 3D-beelden met een microscoop systeem. 3D multicolor DNA FISH maakt de hedendaagse visualisatie van verschillende genomische loci binnen bewaarde 3D-kernen mogelijk. Voor dna-sonde voorbereiding, een sonde grootte van minder dan 200 basisparen zorgt voor een succesvolle 3D multicolor DNA FISH procedure.

Suboptimale DNA FISH sondes geproduceerd door nick vertaling kan gedeeltelijk of over verteerd. Over verteerde sondes zal resulteren in een niet-specifiek signaal als gevolg van een verlies van specificiteit in de hybridisatie en een daaruit voortvloeiende toename van de achtergrond. Voor menselijke primaire T-lymfocyten en kleine cellen met kleine kernen en een lage hoeveelheid cytoplasma wordt een normale behandeling van 0,1 minuut 0,1 aanbevolen om de toegankelijkheid van kernen voor de DNA-sondes te bevorderen en de nucleaire integriteit te behouden.

Cytoplasmische pepsine spijsvertering is niet nodig om een DNA FISH goed signaal in kleine cellen te verkrijgen. Voor menselijke primaire myoblasten en cellen met grote kernen en overvloedig cytoplasma is de pepsinisatiestap echter fundamenteel. Een korte en suboptimale cytoskelet pepsinization zal belemmeren de binnenkomst van de sonde in de kernen eindigend bij afwezigheid van een DNA FISH signaal.

Echter, als de cellen zijn meer dan pepsinized, zullen de kernen niet intact blijven verliezen hun 3D-structuur. Een succesvolle 3D multicolor DNA FISH zal resulteren in de aanwezigheid van signaal in de kernen. Ik stel voor om te werken met vers biologisch materiaal, het testen van sondes voor het uitvoeren van de 3D multicolor DNA FISH, het voorbereiden van nieuwe oplossingen en nauwkeurig zijn met incubatietijden en de temperaturen.

Vergeet niet dat formamide en HCL gevaarlijke stoffen zijn en altijd moeten worden gebruikt in een chemische rookkap met geschikte wegwerpmaterialen.